一在体外模型细胞病理生理学的球细胞脑白质营养不良的研究
October 21st, 2014
球状细胞是克拉伯病的一个决定性病理特征，克拉伯病是一种目前缺乏有效长期治疗的脑白质营养不良。我们开发了一种细胞培养模型来研究活化的小胶质细胞的先天生物学和致病潜力及其向球状细胞的转化。
该程序的总体目标是证明在毒素周期蛋白存在下小胶质细胞向 GLO 细胞的独特转化。这是通过首先用细胞外基质蛋白包被盖玻片来实现的。在第二步中，将神经胶质细胞接种到盖玻片上，然后将细胞周期蛋白和乳胶珠施用于培养物。
在最后一步中，通过免疫化学对细胞进行染色。最终，细胞周期素对小胶质细胞成核和吞噬能力的影响可以通过免疫荧光显微镜评估。与使用小胶质细胞系等现有方法相比，该技术的主要优点是，使用原代神经胶质细胞培养物模拟了 I 星形胶质细胞与患有 GLO 空隙细胞白质细胞营养不良或 GLD 的个体大脑中小胶质细胞之间的假设相互作用，证明该程序将是 KO Claycomb，我实验室的研究生。
为了制备细胞外基质或 ECM 涂层盖玻片，首先用无菌盐酸将圆形盖玻片浸泡在无菌培养皿中。30 分钟后，用无菌水清洗盖玻片 3 次，然后用 95% 乙醇浸泡至少 20 分钟。让盖玻片风干后，将 150 至 250 微升稀释的 ECM 蛋白包被材料液滴添加到一张分布液滴的封盖上，以便盖玻片在放置后不会重叠。
接下来，使用镊子轻轻地将盖玻片放在每个液滴上，然后将封口放在细胞培养罩内，四到六小时后关闭腰带，将盖玻片 ECM 涂层面朝上放入 24 孔板的各个孔中。然后用无菌 PB S3 洗涤每个孔 2 次，并将盖玻片储存在 4 摄氏度。为了准备用于接种到盖玻片上的神经胶质细胞，从神经胶质细胞培养物中吸出培养基，然后用 10 毫升无菌 PBS 轻轻洗涤单层细胞 3 次。
5 至 10 分钟后，用 8 至 10 mL 胰蛋白酶 EDTA 分离细胞。在 37 摄氏度下，向培养瓶中加入 20 毫升完全培养基以终止反应。然后将细胞悬液转移到 50 mL 锥形管中，并离心细胞 10 分钟。
在 300 Gs 和室温下，使用 P 1000 轻轻地将上颚重悬于 2 mL 新鲜、完整的培养基中。计数后，将细胞稀释至每毫升约 10 至 5 个细胞的 1 倍。现在将 500 μL 细胞接种到每个 ECM 涂层盖玻片上。
向每个孔中加入额外的新鲜完全培养基，然后将板在 37 摄氏度下孵育 3 到 5 天。一旦细胞达到所需的汇合度，将新鲜制备的细胞周期蛋白添加到每个孔中，然后轻轻旋转培养板以混合。细胞周期处理一周后，收集培养基并在室温下将细胞固定在每孔 500 微升冷的 4% 对甲醛中。
然后用 PBS 洗涤每个孔 3 次，并将板储存在 4 摄氏度。为了通过免疫细胞化学观察 GLO 细胞，首先用封闭缓冲液替换 PBS，并在室温下孵育细胞。一小时后，将原代抗血清中的细胞与小胶质细胞标志物 IO 1 在室温下孵育至少 1 小时，然后在 PBS 中洗涤每个孔 3 次，每次 5 分钟。
用适当的荧光偶联二抗孵育细胞后，用 DAPI 对细胞进行复染以鉴定细胞核。然后，如刚才所示洗涤细胞后，使用安装介质将每个盖玻片安装到单个显微镜载玻片上，并在荧光显微镜上查看载玻片以进行目视和定量分析。为了评估细胞周期蛋白处理后但固定前细胞周期蛋白处理的小胶质细胞的吞噬活性，根据制造商和说明将 FITC 标记的乳胶珠添加到每个 G OID 细胞培养物中。
48 小时后，如刚才所示，将细胞固定在 PFA 中，然后如图所示处理细胞进行免疫化学。最后，通过荧光显微镜免疫化学评估与荧光标记的珠子共定位的 IBO 一个阳性小胶质细胞的数量。使用 IO one 结合核复染对小胶质细胞进行染色，能够识别大的圆形多核细胞。
请注意，在许多情况下，细胞核大小的总体增大反映了这些细胞的多核状态，如本图所示，细胞周期蛋白治疗还引起了小胶质细胞的广泛激活，这可以通过单核小胶质细胞以及多核 GLO 细胞的 PHA 酸性活性的增加来测量。如该代表性图像所示，在与少突胶质细胞祖细胞共培养过程中，可以很容易地识别 IBO one 阳性小胶质细胞的 PHA 酸性活性谱。该技术的意义延伸到 GLD 的治疗，因为这些多核细胞响应于细胞周期性治疗而形成是 GLD 神经病理学的一个定义特征，并且这些细胞对这种病理学的贡献以前没有以这种方式探索过。
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概述
本研究聚焦于在克拉贝病背景下小胶质细胞转化为球状细胞。通过细胞培养模型，研究探讨了毒素环素对小胶质细胞的影响。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 病理学
背景
- 球状细胞是克拉贝病的关键病理特征。
- 克拉贝病是一种白质营养不良症，目前没有有效的长期治疗方法。
- 活化的小胶质细胞可以转化为球状细胞。
- 理解这种转化对于开发潜在的治疗方法至关重要。
研究目的
- 展示小胶质细胞转化为球状细胞的过程。
- 评估环素对小胶质细胞行为的影响。
- 模拟克拉贝病中星形胶质细胞和小胶质细胞之间的相互作用。
使用的方法
- 用细胞外基质蛋白涂覆载玻片。
- 将胶质细胞接种到载玻片上。
- 向培养物中添加环素和乳胶微珠。
- 使用免疫化学染色细胞以进行评估。
主要结果
- 成功展示了小胶质细胞向球状细胞的转化。
- 评估了环素对细胞核形成和吞噬能力的影响。
- 原代胶质细胞培养提供了细胞相互作用的见解。
- 使用免疫荧光显微镜进行详细分析。
结论
- 该研究为理解克拉贝病病理提供了一种新的方法。
- 研究结果可能为未来的治疗策略提供信息。
- 原代培养优于现有的小胶质细胞系。
常见问题
Executive Industry Relevance
This in vitro model enables mechanistic investigation of globoid cell formation in globoid cell leukodystrophy, addressing a critical gap in disease pathophysiology. By recapitulating microglial multinucleation in response to psychosine, the system supports target validation and de-risking of therapeutic strategies aimed at modulating glial activation. The model provides a reproducible platform for screening compounds that influence globoid cell formation or function, informing early discovery decisions in neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the psychosine-induced microglial transformation pathway relevant to globoid cell pathology.
- Operational Value: Provides a defined system to assess target engagement and biological activity of compounds modulating microglial multinucleation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of quantitative readouts for globoid cell formation and phagocytic function using immunocytochemistry and fluorescent bead uptake.
- Operational Value: Standardized culture and treatment conditions allow for assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of globoid cell contribution to neurodegeneration and potential therapeutic manipulation in a disease-relevant glial system.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of compound effects on microglial phenotype and function prior to in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing mechanistic insights that inform go/no-go decisions in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of glial activation pathways and target validation through controlled induction of globoid cell formation.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantifiable outputs for compound screening and mechanism of action studies.
- Analytics: Generates measurable parameters including multinucleation index, phagocytic activity, and marker expression for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical relevance by modeling a key pathological feature of globoid cell leukodystrophy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable glial culture platform applicable to multiple targets and mechanisms in neuroinflammation and leukodystrophy research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by modeling a defining pathological process of globoid cell leukodystrophy.
- Operational Value: Offers a standardized, scalable primary cell culture system reducing variability associated with immortalized lines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in glial-mediated neurodegeneration.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on globoid cell formation and microglial function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary glial cell culture, extracellular matrix coating, and immunocytochemical staining techniques.
- Dependent on access to psychosine or cycline and fluorescently labeled beads for functional assays.
- Necessitates standardized protocols for cell fixation, staining, and microscopy to ensure reproducible quantification of multinucleation and phagocytosis.
- Adaptation to human glial cells or iPSC-derived models may be needed for translational consistency across species.
- Limited to endpoint analysis unless combined with live-cell imaging for dynamic process monitoring.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Coverslip Preparation
2:37
Globoid Cell Induction in Mixed Glial Cultures
4:30
Analysis and Characterization of Globoid Cells in Primary Culture
6:12
Results: Representative Microglial Cells After Psychosine and Latex Bead Phagocytosis
7:15
Conclusion
