Name: 在髓系细胞动态实时成像装甲运兵车最小/ +肠道肿瘤通过旋转盘共聚焦显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 了解使用旋转盘共聚焦显微镜对Apc Min/+小鼠肠道肿瘤中的髓系细胞进行活体实时成像的方法。该技术可揭示肿瘤微环境中髓系细胞动态行为，为结直肠癌研究提供重要工具。

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我们感谢Ying Yu提供ApcMin/+小鼠的基因分型。本研究由法国国家健康与医学研究院（INSERM）以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助（CA057621和AI053194）支持。

注意：所有动物实验均按照加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的程序进行。所有成像实验均为非存活操作，动物在图像采集结束后立即被实施安乐死。
1. 小鼠的制备
注意：ApcMin/+ 小鼠携带 Apc 基因的突变，会自发在小肠中形成 50–100 个腺瘤。
<ol>
	<li>将 ApcMin/+ 小鼠与 ACTB-ECFP 品系小鼠杂交，后者在肌动蛋白启动子驱动下表达 ECFP，再与 c-fms-EGFP 品系小鼠杂交，后者在 c-fms 启动子驱动下表达 EGFP，以检测髓系细胞。使用对 ACTB-ECFP 和 c-fms-EGFP 均为杂合的小鼠来检测荧光。</li>
	<li>使用 3–4 月龄的小鼠，以便清晰成像可检测到的腺瘤。</li>
</ol>
2. 手术前材料准备
注意：显微镜设置的详细信息此前已有描述6,7。
<ol>
	<li>显微镜
	<ol>
		<li>打开加热毯。打开用于488 nm激发的氩离子激光器，以及固态405 nm、561 nm和640 nm激光器。依次开启显微镜、转盘控制单元、声光可调滤光器（AOTF）、激光控制单元和相机控制器。</li>
		<li>打开显微镜快门，此时LED灯变为红色。启动计算机和相机软件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像平台
	<ol>
		<li>确保载物台插件清洁。如有污渍，用肥皂和水清洗后彻底干燥。</li>
		<li>取两张盖玻片，使用实验室胶带将其固定在插件上。将插件放置于载物台上，并用酒精擦拭清洁。</li>
		<li>使用实验室胶带将加热毯固定在载物台右侧。</li>
		<li>检查鼻锥上橡胶隔膜的完整性，必要时进行更换。使用纱布和实验室胶带将鼻锥定位并固定，以便向动物输送异氟烷麻醉气体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>异氟烷麻醉系统
	<ol>
		<li>补充异氟烷储液罐。</li>
		<li>打开真空泵，并调节流速至1.2 L/min。</li>
		<li>向雾化器中加入蒸馏水，并将其连接至异氟烷系统。</li>
		<li>打开氧气分析仪并连接至异氟烷系统。打开氧气瓶，确认氧气分析仪显示为100%。将O2流量调节至0.2 L/min。</li>
		<li>打开氮气瓶，并将流量调节至0.8 L/min。确保氧气分析仪显示为21%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术器械与平台准备
	<ol>
		<li>用肥皂和水清洁两把解剖镊子和剪刀。</li>
		<li>打开热珠灭菌器，使其升温至250 °C。将手术器械灭菌30秒，随后冷却。</li>
		<li>在手术台上放置一块吸水垫。</li>
		<li>使用泡沫塑料盖作为手术平台，表面覆盖一块吸水垫。另准备一块吸水垫，用于小鼠剃毛后更换。</li>
		<li>将连接麻醉管路的鼻锥放置在覆盖有吸水垫的泡沫塑料盖上，用胶带将其固定在泡沫塑料盖上（不要固定在吸水垫上），并在鼻锥两侧各插入一根针头以保持其位置稳定。</li>
		<li>准备好聚维酮碘、酒精擦拭片、无菌纱布、医用超级胶水、载玻片、电动剃毛器以及4段实验室胶带。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 注射液的制备
<ol>
	<li>在通风橱内，准备一支胰岛素注射器（28 G × ½ 英寸），其中加入 7 µl 的 AF647 标记 Ly-6G（Gr1）抗体储备液（1 mg/ml），并将其混入 100 µl 的 2,000 kDa 罗丹明-葡聚糖溶液（4 mg/ml）中，用于眶后注射。ApcMin/+ 小鼠建议采用眶后注射，因为这些动物会发展为贫血，导致尾静脉难以通过皮肤观察到。</li>
	<li>另准备一支胰岛素注射器，将 1 mg/kg 的阿托品稀释于 150 µl 磷酸盐缓冲液（PBS）中，用于成像前的皮下（s.c.）注射，以抑制肠道的蠕动运动。</li>
</ol>
4. 成像前肠道的准备
<ol>
	<li>确认通往诱导室的麻醉管路已打开，而通往手术台和显微镜的管路已关闭。</li>
	<li>将动物转移至麻醉诱导室，关闭诱导室盖子，并将异氟烷浓度调至 4%（含 21% O2）。</li>
	<li>当小鼠呼吸深而缓慢时（约 5–6 分钟后），将其侧卧转移至手术台，并经眶后注射 Gr1 抗体溶液和/或葡聚糖溶液。</li>
	<li>打开连接手术平台的麻醉管路，关闭通往麻醉诱导室的管路，将小鼠仰卧固定，鼻部置于麻醉面罩中。</li>
	<li>将异氟烷浓度从 4% 降低至 2.5%。</li>
	<li>通过轻捏足垫并检测角膜反射，确认小鼠已充分麻醉。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼科润滑&#160;软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>使用实验室胶带将小鼠四肢固定于手术台上。</li>
	<li>使用电动剃毛器去除腹部表面的毛发。同时去除左侧后肢的毛发，以便在采集前放置血氧探头。移除手术台上的吸水垫，并更换为干净的垫子，以避免毛发污染。</li>
	<li>使用酒精棉片和碘伏对腹部表面进行消毒。</li>
	<li>将 3.2 步骤中的阿托品溶液在小鼠一侧腹壁皮下（s.c.）注射。</li>
	<li>使用剪刀和一对镊子沿腹中线做约 1 cm 的皮肤和腹膜切口。小心拉出 3–4 cm 肠段，识别一个或多个待成像的肿瘤。</li>
	<li>取一片玻璃载玻片，将带有肿瘤的肠段环置于其上，使肿瘤位于顶部。</li>
	<li>在肠段多个位置滴加少量超级胶水，将其固定于载玻片上。等待一分钟使胶水干燥。使用记号笔在载玻片上画一条线，指向肿瘤位置，以便在共聚焦显微镜下快速定位。</li>
</ol>
5. 将小鼠放置于载物台上并准备图像采集
<ol>
	<li>移除四肢上的实验室胶带。</li>
	<li>打开显微镜载物台的麻醉气体管路，关闭通向手术平台的管路。</li>
	<li>小心将小鼠转移至显微镜载物台，使其腹面朝下，鼻部置于鼻罩中，并用实验室胶带固定麻醉管路。</li>
	<li>调整小鼠或载玻片的位置，使肠道位于盖玻片窗口之一的中心位置。用实验室胶带轻轻固定载玻片。</li>
	<li>将血氧探头连接至小鼠左肢，以监测其心率、呼吸频率及动脉血氧饱和度。</li>
	<li>用加热毯覆盖小鼠，防止低体温。</li>
	<li>将异氟烷浓度从 2.5% 降低至 1–1.5%，以进行成像。</li>
</ol>
6. 使用 µManager 软件采集图像
<ol>
	<li>在配置设置中将 CSUX 速度提高至 2,500 rpm，以提高图像质量。</li>
	<li>使用物镜下拉菜单选择 10X 0.5 NA 或 20X 0.75 NA Fluar 镜头物镜。</li>
	<li>从颜色下拉菜单中选择 405 nm 激光。</li>
	<li>点击“Live”（实时），并通过显微镜调节焦距。</li>
	<li>点击“Auto”（自动），根据图像中的极值像素值自动调整显示图像的最大和最小像素强度。显示图像像素强度的直方图将呈现在主窗口下方的图表中。</li>
	<li>在 Piper 控制面板窗口中，通过更改时钟数（一个时钟为 33.333 毫秒）来调节相机曝光时间。</li>
	<li>如果使用最低曝光时信号过亮，请使用显微镜控制单元降低激光强度。</li>
	<li>检查 488 nm、561 nm 和 640 nm 激光线的信号强度。使用激光器自身的控制单元（488 nm 和 561 nm）或显微镜控制单元调节激光强度。</li>
	<li>在“多维采集”窗口中勾选“时间点”选项，并输入时间点数量和所需的时间间隔。</li>
	<li>勾选“Z-stacks”（Z 层切）选项，选择“相对 Z”，并相对于当前位置定义 Z 起始和 Z 结束位置。 
	注意：对于 10X 或 20X 物镜，建议分别以 3 个 Z 层面、间隔 8 µm 或 4 µm 开始。</li>
	<li>如需对多个位置进行成像，请勾选“Multiple positions (XY)”（多位置 XY）选项，然后点击“Edit position list”（编辑位置列表），标记 4 到 6 个不同位置。</li>
	<li>勾选“Channels”（通道）选项，点击“New”（新建）添加通道，从下拉菜单中选择激光线，并为每个通道输入曝光时间（以 33.333 毫秒的倍数输入）。</li>
	<li>在“多维采集”窗口中勾选“Save images”（保存图像）。</li>
	<li>选择一个文件夹，所有采集的图像将自动保存在此文件夹中，并以指定的名称前缀命名。 
	注意：每次连续采集的数据将被保存在单独的子文件夹中，每个时间点的每种颜色的每个 Z 切片均保存为独立的 tiff 文件。</li>
	<li>点击“多维采集”窗口中的“Save settings”（保存设置）以保存所有设置。</li>
	<li>点击“多维采集”窗口中的“Acquire”（采集）以开始图像采集。</li>
	<li>如果未使用或血氧探头工作异常（脉搏不稳定或难以检测），在成像过程中应每 15 分钟通过捏压足垫并检查角膜反射来评估麻醉效果。若小鼠对这些刺激有反应，则需调整麻醉剂量。</li>
	<li>采集完成后，通过将异氟烷浓度提高至 5% 对小鼠实施安乐死。当无法检测到呼吸运动时，将小鼠从载物台上移除并实施颈椎脱位。</li>
</ol>
7. 使用 Imaris 软件进行图像分析
<ol>
	<li>转换为 .ims 文件（补充图 1A）
	<ol>
		<li>打开相机软件，点击“文件”，然后选择“批量转换器”。</li>
		<li>点击“添加文件”，选择第一个位置的第一个文件。对每个位置重复此操作。</li>
		<li>对于每个上传的文件，点击“设置”，并确认“t”代表时间、“c”代表通道、“z”代表Z轴堆栈，且顺序正确。</li>
		<li>保存到目标文件夹。浏览并创建一个新文件作为已转换文件。</li>
		<li>点击“全部设置”然后点击“开始”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整（补充图 1B）
	<ol>
		<li>进入特定的“已转换”文件夹，打开第一个文件。</li>
		<li>在“显示调整”窗口中，如有必要，通过修改每个通道的“最小值”来调整背景信号截断。&#160;</li>
		<li>如有必要，通过修改“最大值”来调整信号强度（“最大值”越低，信号强度越高）。 
		注意：调整信号强度或对比度有助于突出显示细胞行为或特定区域，以获得更清晰的可视化效果，但不会改变实验结果本身。</li>
		<li>点击“编辑”和“图像属性”。</li>
		<li>修改 x、y 和 z 的数值（使用 10X 物镜时，x 和 y = 0.712，z = 8 µm；使用 20X 物镜时&#160;：x 和 y = 0.36，z = 4 µm）。</li>
		<li>点击“全部等距”以调整时间点。输入采集的开始日期和开始时间，以及结束日期和结束时间（补充图 1C）。</li>
		<li>点击“播放”按钮以观看影片。</li>
		<li>点击“编辑”和“删除时间点”以删除模糊的图像。</li>
		<li>若要将两次独立的采集合并为一部影片，请跳转至第一部影片的最后一个时间点，然后点击“编辑 > 添加时间点”以添加第二个文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存为影片（补充图 1D）
	<ol>
		<li>点击“录制”，选择 .mov 扩展名和压缩因子为 0。</li>
		<li>点击“保存”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本文详细描述了一种在活体动物中对肠道肿瘤内髓系细胞动态进行数小时共聚焦成像的实验方案，成像自肠道浆膜侧进行。
为了避免炎症并维持最佳的生理条件，肠道成像必须在完整器官上进行。然而，从肠道浆膜侧进行成像具有挑战性，因为光线必须穿过平滑肌等多层组织才能到达上皮。在某些区域，聚焦上皮可能较为困难，尤其是在肌动蛋白-ECFP报告小鼠中，因为平滑肌细胞对肌动蛋白的表达水平较高。尽管双光子显微镜相比共聚焦显微镜具有更深的组织穿透能力，但我们发现，转盘共聚焦显微镜已足够强大，能够清晰地显示肠道上皮结构。转盘显微镜的优势包括极快的图像采集速度以及独特的灵敏度，同时不牺牲共聚焦分辨率。这些特性使得即使部分时间点因运动伪影而需剔除，仍可观察动态过程，同时最大限度减少光损伤，并实现对荧光较弱分子的成像。
从浆膜侧对肠道进行成像也具有挑战性，原因在于该器官固有的节律性蠕动运动。在本方案中，一种 皮下 成像前给予阿托品注射，可有效减少肠道蠕动。但需注意，大肠部位的蠕动更为显著，而阿托品对此部位的抑制效果较差，导致该段肠道的成像较为困难...

现有大量证据表明，肿瘤微环境由异质性细胞群体组成，包括成纤维细胞、内皮细胞、免疫和炎症细胞、细胞外基质以及可溶性因子，在实体瘤的发生和进展中发挥关键作用，几乎参与了癌症的所有特征1。事实上，在肿瘤进展过程中，转化的癌细胞与间质细胞之间持续发生动态相互作用，逐渐形成有利于恶性肿瘤发展的微环境2。在浸润肿瘤微环境的免疫细胞中，髓系细胞是最丰富的细胞类型3。髓系细胞包括肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、髓源性抑制细胞（MDSCs）、树突状细胞（DC）和中性粒细胞（PMNs），它们从骨髓中被招募，并逐步浸润肿瘤，释放细胞因子、生长因子和蛋白酶，从而促进肿瘤的生长和扩散4。癌细胞与髓系细胞之间的相互作用复杂而动态。因此，深入理解二者相互作用的本质，对于阐明这些细胞为何促进癌症进展而非参与抗肿瘤免疫反应至关重要，并可能有助于发现新的干预靶点以控制这一过程。
通过活体显微镜直接观察可提供活体小鼠组织内细胞动态的信息5设计了一种四色多区域微透镜旋转盘共聚焦系统，用于研究乳腺肿瘤中的基质细胞6该方法可实现长期连续成像，具有多项优势，包括：（a）快速图像采集以最小化运动伪影，（b）长期麻醉，（c）四色成像以追踪不同类型的细胞，（d）对肿瘤的不同组分进行荧光标记，以及（e）在同一只小鼠体内观察不同的肿瘤微环境，从而避免个体间差异7-9利用该技术，在乳腺肿瘤病毒（MMTV）启动子驱动的多瘤病毒中T抗原（PyMT）模型中已报道了不同的细胞行为，该模型可呈现肿瘤发生的渐进阶段。调节性T淋巴细胞（Tregs，通过以下方式可视化） Foxp3EGFP 转基因细胞）优先迁移至血管附近，而树突状细胞（DCs）则CD11c-DTR-EGFP，癌相关成纤维细胞 (Fsp1+/+-EGFP）和髓系细胞（c-fms-EGFP在急性全身性缺氧条件下，调节性T细胞（Tregs）停止迁移，而髓系细胞则继续移动，表现出与肿瘤内部相比，肿瘤边缘区域细胞具有更高的运动能力。6此外，在相同的鼠类模型中已发现，阿霉素的敏感性随肿瘤分期而变化，药物分布与药物反应相关，且阿霉素治疗可导致依赖CCR2的髓系细胞向肿瘤募集。因此，活体成像也可用于深入研究药物反应 在&#160;原位 以及化疗耐药的生物学机制10,11.
腺瘤性息肉病结肠基因（Apc）突变在人类结直肠腺瘤和癌中常见12 单个拷贝的突变 Apc 基因突变导致家族性腺瘤性息肉病（FAP），该病具有极高的结肠癌发病风险13小鼠品系 Apc分钟/+ 在第850个密码子处携带截短突变的 Apc 基因和小肠各处自发形成多个肠道腺瘤14-16对肠道进行长期活体成像具有挑战性，因为该操作具有侵入性，必须打开腹腔才能暴露肠道。此前已有针对健康肠道的短期活体成像研究发表17,18但尚未见对肠道肿瘤进行长期直接观察的报道。已设计并优化了一种手术方法，可通过肠壁浆膜面利用活体旋转盘显微成像系统观察肿瘤，该系统此前曾用于乳腺肿瘤的成像。6,10在本文中，描述了一种可用于在小肠肿瘤内追踪髓系细胞行为的实验方案。 Apc分钟/+ 小鼠

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Apc&lt;sup&gt;Min/+&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa 葡聚糖，罗丹明标记</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>巴特勒动物健康供应公司</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>氮</td><td>加州大学旧金山分校</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td>加州大学旧金山分校</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水缓冲液</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G（GR1）抗体 AF647</td><td>加州大学旧金山分校单克隆抗体核心实验室</td><td></td><td>储存液 1 mg/ml。使用浓度为 7 &amp;mu;g/小鼠</td></tr><tr><td>阿托品</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>以每公斤小鼠1毫克的剂量使用</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G × 1/2 英寸胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热毯</td><td>盖玛工业公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>使用前开启30分钟</td></tr><tr><td>6 英寸棉签</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>Summit 麻醉支持</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>卡尔·蔡司公司</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>载物台插件</td><td>应用科学仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠Ox血氧仪、软件与传感器</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>雾化器</td><td>Summit 麻醉支持</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;经理</td><td>Vale 实验室，加州大学旧金山分校</td><td></td><td>开源软件</td></tr><tr><td>ICCD 相机</td><td>斯坦福光子学</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦扫描头</td><td>横河电机株式会社</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

使用旋转盘共聚焦显微镜对 apcmin/+ 小肠肿瘤中髓系细胞动态的实时成像

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

髓系细胞是肿瘤内最丰富的免疫细胞，已被证实可促进肿瘤进展。现代活体成像技术能够观察器官内活细胞的行为，但由于某些癌症组织和肿瘤的可及性限制（如肠道），该技术的应用面临挑战。此前尚未有对肠道肿瘤进行直接观察的报道。本文描述了一种手术方法，结合转基因荧光报告小鼠以及可注射示踪剂或抗体，可实现对活体小鼠肠道肿瘤内髓系细胞动态的直接观察。为此，采用了一台四色、多区域、微透镜转盘共聚焦显微镜，该设备支持快速图像采集和长期连续成像。 Apc分钟/+ 在小肠中形成多个腺瘤的小鼠与c-fms-EGFP小鼠杂交以可视化髓系细胞，同时与ACTB-ECFP小鼠杂交以可视化隐窝中的肠上皮细胞。本文还描述了对肿瘤不同组分（如血管和中性粒细胞）进行标记的操作步骤，以及将肿瘤定位以通过浆膜面进行成像的流程。通过数小时成像所生成的时间推移电影，可实现对髓系细胞行为的分析 原位 在肠道微环境中。

通过使用转盘共聚焦显微镜，对小肠中的非肿瘤组织和肿瘤组织进行观察 ApcMin/+;ACTB-ECFP;c-fms-ECFP 从小鼠浆膜面可观察到成像结果。成像完成后，使用相机软件对采集图像进行分析和调整。补充材料 图1）。静脉注射（i.v.) 注射荧光标记的2,000 kDa葡聚糖-罗丹明和Ly-6G 647偶联抗体后，可分别检测到血管和中性粒细胞（PMNs）图1）。派尔集合淋巴结是淋巴组织的聚集结构，富含髓系细胞，易于观察 (图1A）。小肠隐窝周围分布有血管和髓系细胞（图1A 和 1B肿瘤组织通常血管化程度更高，髓系细胞浸润更明显，且隐窝结构的有序性较差（图1A 和 1B) 根据肿瘤大小而定。可使用10X 0.5 NA（图1...

通过使用转基因报告小鼠和可注射的荧光标记物，长期活体旋转盘共聚焦显微镜技术能够直接观察ApcMin/+ 结直肠癌模型中髓系细胞在肠道腺瘤内的行为。

使用旋转盘共聚焦显微镜对 ApcMin/+ 小肠肿瘤中髓系细胞动态的实时成像

髓系细胞是肿瘤内最丰富的免疫细胞，已被证实可促进肿瘤进展。现代活体成像技术……

本实验的总体目标是可视化活体动物肠道肿瘤内髓系细胞的动态变化。首先向PC min小鼠注射荧光分子和阿托品以实现这一目标。第二步，对肠道进行成像前处理，并将小鼠放置在显微镜载物台上。在最后一步中，获取活体动物体内肿瘤的图像，最终采用转盘共聚焦显微镜。该技术可用于在数小时内观察活体PC min小鼠肿瘤中髓系细胞的行为。该方法有助于回答癌症领域的一些关键问题，例如人类细胞在结直肠癌中的作用是什么？首先使用实验室胶带将两张盖玻片固定在显微镜成像平台的载物台插板上。然后将插板放置在载物台上，并用酒精擦拭清洁。接着，将热珠灭菌器调至 250 摄氏度，在工具冷却的同时对手术器械进行 30 秒的灭菌处理。将该泡沫塑料盖置于手术台上的两个实验室吸水垫之间。当小鼠呼吸深而缓慢时，将其侧卧位放置于手术台上，并进行眶后注射。依次注射 DExT 链、rod Domine 和 GR 一抗溶液。注射后，将小鼠翻转至仰卧位，使其鼻部置于麻醉罩内，使用电动剃毛器去除动物腹面及左侧后肢的毛发。毛发去除后，在手术台上放置新的吸水垫以避免毛发污染，然后用酒精棉片和碘伏对动物的腹面进行消毒。接着，在小鼠一侧 flank 皮下注射阿托品溶液，随后使用剪刀和镊子在腹中线处做一个长约1厘米的切口，切开皮肤和腹膜。小心地拉出三到四厘米的肠段，识别出一个或多个待成像的肿瘤。然后将含有目标肿瘤的肠段环置于玻璃显微镜载片上。沿肠段滴加数滴超级胶水，待胶水干燥约一分钟，使肠段固定于载片上；随后用记号笔在载片上画一条指向肿瘤的线，以便在成像过程中准确定位肿瘤位置。现在小心地将小鼠转移至显微镜载物台上，使其腹侧朝下，鼻部置于鼻套中。用实验室胶带固定麻醉管路，然后调整装置位置，使肠道位于其中一个盖玻片窗口的中央。轻轻用胶带固定载玻片，并将血氧饱和度探头连接至小鼠左肢，以监测其心率、呼吸频率及动脉血氧饱和度水平。然后用加热毯覆盖小鼠，以避免低体温，并降低成像时的异氟烷氟浓度。最后，在多维采集窗口中，单击“acquire”以开始采集。采集完成后，视频将通过 Mars 软件进行记录和保存。通过使用转盘共聚焦显微镜，可在静脉注射荧光标记的葡聚糖罗丹明以及与淋巴细胞抗原6复合物基因座G 6 47偶联的抗体后，从小鼠小肠的浆膜面观察非肿瘤性和肿瘤性组织。血管和多形核细胞可分别被检测到。派伊尔结（Peyer's patches）是髓样细胞富集的淋巴组织聚集区域，也可被清晰观察到。小肠隐窝周围分布有血管和髓系细胞。肿瘤组织通常具有更丰富的血管化，并且髓系细胞浸润程度更高，同时隐窝结构的有序性会随着肿瘤体积的增大而降低。平滑肌层表达的肌动蛋白ECFP有时会导致难以清晰聚焦于肠上皮，如本图所示。如本视频所示，可在数小时内实时观察肿瘤中髓系细胞的动态行为，而G1期阳性的中性粒细胞则在血管中循环并巡视周围组织。其他髓系细胞（主要是巨噬细胞）围绕在Crips周围，且形态变化较少。观看本视频后，您应能充分理解如何在活体动物中观察肠道肿瘤内髓系细胞的动态变化。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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