收集，分离，和人类宫颈样品的流式细胞仪分析

该程序的总体目标是使用细胞刷从宫颈内膜刮片中分离宫颈单核细胞。分离后，这些细胞可用于多种检测，包括流式细胞术，您可以在其中确定女性生殖道免疫细胞的表型和功能。细胞刷和宫颈灌洗样本的采集是一种非侵入性程序，必须由妇科医生或训练有素的医生进行。

首先进行宫颈阴道灌洗，用两磨 PBS 清洗宫颈内膜，然后在灌洗后从后穹窿收集。将宫颈刮刀的凹端靠在宫颈上并旋转以对宫颈口或宫颈口进行采样。接下来，将细胞刷插入 Endocervical OS 并旋转 360 度。

使用温和的压力将有助于确保样品没有血液污染。将刮刀中的细胞刷收集到含有 5 密耳 PBS 的试管中。在冰上运输后，样品迅速涡旋以将细胞从细胞刷上解离。

用介质清洗样品后，它们会通过 100 微米的尼龙过滤器进行过滤。这允许从样品中收集淋巴细胞、单核细胞和上皮细胞。细胞现在可以用针对表面蛋白的抗体进行染色，一旦固定，就可以在流式细胞仪上运行。

我们将向您展示我们如何分析结果数据以评估子宫颈存在的 CD 4 和 CD 8 T 细胞群的表型。嗨，我是 Keith Folk 博士实验室的博士生。我们的研究重点是免疫激活与 HIV 易感性以及疾病进展之间的联系。

由于现在大多数 HIV 感染是通过异性发生的，因此我们还对确定保护 HIV 传播到女性生殖道的相关性感兴趣。不幸的是，从生殖道收集样本对研究参与者来说可能非常具有挑战性，而且相当具有侵入性。与活检等其他方案相比，使用细胞刷收集 CMC 或宫颈单核细胞是一种更快、更简单的方法。

在本视频中，我们将向您展示如何分离和制备用于流式细胞术或其他下游应用的 CMC。收集后，将细胞刷和刮刀在 5 密耳的冷 PBS 中运输。重要的是将样品放在冰上运输直到处理时间，处理时间不应超过样品采集后两个小时。

被痕量血液污染的任何样品都应排除在进一步分析之外，以将细胞从细胞刷中解离。将试管高速涡旋 45 秒，因为细胞仍会留在细胞刷和刮刀上。必须手动删除它们。

戴上一双新的手套，用细胞刷从刮刀上刮掉任何残留的材料。丢弃到漂白剂溶液中后，用拇指和食指在猎鹰管上上下挤压，从细胞刷中去除所有剩余的细胞。丢弃细胞刷后，在制备另一个样品之前更换手套，使用移液管用 PBS 清洗试管的侧面，确保收集所有样品。

适合 100 微米尼龙。在新鲜的 Falcon 管上过滤，并使用移液器过滤整个体积的 PBS 溶液。将 5 密耳缺乏 FBS 的 RPMI 培养基添加到原始试管中。

使用移液器彻底清洗试管的侧面，以去除任何粘附的粘液或碎屑。然后通过过滤器传输介质。在丢弃到漂白剂中之前，使用一些过滤介质清洗过滤器底部。

沉淀分离的细胞。将样品在 1500 r pm 离心 10 分钟，以防止沉淀脱落。如果细胞将用于流式细胞术，请记住关闭离心机制动器。

准备防止非特异性抗体结合所需的封闭溶液。在离心步骤中，每个样品使用 100 μL 封闭溶液。封闭溶液包含 93.2 μL 传真、洗涤或 PBS 以及 2% FBS、5 μL FBS 和 1.8 μL 小鼠 IgG。

离心后，大多数具有活细胞的样品都会有一个可见的沉淀。在某些情况下，颗粒会非常大。而在其他样本中，它可能几乎不可见。

沉淀大小并不总是与细胞产量相关。小心地倾斜上清液，确保不会干扰细胞，轻轻搅拌重悬沉淀。用 5 密耳 PBS 洗涤细胞，并在 1500 处重复离心 10 分钟。

断裂的 RRP M 再次倒出上清液并像以前一样重悬沉淀。此时，细胞已准备好在染色前进行冷冻保存或表面染色使用荧光抗体时，通过将细胞与早期离心过程中制备的封闭溶液一起孵育来阻断非特异性结合是有益的。细胞沉淀重悬后，向样品中加入 100 μL 封闭溶液并充分混合。

其余的方案步骤可以在 96 孔板或传真管中进行。取决于 CMC 颗粒的大小。将封闭溶液和细胞混合物转移到传真管中。

将样品在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。在 10 分钟的孵育过程中，准备用于区分活细胞和死细胞的活力染料。在数据分析过程中，根据制造商制备活性染料，并根据需要进行预滴定。

请务必将染料混合物遮光遮光，直到准备好使用。孵育 10 分钟后，用 500 μL 传真洗涤细胞，用 2% FBS 洗涤或 PBS，然后以 1600 RPM 离心 10 分钟。离心后，从传真管中倒出上清液。

通过搅拌重新悬浮细胞。现在添加先前制备的适当体积的活性染料。将细胞在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，确保样品包裹在锡纸中，使其免受光线照射。

在孵育过程中，您可以制备用于标记细胞的荧光抗体预混液。在 CMC 上使用抗体之前，请务必在外周血对照样品上预滴定和验证抗体。混合滴定的抗体，使每个样品的最终体积达到 100 μL。

在这些步骤中，使用传真、洗涤、保护所有抗体免受光线照射。孵育 30 分钟后，再次用 500 μL 传真洗涤样品，洗涤、离心、倾析，并像以前一样重悬细胞。现在是时候将细胞与上次孵育期间制备的 100 μL 抗体混合物一起孵育了。

再次将样品在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，确保它们免受光照。孵育的 CMC 现在可以最后一次用 500 微升 PBS 洗涤。以 1600 RPM 离心样品 10 分钟。

倾析和复苏后，悬浮沉淀，在 1% 石合醛溶液中稀释最终体积为 750 μL 的细胞。为了修复它们，重要的是要重悬如此大体积的细胞，以防止流式细胞仪堵塞。即使在这个体积下，样品管也可能显得相当浑浊。

将细胞置于 4 摄氏度的黑暗中，直到在流式细胞仪上采集。除了细胞刷样品外，我们还定期从子宫颈和阴道收集两密耳的 PBS 灌洗液。该样品以 1400 RPM 离心 7 分钟，以去除灌洗液中的细胞碎片。

然后可以将剩余的上清液分配并在零下 80 摄氏度下冷冻，以备将来分析可溶性蛋白质浓度。该数据与通过流式细胞术获得的细胞表型数据结合使用时特别有用。在运行 CMC 示例之前。

准备 PBMC 对照品以协助设门运行补偿管，使用微珠或单染色池来调整光谱重叠是有帮助的。采集整个 CMC 管以收集与 PBMC 样品相比的所有事件。CMC 将在 FSC 面积与高度图上表现出更多的双峰，并且可能不会表现出像 PBMC 那样独特的淋巴细胞群。

获取样品后，导出文件以在 FlowJo 等程序中进行分析。在这里，我们将展示 CMC 衍生的 CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞的典型设门策略的主要组成部分。在样品中的单粒上使用 FSC 面积与高度图 G 值。

在这个匹配的比较中，您可以清楚地看到与 p BMC 相比，CMC 样品中的双峰数量增加。接下来，绘制荧光标记物或 FSC 与时间的关系图作为质量控制步骤。如果流速的任何变化都会在数据中引入伪影，则可以在此步骤中删除它们。

在顶部，您可以看到随时间变化的一致荧光曲线，表明样品质量高。您可以在下面看到一个具有多个中断和流速的样品，可以将其排除在进一步分析之外。鉴定 CMC 样品中的淋巴细胞群可能具有挑战性。

使用 A-P-B-M-C 控制将有助于步态放置。如您所见，一些样品表现出大量透明细胞群，而其他样品则缺乏淋巴细胞群。总而言之，这些样本应该被排除在外。

尽管我们将专注于淋巴细胞群。也可以通过对缺乏谱系标志物表达的细胞进行门控来对单核细胞进行 g。可以鉴定表达树突状细胞和单核细胞标志物（如 CD 16 和 CD 11 C）组合的细胞，即使在新鲜细胞上，活力标志物或染料的加入对于 CMC 分析也至关重要。

如您所见，大多数 CMC 淋巴细胞是活的，但有些样品含有高频死细胞，必须从分析中排除。死细胞可能会非特异性地吸收抗体并混淆淋巴细胞步态内的数据分析。CD 3 染色应该是稳健的。

与 PBMC 样品相比，CD 3 阳性 T 细胞的比例更低且变化更大，这就是为什么采集整个 CMC 样品并最大限度地增加收集的事件数量至关重要的原因。CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞群可以像在 TBMC 样品中一样被识别。在一些 CMC 样本中。

CD 4 与 CD 8 的比率低于在外周血中观察到的比率，并且一些个体表现出较大的双阴性 T 细胞群。在鉴定出 CD 4 阳性和 CD 8 阳性 T 细胞群后，可以量化许多表型标志物的表达。虽然可以在 CMC 中检测到 CD 1 61 的表达，但在生殖道中不存在血液中明显的 CD 1 61 明亮群体。

同样，可以在 CMC 样品中可靠地测量 CD 69 和 H-L-A-D-R 等活化标志物以及 CCR 5 和 PD 1 等标志物的表达并进行定量。使用细胞刷样本使我们能够表征粘膜免疫细胞的表型和功能，尤其是在传染病的背景下。这不仅让我们更深入地了解调节粘膜和生殖免疫学的机制，还为开发粘膜疫苗功效的新测量提供了基础。