一个 体外 用于研究异染性脑白质营养不良细胞病理生理学的模型

本实验的总体目标是展示在毒素环素存在下，小胶质细胞独特转化为GLO细胞的过程。该过程首先通过用细胞外基质蛋白包被盖玻片来实现。第二步，将胶质细胞接种到盖玻片上，随后向培养物中加入环素和乳胶微珠。

最后一步中，细胞通过免疫化学染色进行处理。最终，可通过免疫荧光显微镜评估周期蛋白对小胶质细胞成核及吞噬能力的影响。该技术相较于现有方法（如使用小胶质细胞系）的主要优势在于，原代胶质细胞培养能够模拟假定的星形胶质细胞 I 型与小胶质细胞在患有 GLO 缺陷细胞脑白质营养不良或 GLD 个体脑组织中的相互作用。演示该实验流程的是我实验室的研究生 KO Claycomb。

为制备包被细胞外基质（ECM）的盖玻片，首先将圆形盖玻片置于无菌培养皿中，用无菌盐酸浸泡。30分钟后，用无菌水洗涤盖玻片三次，然后将其浸入95%乙醇中至少20分钟。待盖玻片自然晾干后，取150至250 µL稀释后的ECM蛋白包被溶液滴加在一张聚甲醛膜片上，均匀分布液滴，以便放置盖玻片时不会相互重叠。

接下来，使用镊子将盖玻片轻轻放置在每个液滴上，然后将标本置于细胞培养罩内，并关闭挡板。4至6小时后，将盖玻片的细胞外基质（ECM）包被面朝上转移至24孔板的各个孔中。随后用无菌PBS洗涤每个孔3次，并将盖玻片置于4摄氏度保存。为准备将胶质细胞接种到盖玻片上，需从胶质细胞培养物中吸除培养基，然后用10毫升无菌PBS轻柔地洗涤单层细胞3次。

用八到十毫升胰蛋白酶EDTA消化细胞，作用时间为五到十分钟。在37摄氏度条件下，向培养瓶中加入20毫升完全培养基以终止反应。然后将细胞悬液转移至50毫升锥形管中，离心10分钟以沉淀细胞。

在 300 G 和室温条件下，使用 P1000 移液器将腭部组织轻轻重悬于 2 毫升新鲜的完全培养基中。计数后，将细胞稀释至约 1 × 10⁵ 个细胞/毫升。随后，将 500 微升细胞悬液接种至每张 ECM 包被的盖玻片上。

向每个孔中加入更多新鲜的完全培养基，然后将培养板在37摄氏度下孵育三至五天。当细胞达到所需的融合度后，向每个孔中加入新配制的环素，并轻轻摇晃培养板以混匀。经过一周的环素处理后，收集培养基，并在室温下用每孔500微升冰冷的4%多聚甲醛固定细胞。

然后用 PBS 每孔洗涤三次，将酶标板置于 4 摄氏度保存。为了通过免疫细胞化学方法观察 GLO 细胞，首先将 PBS 替换为封闭缓冲液，并在室温下孵育细胞。一小时后，在室温下用针对小胶质细胞标志物 IO1 的一抗血清孵育细胞至少一小时，然后用 PBS 每孔洗涤三次，每次五分钟。

将细胞与相应的荧光标记二抗孵育后，用 DAPI 对细胞进行复染以标记细胞核。随后，按照前述方法洗涤细胞，使用封片剂将每张盖玻片封固于独立的载玻片上，并在荧光显微镜下观察载玻片，进行定性和定量分析。为了评估环素处理后但固定前的小胶质细胞的吞噬活性，在固定前向每孔 G OID 细胞培养物中加入 FITC 标记的乳胶微球，具体操作遵循制造商的说明。

48小时后，按照刚刚演示的方法用PFA固定细胞，然后按所示方法进行免疫化学处理。最后，通过荧光显微免疫化学方法，评估与荧光标记微珠共定位的IBO1阳性小胶质细胞数量。使用IO1结合核复染对小胶质细胞进行染色，可识别出体积较大、呈圆形的多核细胞。

请注意，在许多情况下，细胞核的明显增大反映了这些细胞的多核状态，如本图所示。环丝氨酸处理还会引起小胶质细胞的广泛活化，这一点可通过单核小胶质细胞以及多核GLO细胞中PHA酸性活性的增加来测量。如该代表性图像所示，在与少突胶质前体细胞共培养期间，可轻易识别出IBO-1阳性小胶质细胞中具有PHA酸性活性的轮廓。该技术的意义延伸至GLD的治疗领域，因为环丝氨酸处理诱导形成这些多核细胞是GLD神经病理学的一个定义性特征，而这些细胞在该病理过程中的作用此前尚未以这种方式进行过探索。