用于结构生物学研究的重组蛋白表达：在HEK 293F悬浮细胞中的一种新颖且易于实现的方法

以下视频的总体目标是展示一种简单且经济的方法，利用哺乳动物表达系统高效获得大量蛋白质或蛋白质复合物。该方法首先在加湿的摇床培养箱中悬浮培养HEK 293F细胞，并维持5%二氧化碳的气体环境；第二步，利用一种或多种高拷贝数表达质粒对细胞进行瞬时转染。

使用转染试剂聚乙烯亚胺（polyethylene EIN 或 PEI），细胞在收获前培养 48 小时。随后利用亲和树脂进行蛋白质纯化，再通过凝胶过滤进一步纯化目标蛋白质复合物，以开展结构与功能研究。最终，这种经济且简便的哺乳动物表达系统能够实现那些在细菌细胞中难以表达的蛋白质及蛋白质复合物的表达与纯化。

该方法的主要优势在于表达蛋白质复合物时具有操作简便和高度灵活的特点。其操作难度几乎与在细菌中表达蛋白质相当，尤其得益于可任意组合搭配不同的蛋白质表达载体。该方法可先在小规模体系中用于检测蛋白质复合物的表达情况，并可轻松放大以获得足量的蛋白质复合物，用于结构与功能研究。成功的关键在于保持细胞处于健康状态，避免细菌或酵母污染。

由于培养基中的抗生素会显著降低蛋白产量。首先，从液氮中取出一支含有1毫升密度为每毫升2000万个细胞的HEK 293F细胞的冻存管，在37摄氏度水浴中快速解冻。通过反复吹打数次以分散任何细胞团块，并将全部内容物转移至含有34毫升预温培养基的250毫升锥形细胞培养瓶中。

48小时后，将培养物置于加湿的轨道摇床培养箱中，在37摄氏度、120转/分钟和5%二氧化碳条件下培养。用台盼蓝检测细胞活力。此阶段正常细胞活力约为70%，此时细胞密度约为每毫升100万个细胞。

将细胞轻轻吹打混匀，调整至终浓度为每毫升0.35×10⁶个细胞，接种于含有60毫升预温培养基的250毫升锥形细胞培养瓶中。此后每48小时或当细胞密度达到约每毫升2×10⁶个细胞时，继续轻柔吹打混匀细胞。图中显示的是处于每毫升2.3×10⁶个细胞密度的台盼蓝染色HEK293F细胞样本，该细胞储备液已准备用于转染接种。细胞应仅以单个或分裂中的细胞形式存在。若细胞过度生长，则会形成大的细胞团块，且活力显著降低，如本图所示。

如果细胞形成团块，可通过剧烈涡旋振荡25秒将其分散。开始大规模培养时，将细胞以每毫升50万个细胞的密度接种至1升滚瓶中，每瓶终体积为300毫升。在37°C、5%二氧化碳、135 RPM的湿润化轨道摇床中培养24小时，直至细胞密度达到每毫升100万个细胞。

接下来，将总共300微克经滤膜除菌的DNA用移液器加入30毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，剧烈涡旋振荡3秒。然后向PB SDNA溶液中加入1.2毫升浓度为0.5毫克/毫升的滤膜除菌PEI，再剧烈涡旋振荡3秒。

将混合物在室温下孵育20分钟，然后按照共转染步骤将其加入细胞中。转染后，将细胞置于加湿的轨道摇床培养箱中，在37摄氏度、135转/分钟和5%二氧化碳条件下继续培养48小时。培养48小时后，通过在3000 × g 离心5分钟收集细胞内蛋白。

如果细胞沉淀不立即使用，可保存在负80摄氏度。本方案针对从细胞核中纯化蛋白复合物进行了优化，其中一种蛋白带有Flag标签。开始纯化时，将细胞沉淀重悬于每升培养物约40毫升预冷的裂解缓冲液中，通过反复吹打数次并结合玻璃匀浆器处理，随后进行超声处理，共三个循环，每个循环15秒开启、15秒关闭。

然后在4°C条件下，以108,000 × g离心25分钟，保留上清液。接下来，每升培养物使用1.2毫升Anti-Flag偶联琼脂糖树脂，用树脂平衡缓冲液洗涤三次进行平衡。将上清液（代表全细胞提取物）与亲和树脂在一支或多支50毫升离心管中混合，于4°C轻轻旋转孵育30至120分钟。孵育结束后，在4°C条件下以3000 × g离心1分钟。弃去上清液后，将树脂转移至15毫升离心管中，用总共45毫升预冷的缓冲液洗涤，每次洗涤前均需离心，然后弃去上清液。依次使用高盐缓冲液、低盐缓冲液和TEV裂解缓冲液重复洗涤和离心步骤。

确保每次洗涤足以完全重悬树脂即可，不宜过长。接下来，取10微升树脂样品，加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液进行稀释，用于分析，以代表结合的蛋白样品。不要使用还原剂，因为它们会将抗体从树脂上释放下来。

然后将树脂重悬于10毫升预冷的TEV切割缓冲液中，每升原始培养物加入约40微克TEV蛋白酶，通过反复倒置离心管数次混匀。TEV蛋白酶的用量可根据表达蛋白的量进行优化。用100%氮气置换管内空气，以防止蛋白氧化，随后在4摄氏度下轻轻旋转过夜，次日进行后续操作。

将样品在3000 × g条件下离心10分钟，然后将上清液转移至具有适当分子量截断值的超滤离心管中，浓缩至500 µL。取10 µL浓缩后的蛋白质样品，加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液进行稀释，用于分析。此样品代表TEV洗脱组分。

然后取10 µL树脂样品，加入等体积的2倍蛋白上样缓冲液进行稀释。此样品代表TEV酶切后的树脂样品。下一步是将蛋白通过凝胶过滤层析柱，应根据目标复合物的大小选择合适的凝胶过滤介质。

本实验中，我们使用了一根10 × 300 毫米的S-200凝胶过滤层析柱，并用凝胶过滤缓冲液平衡该层析柱。将蛋白溶液经0.22微米滤膜过滤后上样至层析柱，随后收集从层析柱流出的各组分。

最后一步，对收集的样品以及凝胶过滤组分、组蛋白去乙酰化酶 SIR2 相关蛋白 1（HD1）、缺陷型沉默抑制因子 3（SDS3）和 SIN3A 的 HDAC 相互作用结构域（SIN3A-HID）进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。通过 SDS-PAGE 可观察到 TUNY 复合物的亲和纯化结果。图中显示的是通过共转染两升细胞所获得的纯化复合物。

结合蛋白条带显示了与亲和树脂结合的复合物。经过TEV酶切后，sin three A HID上的标签被切除，复合物由此洗脱。此处所示树脂为采用10 × 300毫米S-200凝胶过滤层析柱纯化的蛋白复合物的层析图谱。

请注意，该纯化的复合物在接近空体积处被洗脱，因为它在溶液中形成了二聚体。最后，SDS-PAGE分析显示在凝胶过滤组分中获得了纯化的蛋白质。观看本视频后，您应充分掌握如何培养和维持悬浮生长的HEC2和HEC3A细胞，以及如何对目标蛋白质进行亲和纯化和浓缩。

复杂的健康细胞对于实验的成功至关重要，因此务必确保细胞在其适宜条件下培养并定期传代。不要被组织培养所困扰。结构生物学家很容易从哺乳动物细胞中表达并纯化大量蛋白质及蛋白质复合物。