Name: Methylnitrosourea（MNU）诱导的视网膜变性和再生的斑马鱼：组织学和功能特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 了解使用MNU诱导成年斑马鱼视网膜变性与再生的实验方法。通过视动反应测量视觉功能，结合H&E染色、TUNEL和PCNA免疫组化技术评估组织学变化。该模型为研究视网膜退行性疾病及再生机制提供了可靠工具。

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感谢Monika Kilchenmann、Federica Bisignani和Agathe Duda提供的出色技术协助。

所有实验均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》。
1. 动物
<ol>
	<li>在水温为 26.5 °C、光照周期为 14/10 小时（光/暗）的标准条件下，饲养年龄为 6–12 个月的野生型斑马鱼（Danio rerio）AB（俄勒冈）品系15。</li>
	<li>动物实验须经州兽医办公室批准后，遵循相关机构规定的动物护理指南进行。</li>
</ol>
2. MNU 处理
<ol>
	<li>制备含有 150 mg/L 干物质的 N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）水溶液。注意！MNU 有毒，可能致癌、引起遗传性基因损伤或对胎儿造成危害。</li>
	<li>将斑马鱼置于含 MNU 的水溶液中，在室温下孵育 60 分钟。</li>
	<li>用新鲜水快速冲洗斑马鱼，并将其转移至不含 MNU 的新鱼缸中。根据实验需要，在标准条件下长期维持鱼类培养。</li>
</ol>
3. 视力测量
<ol>
	<li>启动视动系统，从菜单中选择“testing”，并将选项设置为“Simple Staircase”、“Acuity (Freq)”和“Randomized/Separate”16。</li>
	<li>将一个装有500 ml水的输液瓶安装在视动系统上方约1米处。</li>
	<li>将一条斑马鱼放入检测室，并将其连接至输液瓶。然后将检测室放入视动系统中。</li>
	<li>开始测量，并在计算机屏幕上实时观察眼球运动。其中，阳性反应（“是”）定义为连续的、方向正确的扫视运动，而阴性反应（“否”）则表现为类似于静止光栅刺激下观察到的随机眼动。如果斑马鱼的眼睛表现出三次或更多次连续的视动反应（OKR），则按“是”；否则按“否”。</li>
	<li>在菜单中的“Results”项下提取视觉敏锐度，该数值由软件通过确定视动刺激的空间频率阈值计算得出。</li>
</ol>
4. 组织学
<ol>
	<li>通过过量的三卡因甲磺酸盐（200–300 mg/L）处死斑马鱼，并摘除眼球。</li>
	<li>在4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）中4 °C条件下固定完整眼球12小时，随后将样品经梯度酒精脱水。</li>
	<li>将样品包埋于石蜡中，在视神经乳头（ONH）部位切取5 µm厚的切片，并将切片贴附于载玻片上。</li>
	<li>用苏木精对脱蜡后的石蜡切片染色4分钟，将载玻片在蒸馏水中浸洗两次，随后依次浸入0.2%盐酸和0.8%氨水。苏木精染色后，在自来水冲洗至少10分钟显色，再用伊红染色3分钟（H&amp;#38;E）。</li>
	<li>将脱水后的切片用封片介质封固，并在光学显微镜下观察。</li>
</ol>
5. 免疫组织化学
<ol>
	<li>末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）
	<ol>
		<li>将脱蜡切片在室温下用 20 µg/ml 蛋白酶K孵育 15 分钟。用Tris缓冲盐水（TBS）洗涤切片三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在湿盒中，将切片与 50 µl TUNEL反应混合液（10%标记液和90%酶液）于 37 °C 孵育 60 分钟。用TBS洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>用含DAPI的封片剂封片，并在荧光显微镜下观察切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>增殖细胞核抗原（PCNA）染色
	<ol>
		<li>将脱蜡切片在抗原修复缓冲液（Tris-EDTA + 0.05% Tween 20，pH 9.0）中煮沸 3 分钟，用TBS洗涤三次，每次 5 分钟。在室温下用 100 µl 封闭液（TBS + 10% 正常山羊血清 + 1% 牛血清白蛋白，pH 7.6）封闭 1 小时。</li>
		<li>在湿盒中，以1:200稀释的抗PCNA一抗于 4 °C 过夜孵育。用TBS + Tween 20洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下用1:500稀释的相应二抗孵育 1 小时完成检测。</li>
		<li>用含DAPI的封片剂封片，并在荧光显微镜下观察切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
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<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
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<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此前，我们的研究团队已将MNU诱导的光感受器变性模型从啮齿类动物成功转移到斑马鱼体系中9。相关后续事件被描述并追踪长达30天。在此期间，初始处理后发生了完全的视网膜形态学变性与再生过程。首先，组织学结果显示，自第3天起视杆细胞数量减少，并在第8天达到最低值。相应地，TUNEL染色显示在MNU处理后第3天出现视杆光感受器的凋亡。再生过程始于第3天的内核层（INL），并在第5天达到高峰。在外核层（ONL）中，可观察到增殖细胞持续至观察期结束，增殖高峰同样出现在第5天。这与内核层不同，在内核层中第15天后未再观察到增殖增加的现象。睫状边缘区是视网膜中唯一在未处理视网膜中亦可发现少量PCNA阳性细胞的区域，表明该区域在整个生命周期中持续存在视网膜神经发生14。本论文并未重点研究参与斑马鱼药理损伤光感受器再生的具体细胞类型。然而，在先前的研究中，该再生过程已被追溯至内核层中具有再生能力的细胞，这些细胞被认为是穆勒细胞（Müller cells）9,17,18。
在本研究中，我们还评估了MNU诱导的斑马鱼模型中的功能变化。为了量...

视觉是人类最重要的感官，其功能受损具有重大的社会经济影响。在发达国家，视网膜变性疾病是老年人视力丧失和失明的首要原因1。大多数视网膜变性疾病的病因仅被部分阐明，且恢复丧失视力的治疗手段极为有限。视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa）是一种典型的以光感受器细胞原发性丢失为特征的视网膜变性疾病2-3。N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）可诱导视网膜变性，因此在啮齿类动物中被广泛用于模拟以光感受器细胞原发性死亡为特征的疾病4。MNU是一种烷化剂，可导致良性和恶性肿瘤，这些肿瘤通常在暴露后数月内出现5-7。此外，MNU在短期内即可引起特异性的光感受器细胞死亡。研究发现，视网膜层结构的丧失和明显的视网膜变薄呈浓度依赖性。视网膜胶质细胞被激活，但未观察到视网膜色素上皮（RPE）发生改变。内质网（ER）应激相关的凋亡似乎是MNU在视网膜中发挥作用的主要通路8。
我们最近引入了MNU作为一种化学模型，用于诱导斑马鱼中的感光细胞变性9。由于多种原因，斑马鱼（Danio rerio）在视觉研究中变得尤为重要，其视觉系统与其他脊椎动物的视觉系统具有相似性10。外层视网膜包含感光细胞，这些细胞可分为四种不同的视锥细胞类型，其峰值敏感波长分别位于紫外、短波、中波和长波可见光谱范围内，此外还有一种视杆感光细胞类型。在内核层（INL）中，可发现双极细胞、水平细胞和无长突细胞等中间神经元的细胞体，以及Müller胶质细胞的胞体。在外丛状层（OPL）中，感光细胞与内层视网膜之间形成突触连接；而最靠近晶状体的细胞层是神经节细胞层（GC），其细胞成分发出长轴突，构成视神经和视束。神经节细胞与内核层细胞之间的突触连接则形成于内丛状层（IPL）11。视网膜色素上皮（RPE）位于神经感觉性视网膜外侧，通过长长的顶端微绒毛包绕感光细胞的外节段12。此外，斑马鱼具有很强的再生能力，能够再生受损的脑组织、视网膜、脊髓、心脏及其他组织13。当视网膜受损时，内核层中的细胞（被认为是Müller细胞）被激活，并具有分化为多种视网膜细胞类型的潜能。此外，这些细胞还能产生位于外核层（ONL）的视杆前体细胞。成年斑马鱼视网膜另一个新细胞来源是睫状边缘区。该来源对于在持续生长的斑马鱼眼球中维持视杆感光细胞的恒定密度至关重要14。
MNU 模型可作为一种简单且可重复的视网膜组织变性/再生研究方法。由于斑马鱼与人类在某些生物学过程上具有相似性，该模型有望为识别参与的细胞死亡通路以及筛选潜在的神经保护药物提供途径。基于我们课题组此前的一项研究，本文现详细阐述MNU诱导的斑马鱼视网膜变性及随后再生模型的实验方法，包括相应的功能变化及配套的实验视频9。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>氨水</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>294993</td><td>0.80%</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako 笔</td><td>Dako, Glostrup, 丹麦</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 封片剂</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, 美国</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>E10521</td><td>Tricaine</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, 瑞士&amp;nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Dako, Glostrup, 丹麦</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>320331</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>原位细胞死亡检测试剂盒</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, 瑞士</td><td>11684795910</td><td>TUNEL 试剂盒</td></tr><tr><td>迈耶苏木精溶液</td><td>Merck, Darmstadt, 德国</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>甲基亚硝基脲（MNU）</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>N4766</td><td>有毒</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics, Lethbridge, AB, 加拿大</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Dako, Glostrup, 丹麦</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>兔抗PCNA&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 美国</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 玻片</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, 德国</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水（TBS）</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>斑马鱼（Danio rerio）AB（俄勒冈）品系</td><td>弗里堡大学，生物学系</td><td>n.a.</td><td>本单位鱼类养殖设施</td></tr></tbody></table>

甲基亚硝基脲诱导的斑马鱼视网膜变性与再生：组织学与功能特征

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

视网膜退行性疾病，例如视网膜色素变性，因其导致的感光细胞损伤，是工业化国家视力丧失的主要原因。动物模型对于研究此类疾病具有关键意义。在此背景下，感光细胞特异性毒素N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）已在啮齿类动物中被广泛用于药理学诱导视网膜退行性变。此前，我们已在斑马鱼——视觉研究中的另一种常用模型系统——中建立了MNU诱导的视网膜退行性变模型。
与哺乳动物不同，成年斑马鱼视网膜具有持续的神经发生能力，并在损伤后能够再生，这一现象十分引人注目。为了量化这一现象，我们采用了成年斑马鱼的视觉敏锐度测量方法。通过检测非麻醉状态下鱼类的视动反射，追踪其功能变化。同时结合组织学分析以及凋亡（TUNEL）和增殖（PCNA）的免疫组织化学染色，以关联发育过程中的形态学变化。
综上所述，光感受器细胞在MNU处理后第3天发生凋亡，随之出现外核层（ONL）细胞数量显著减少。此后，可观察到内核层（INL）和ONL细胞的增殖。本文揭示了在30天的时间过程中，不仅发生了完全的组织学再生，还实现了功能上的恢复。本文通过视频形式展示了利用MNU定量分析并追踪斑马鱼视网膜损伤与再生的方法。

视力：
本研究的实验设置[空间频率：0.042 圆周/度（c/d）；对比度：100%；漂移速度：20 度/秒（d/s）；背光亮度：152 cd/m2]可用于评估成年斑马鱼的视动反应（OKR）。每条斑马鱼的视力测量平均持续约5–10分钟，斑马鱼对该操作耐受良好。MNU暴露前的视觉敏锐度为0.577 ± 0.014 周/度（c/d）。图1显示了应用150 mg/L MNU后视觉敏锐度的变化过程。从第1天开始，测量结果显示视觉敏锐度显著下降，并在第3天达到最低值。从第8天起，视觉敏锐度开始上升，在MNU暴露后30天恢复至基线水平。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Bonferroni多重比较检验。结果显示，在第1、3、5和8天，治疗后的视觉敏锐度与基线相比差异具有统计学意义（p &lt;0.001，每个时间点），而在第15天和第30天则无显著差异。
视网膜变性的组织学评估：
在每个时间点（n...

本文通过在成年斑马鱼中使用 N-甲基-N-亚硝基脲，展示视网膜退化与再生的定量分析及其对视觉功能的影响。视觉敏锐度下降和感光细胞数量减少后，内核层出现细胞增殖。在初次处理后30天，视网膜实现了完全的形态学和功能学再生。

视网膜变性疾病，例如导致感光细胞损伤的视网膜色素变性，是工业国家中视力丧失的主要原因。

本实验的总体目标是利用N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）诱导成年斑马鱼发生视网膜变性及其后续的再生过程。首先将野生型斑马鱼置于含有N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）的水中孵育，随后通过测量视动反应（OKR）并计算不同时间点的视锐度来定量评估视觉功能。处理后，将斑马鱼实施安乐死，取其眼球进行组织学包埋，采用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织学检查，以观察视网膜组织的形态学变化。最后，通过特异性染色标记细胞死亡与增殖，以可视化视网膜中的细胞变化。最终，通过检测视力敏锐度，并对形态学和细胞学变化进行定量分析，以评估视网膜损伤与再生情况。该药理学模型的主要优势在于操作简便、快速，可诱导成年斑马鱼视网膜发生可靠的区域性退变与再生。进行N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）处理时，首先配制含有150毫克/升干粉MNU的水溶液。操作MNU时需格外谨慎，因其具有毒性，可能致癌，引起可遗传的基因损伤，或对未出生的胎儿造成损害。在标准条件下饲养AB品系、6至12月龄的斑马鱼。将斑马鱼转移至MNU水中，在室温下孵育60分钟。然后用新鲜水快速冲洗斑马鱼，再将其转移至不含MNU的新鱼缸中。根据实验需要，在标准条件下长期饲养斑马鱼。通过启动电机系统，准备进行视力测量。然后从菜单中选择测试，并将选项设置为简单阶梯法。在电机系统上方约一米处安装一个装有500毫升水的输液瓶。将一条斑马鱼放入检测室，并连接至输液瓶。然后将检测室置于自动系统中。接着，启动测量并在计算机屏幕上实时观察眼动情况。阳性反应或“是”定义为连续数秒内朝正确方向的眼球运动，而阴性反应或“否”则代表类似于在静止光栅刺激下所观察到的随机眼球运动。若斑马鱼的眼睛表现出三次或更多次连续的视动反应（OKR），请按“是”；否则，请按“否”。在菜单的“结果”部分，提取由软件通过确定视动刺激的空间频率阈值计算出的视力值，以进行组织学分析。根据文本方案实施安乐死后，去除斑马鱼眼球，使用含4%甲醛的PBS溶液在4摄氏度下固定完整眼球12小时，随后采用梯度酒精系列对样本进行脱水，将样本包埋于石蜡中，然后在视神经乳头（ONH）处切取5微米厚的切片，并将切片贴附于载玻片上。接着，用Alam对脱蜡切片染色5分钟，然后将载玻片先后浸入蒸馏水两次，再依次浸入0.2%盐酸和0.8%氨水溶液中。将切片移入自来水中至少10分钟。洗涤后，用乙醇系列对切片进行脱水，随后转入伊红染色3分钟。使用封片剂封片，并用光学显微镜观察样本的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）结果。加入 20 微克/毫升的蛋白酶 K 以去除切片中的石蜡，并在室温下孵育 20 分钟。使用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）洗涤切片三次，每次 5 分钟，随后向切片加入 50 微升 TUNEL 反应混合液，在 37 摄氏度的湿化孵育盒中孵育 60 分钟。待样本经 TBS 洗涤三次、每次 5 分钟后，使用含 DAPI 的封片剂封片，并在荧光显微镜下观察，以进行增殖细胞核抗原（PCNA）染色。将样本置于抗原修复液中，煮沸3分钟，随后用TBS洗涤3次，每次5分钟。使用封闭缓冲液，在室温下孵育样本1小时。然后加入1:200稀释的抗-PCNA一抗，在4°C湿盒中孵育过夜。用含Tween-20的TBS洗涤样本3次，每次5分钟。再使用1:500稀释的二抗，在室温下孵育样本1小时。将载玻片用含有 dpi 的封片剂封片后，在荧光显微镜下观察。该图显示了成年斑马鱼在施用 150 微克/升 MNU 后的视力变化过程。从第 1 天开始，测量结果显示视力显著下降，并在第 3 天达到最低值，随后逐渐回升。在第8天病情继续发展，并在第30天通过斑马鱼眼部视网膜变性的组织学分析观察到完全恢复。在MNU处理后的30天内，观察到内核层（INL）结构紊乱，并从第3天开始出现外核层（ONL）空腔形成，第8天通过TUNEL染色在感光视网膜各层中观察到ONL视杆细胞损失最为显著。观察发现，MNU处理后引起的视网膜变性是由细胞凋亡所致，在第3天时大部分TUNEL阳性细胞位于外核层（ONL）。然而，在同一时间点，内核层（INL）中也观察到了正在死亡的细胞。观看本视频后，您应能充分理解如何通过 m 和 u 处理在成年斑马鱼中诱导视网膜变性，以及如何利用视觉运动反应（OKR）测量和免疫组织化学方法对功能和形态学变化进行定量分析。

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Research

科研

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Biology

生物学

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