从发展胚胎小鼠心脏瓣膜区蛋白分离

该程序的总体目标是从胚胎心脏瓣膜中分离和提取蛋白质。这是通过首先从怀孕的小鼠中分离胚胎来实现的。在第二步中，将心脏从胚胎中解剖出来，然后在最后一步收集心脏瓣膜。

裂解组织并制备所得蛋白质样品用于后续分析。最终，western BLO 分析可用于评估蛋白质表达水平。这种方法的视觉演示至关重要，因为由于发育中的心脏形状小而紧凑，因此很难学习解剖步骤。

在所需的胚胎发育日，使用 70% 乙醇对怀孕女性的腹部进行消毒。然后将下腹部的皮肤和肌肉向上提起，远离内脏器官，解剖打开下腹腔，以便进入子宫角。接下来，用镊子握住子宫颈，小心地切开尖端。

然后提起子宫角，切开任何将子宫角固定在原位的结缔组织，并通过切断子宫角与 uct 的连接处来完成去除。将解剖的子宫角放入含有冷的 0.1 摩尔 tris 缓冲液的培养皿中，并根据需要冲洗。然后切开子宫角。

纵向打开以露出胚胎袋。要暴露胚胎，请在胎盘和胚胎的交界处切开一个胚胎袋，然后切开脐血管以释放胚胎。将解剖的胚胎放入第二个培养皿中，用冷的 0.1 摩尔 tris 缓冲液，然后将第一个培养皿和剩余的未解剖的胚胎放回冰中，直到下一次胚胎解剖。

斩首后，将胚胎仰卧，沿着肋骨侧面垂直切开胸壁，靠近 a 跛行，水平切开横膈膜上方。要观想心脏，请打开胸壁。然后沿着大血管高举起镊子，提起心脏并切割下面的血管。

接下来，在镊子上方切开以释放心脏。如果肺血管仍未切割，则在继续本文描述的胚胎阶段之前，用心脏切除肺，肺动脉略微不透明。确定动脉后，将其切开并移除到瓣膜水平以上。

现在，切开肺动脉瓣正下方，避开 ECD 心室心肌，并从感兴趣区域去除多余的 tris 缓冲液。在将瓣膜放入含有两微升裂解缓冲液（如肺动脉）的 einor 管中之前，主动脉会显得略微不透明。识别后，在主动脉瓣正下方切开。

同样，避免小梁室心肌。去除任何多余的 tri 溶液，然后将瓣膜转移到含有裂解液、缓冲液和肺动脉组织的 einor 管中。收集完所有组织后，立即将样品置于零下 80 摄氏度，直到进一步。

用于蛋白质提取，将收集的组织在冰上解冻，然后在 4 摄氏度下以 13， 100 Gs 的浓度沉淀样品 1 分钟。检查所得样品的体积，并使用裂解缓冲液使总体积达到 40 μL。然后按照制造商的说明，添加 5 毫米不锈钢珠子，以 50 赫兹的频率在 lyr 中破碎和均质化样品 2 到 4 分钟。

均质化后，短暂离心管并将样品转移到新管中，留下不溶性碎片用于进一步的实验分析。使用这种制备技术，可以在 E 13.5 胚胎的单个主动脉瓣区域中检测到磷酸化的 smad 1 5 8。例如，即使从单个瓣膜区域分离的蛋白质也足以检测到微弱的 p smad 带，信号强度与汇集的瓣膜区域的数量成比例增加。

重要的是，由于可用蛋白质水平低，p smad β 肌动蛋白比率在不同样品量中保持明显恒定，相同的印迹不能被剥离并重新探测总 smad。然而，显示总 smad 1 和 β 肌动蛋白的单独印迹表现出相同的表达模式。使用这种制备技术结合来自右心室的样本（心室心肌标志物）时，这些瓣膜区域几乎完全没有污染的心室心肌，NP 在主动脉瓣区域检测不到，而该标志物在心室中很容易检测到。

此外，心室心肌标志物肌球蛋白轻链 2 V 也很容易在心室样本中检测到，但在主动脉瓣区域几乎无法检测到，这强调了该解剖后夹层的精确性。可以执行其他 MES，如 QPCR 或 RN AIC，以回答其他问题，例如在不同的发育步骤中哪些下游基因受到影响。