Name: 角膜供体组织准备后弹力层内皮角膜移植术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习后弹力层内皮角膜移植术的组织制备技术，通过部分环钻、染色可视化和360度环形分离实现安全可控的角膜内皮剥离。该方法可提高手术效率并降低组织损耗风险，适用于角膜内皮疾病治疗。

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1. 无菌区域的设置
<ol>
	<li>穿戴适当的防护服装，包括帽子和口罩。进入处理室时需佩戴眼部防护装备。</li>
	<li>准备处理区域。若使用处理室，应持续开启风扇，以在室内维持正压环境。</li>
	<li>准备所有所需物品。检查有效期、包装完整性及灭菌指示剂。</li>
	<li>洗手并佩戴非无菌手套。</li>
	<li>打开无菌器械包以建立无菌区域。若在处理室内操作，将器械包放置于台面，并以无菌方式打开外层包裹。外层包裹边缘1½英寸范围不得作为无菌区域使用，因其被视为非无菌区域。</li>
	<li>采用无菌技术，将无菌物品打开并放入无菌区域内，但预先已包含在无菌包内的物品除外。</li>
	<li>移动显微镜，使其位于无菌区域上方，打开显微镜光源，并根据需要调节目镜。</li>
	<li>获取待剥离的角膜组织（置于保存液中），放置于已准备好的无菌处理区旁。松开观察室盖帽，使其无螺纹连接地放置于观察室底座上。丢弃非无菌手套。</li>
	<li>打开一副无菌手套、无菌手术衣及毛巾。</li>
	<li>执行外科手部消毒。先穿上无菌手术衣，再佩戴无菌手套。</li>
	<li>打开器械盒，确保所有物品易于取用。展开防湿无菌巾以建立操作区域。</li>
	<li>将针头连接至5 cc注射器。使用止血钳，在30 G针头斜面近端1 mm处弯折一次，再于基部近端1 mm处进行第二次弯折，形成“S”形。</li>
	<li>组装台盼蓝染色用玻璃注射器：将活塞插入注射器筒内，并用手指旋紧活塞。连接套管。</li>
	<li>将套管连接至平衡盐溶液（BSS）瓶。</li>
	<li>将角膜环钻从真空固定块上分离并放置一旁。将真空固定块置于显微镜视野中央。</li>
	<li>调节显微镜设置，使真空固定块处于清晰对焦状态。</li>
</ol>
2. 供体组织制备的操作步骤
<ol>
	<li>使用铝箔片作为屏障，掀开观察室的盖子。用另一只手持镊子，轻轻夹住角膜的巩膜边缘以取出角膜。随后重新盖上观察室的盖子。</li>
	<li>完全压下抽吸注射器的活塞，然后将角膜上皮面朝下放置在真空台上，并确保其居中。（图1）</li>
	<li>利用导柱轻轻将定位环放至真空台上。通过缓慢释放抽吸注射器的活塞来启动真空。取下定位环并放置一旁。（图2）</li>
	<li>进行部分角膜环钻，划透后弹力层（Descemet’s膜）。</li>
	<li>调整显微镜的变倍和焦距，使组织清晰可见。</li>
	<li>倾斜真空台，并在角膜缘处使用无菌棉签尖端去除多余的培养基。（图3）</li>
	<li>在角膜缘处滴加适量染色剂，以染色已划痕的后弹力层边缘。让染色剂在内皮表面停留60–90秒。（图4）</li>
	<li>去除染色剂：
	<ol>
		<li>倾斜真空台，将染色剂从角膜表面倒入纱布垫上。</li>
		<li>使用手术尖头工具清除角膜缘区域的多余染色剂，注意避免接触内皮层。（图5）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用数滴BSS冲洗角膜上的染色液，并用无菌棉签尖端去除多余的BSS。（图6）</li>
	<li>在巩膜边缘滴加1–2滴BSS，防止组织干燥。在整个操作过程中根据需要重复此步骤。</li>
	<li>进行后弹力层的部分剥离：
	<ol>
		<li>从连接管与真空台的连接处开始，使用张开的镊子，将一端置于划痕边缘，轻轻将后弹力层和内皮层从基质层分离。（图7）</li>
		<li>将后弹力层和内皮层从划痕边缘分离不超过1 mm，并沿360°方向继续剥离。（图8）</li>
		<li>若发现微小撕裂，可用皮肤标记笔在真空台上对应位置标记一个点。 
		注意：如果环钻未完全穿透后弹力层，可在需要的位置使用预处理的30 G针头斜面完成划痕，必要时再次染色。如果后弹力层黏附性阻碍了部分剥离，可根据需要去除环钻区域外的内皮层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子去除任何重叠在划痕线上的内皮组织残余。</li>
	<li>参考先前标记的微小撕裂位置，旋转真空台，使最大的撕裂位于6点钟方向。该位置将作为瓣膜的铰链。</li>
	<li>使用镊子在12点钟方向夹住后弹力层。通过向铰链方向剥离，轻轻将后弹力层从基质层分离。在距离划痕线2 mm处停止分离，形成铰链。 
	注意：瓣膜的周边边缘在分离过程中会开始卷曲。（图9）</li>
	<li>轻柔地将瓣膜复位至基质层上。使用BSS和棉签尖端展开卷曲的内皮层，并使其恢复至原始位置。（图10A-C）</li>
	<li>使用无菌棉签尖端清除后弹力层与基质层之间的残留液体，以确保瓣膜保持原位。（图11）</li>
	<li>使用无菌棉签尖端吸干铰链附近巩膜上的多余水分。用皮肤标记笔在巩膜边缘画一个箭头，指向铰链中心，并用无菌棉签尖端擦去多余的墨迹。（图12）</li>
	<li>通过按压连接至真空台的注射器活塞释放真空。在真空解除后，使用镊子将角膜从真空台上取下。</li>
	<li>使用铝箔片作为屏障，掀开观察室的盖子。将角膜放入观察室，内皮面朝上，然后重新盖上观察室的盖子。</li>
	<li>如有配对角膜，重复上述操作步骤。处理第二份组织前，使用纱布清洁真空台。</li>
	<li>拧紧观察室的盖子，并将组织移出操作区域。</li>
	<li>按照《生物危害废物管理计划》处置相关物品，拆除无菌区域。脱去污染的手套和防护服，洗手后戴上非无菌手套。</li>
	<li>对角膜（或角膜样本）进行术后裂隙灯评估和角膜内皮显微镜检查，并记录结果。</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez, M., Afshari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Keratoplasty%3A+From+DLEK+to+DMEK%5BTitle%5D)+AND+%22Middle+East+African+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Keratoplasty: From DLEK to DMEK.</a> Middle East African Journal of Ophthalmology. 17 (1), 5-8 (2010).</li>
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<li>Price, F., Price, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+endothelial+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Evolution of endothelial keratoplasty.</a> Cornea. 32, 28-32 (2013).</li>
<li>Dapena, I., Dapena, L., Dirisamer, M., Ham, L., Melles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+endothelial+cell+density+following+Descemet+membrane+endothelial+keratoplasty+%28DMEK%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Soc+Esp+Oftalmol%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and endothelial cell density following Descemet membrane endothelial keratoplasty (DMEK).</a> Arch Soc Esp Oftalmol. 86 (12), 395-401 (2011).</li>
</ol>

Hassan Tausif 和 Navasuja Chandrasekaran 博士无任何利益冲突需要披露。Mian 博士、Shtein 博士和 Woodward 博士担任密歇根眼库的医学总监。Mavin 先生、Titus 先生和 Johnson 女士为中西部眼库的员工。

角膜内皮细胞层通过脱水作用在维持角膜透明性方面发挥关键作用。内皮细胞疾病可导致显著的视力损害。DMEK旨在用供体移植物替代病变的内皮细胞，该移植物包含后弹力层（Descemet’s membrane）和内皮细胞层。供体组织制备过程中保持后弹力层完整并具备足够的内皮细胞数量，对移植物存活至关重要。供体组织制备期间后弹力层撕裂可能导致组织丢失和供体材料浪费。由于移植物制备困难以及手术技术复杂，DMEK的广泛应用受到限制。随着器械的改进以及眼库预先切割组织的可获得性提高，该手术有望成为角膜内皮疾病的标准化治疗方法。
目前供体组织制备的技术包括使用气泡将基质膜（DM）与基质层分离，以促进从供体角膜上移除移植物组织10。DMEK移植物制备中的SCUBA（在背景远离条件下浸没角膜）技术，是指在Optisol或平衡盐溶液（BSS）下获取供体组织，从而降低表面张力并减少撕裂风险11。另一种DMEK移植物制备技术是保留周边的基质环，所得移植物更易于操作和植入12。供体组织也可使用定制的角膜刀进行制备，在用BSS抬起移植物时保留完整的D...

内皮角膜移植术（EK）已迅速取代穿透性角膜移植术（PKP），成为治疗内皮细胞疾病的首选手术方式，2012年在美国开展的所有角膜移植手术中，EK占比超过50%6。PKP存在诸多局限性，包括视力恢复期长、散光程度高、屈光状态不稳定、眼球完整性受损以及缝线相关并发症。早期的EK手术，如深板层内皮角膜移植术（DLEK），需手动剥离角膜基质，并移植部分厚度的供体角膜组织。此类手术虽成功实现了供体内皮组织的移植并保持了角膜表面的完整性，但技术难度较高，且由于角膜板层界面不规则，最佳矫正视力受限1。目前首选的EK手术为后弹力层剥离内皮角膜移植术（DSEK），该术式可保持角膜透明性，实现更快的视力恢复，减少术后屈光误差和散光，降低外伤性切口裂开的风险，同时保留角膜表面完整性7。该手术通过切除病变的后弹力层和内皮层，并以包含新内皮细胞层的部分厚度供体角膜组织进行替代。供体角膜通常使用微型角膜刀进行切割，以制备待移植的后部组织8。眼库对供体组织的预先处理在该手术的快速发展中起到了关键作用，甚至可说是其成功的重要因素。2005年至2012年间，美国DSEK手术数量增长近16倍，与此相应，目前几乎有一半的供体角膜组织由眼库预先制备完成6。
尽管DSEK可将视力提高至20/40或更好，但由于基质界面混浊以及供体基质组织增加导致的光散射增强，大多数患者无法达到20/20视力7。内皮角膜移植术（EK）已发展为仅移植供体后弹力膜（DM）和内皮细胞的后弹力膜内皮角膜移植术（DMEK）。该手术使更多患者达到20/20视力，视力恢复更快，且内皮排斥风险更低9。然而，由于移植物更薄，供体组织的制备更具挑战性。

<table><tbody><tr><td>视觉蓝（VisionBlue）</td><td>D.O.R.C.，祖伊兰，荷兰</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>巴伦真空穿孔器（Barron vacuum punch）</td><td>Katena，丹维尔，新泽西州，美国</td><td>K20-2112</td><td></td></tr></tbody></table>

用于后弹力层内皮角膜移植术的角膜供体组织制备

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

后弹力膜内皮角膜移植术（DMEK）是一种角膜移植形式，仅将单层细胞——角膜内皮细胞及其基底膜（即后弹力膜）——移植到受体角膜的后部基质上3。与后弹力膜剥离自动内皮角膜移植术（DSAEK）不同，DSAEK会额外引入供体基质组织，因而会产生非自然的基质-基质界面；而DMEK不形成此类界面。因此，角膜的自然解剖结构得以最大程度保留，从而促进更快的恢复速度和更高的视觉敏锐度4。内皮角膜移植术（EK）是治疗内皮功能障碍的首选手术方式。EK的优势包括视力快速恢复、保持眼球结构完整性，以及由于采用小的周边切口而引起的屈光变化极小1。DSAEK使用包含部分厚度基质层和内皮层的供体组织。该手术能够迅速获得广泛应用，主要归功于眼库预先切割好的供体组织的可获得性。眼库制备供体组织的优势包括：无需在手术室配备特殊设备，以及在组织制备过程中发生穿孔时可提供备用供体组织。此外，眼库技术人员进行大批量供体组织制备，可能有助于提高供体组织的质量。由于DSAEK在供体与受体角膜之间形成了基质界面，其最佳矫正视力可能受到一定限制。而在DMEK中，仅移植供体的后弹力膜和内皮层，消除了这一界面，可能改善视力预后并减少EK术后并发症5。与DSAEK类似，DMEK的长期成功和临床接受程度也依赖于眼库能否方便地提供预先切割好的供体组织。本文介绍一种逐步进行供体组织制备的方法，可能有助于降低眼库在提供DMEK移植物过程中面临的一些障碍。

在DMEK手术中，正确分离Descemet膜（DM）与内皮层和基质层对于制备预切组织至关重要。本研究使用了50例供体角膜，供体平均年龄为65 ± 6岁（范围55-75岁），死亡至处理时间为5.9 ± 2.3天（范围1-10天），内皮细胞密度（ECD）为2,616 ± 321个细胞/mm2（范围2,049-3,247）。由两名眼库技术人员评估该手术制备技术的可行性与可重复性。前25例的成功率为72%，后25例提高至80%，总体成功率为76%。采用点双列相关（Rpb）分析术前组织因素与成功率之间的相关性。供体年龄（Rpb = 0.18）、死亡至处理时间（Rpb = 0.07）和ECD（Rpb = -0.11）均与组织成功制备无显著相关性。制备后ECD（n = 37）为2,676 ± 284（范围2,041-3,205），与制备前ECD相比无显著差异（p = 0.72）。制备失败的原因包括DM撕裂（10%）和严重细胞丢失（14%）。这些病例还伴有组织重新装片困难以及DM边缘染色不全。
眼库对患者预后的评估为DMEK手术的临床成功及不良事件提供了关键数据，这些信息有助...

内皮角膜移植术是一种不断发展的外科技术，随着技术进步，每一代移植的移植物都变得更薄1。本文介绍一种可控的手动组织分离技术，可安全、可重复地将供体角巩膜瓣中的内皮细胞层和后弹力层分离用于移植2。

后弹力层内皮角膜移植术（DMEK）是一种角膜移植手术，仅移植单层细胞，即角膜内皮层，……

本操作的总体目标是为DMEC植入准备Demas内皮组织。首先进行部分角膜板层切开，并应用染色剂以使其可视化。接着，在S层间质与Demas膜之间的TATed线处，进行360度的不完全分离解剖。然后手动将Descemet膜从基质床剥离，仅保留一小部分铰链连接。最后，将Descemet膜复位至基质床，并清除其间的任何残留液体。最终，使用预切取组织制备的Descemet膜内皮角膜移植术是一种安全且可重复的可控性手动组织分离技术，用于治疗内皮细胞疾病。眼库制备去弹力层角膜内皮移植供体组织的主要优势在于，可降低组织制备过程中丢失的风险，并提高外科医生在手术室内的操作效率。通常情况下，采用该技术的外科医生在初期可能会遇到困难，尤其在部分解剖和后弹力层剥离过程中，难以避免后弹力层撕裂。该技术的视觉化演示至关重要，因为分离步骤难以用语言准确描述，特别是后弹力层与基质层之间成功分离的判断。本次操作演示将由劳伦·约翰逊（Lauren Johnson）进行，她是中西部眼库密歇根实验室组织处理部门的负责人。开始制备德马斯血管内皮组织时，需穿戴适当的防护服装，包括帽子和口罩，并在处理室内佩戴眼部防护装备。首先打开处理室内的风扇以形成正压环境，做好准备工作。用清洗干净的手检查所有物品的保质期、包装完整性和灭菌指示剂，并在佩戴无菌手套的同时，通过无菌方式打开包装，建立无菌操作区域。避免将包裹物外侧一英寸半的区域作为无菌区域的一部分，因为该部分被视为非无菌区域；将无菌物品直接投放到无菌区域内。接下来，将显微镜置于无菌区域上方。打开光源，并根据需要调整目镜，同时获取待剥离的角膜组织。将其放置在已准备好的无菌操作区域旁边。松开观察室的盖子，将其未旋紧地放置在观察室上方，并丢弃非无菌手套。接着打开一副无菌手套、一件无菌手术衣和一条毛巾。在穿上无菌手术衣和无菌手套之前，先进行外科手部消毒。打开器械盒，确保所有用品均可取用，并展开一张防湿透水的手术单以建立工作区域。通过将活塞插入玻璃注射器并用手指拧紧，组装用于三联染色的玻璃注射器。将一根导管连接到台盼蓝注射器，另一根导管连接到平衡盐溶液瓶。将TR精密切割器与真空块分离并放置一旁。然后将真空块置于显微镜视野中央，再调整显微镜设置，使真空块清晰对焦。使用铝箔方块作为屏障，用另一只手借助镊子打开观察室的盖子。用镊子夹住巩膜边缘以从保存液中取出角膜。然后重新盖上观察室的盖子，并完全压下吸力注射器。然后将角膜上皮面朝下放置在真空台上，并确保其居中。利用导向柱，轻轻将 seating ring 放置在真空台上。取下 seating ring，并将其放置一旁，在显微镜下保持组织聚焦且清晰可见。进行部分角膜环钻以划透后弹力层。倾斜真空固定块，并用置于角膜缘的无菌棉签尖端去除多余培养基。接着，在角膜缘处滴加足量染色剂，以染色划痕边缘。将Demas膜置于内皮层，使染料保留60至90秒。然后使用手术尖头器械清除角膜缘区域的多余染料，注意避免触碰内皮，用数滴BSS冲洗。用平衡盐溶液冲洗角膜上的染色液，并使用无菌棉签吸除多余的BSS。然后在巩膜边缘滴加一至两滴BSS，以防止组织干燥。在手术过程中根据需要重复此步骤，使用张开的镊子进行后弹力层的部分解剖：将镊子一端置于刻痕边缘，轻柔地将后弹力层和内皮从基质层分离。分离后弹力层和内皮层，分离位置距离划痕边缘不超过一到两毫米，并沿360度方向继续解剖。若发现微小撕裂，使用皮肤标记笔在真空夹具上标记点位以记录其位置。使用镊子去除任何覆盖划痕线的内皮组织残留。然后找到先前标记的微小撕裂处，旋转真空块，使最大的撕裂位于六点钟位置，此处将作为瓣膜的铰链。接着，使用镊子在十二点钟位置夹住该 SMA 膜。然后轻轻从S层基质剥离，向铰链处撕开。在距离刻痕标记两毫米处停止分离，以形成铰链。将瓣膜轻柔地放回S层基质原位。使用BSS和棉签棒松解内皮层并将其复位至原始位置。清除脱水膜与基质层之间的残留液体，以确保瓣膜保持在原位。吸干铰链附近巩膜上的多余水分。使用皮肤标记笔在巩膜边缘画一个指向铰链中心的箭头，并擦去多余的墨水。在真空未启动的情况下，按压连接至真空块的注射器活塞以释放真空。使用镊子夹取铝箔方块作为屏障，将角膜从真空块上取下。打开观察室的盖子。将角膜内皮面朝上放入观察室内。盖上盖子并拧紧。最后，在将组织从处理区域移除并按照文本方案拆除无菌区域后，对角膜进行术后裂隙灯评估和角膜内皮显微镜检查，并记录检查结果。共使用50例供体角膜评估手术制备技术的可行性和可重复性，供体平均年龄为65±6岁，死亡至处理时间为5.9±2.3天，内皮细胞密度（ECD）为2,616±321个细胞/平方厘米。前25例手术的成功率为72%，后25例提高至80%，总体成功率为76%。采用点序列相关法（RPB）分析术前组织因素与结果的相关性。供体年龄、死亡至处理时间以及内皮细胞密度（ECD）与组织制备的成功与否无显著相关性。制备后的内皮细胞密度为2,676 ± 284，与制备前的ECD相比无显著差异。制备失败的结果主要源于后弹力膜撕裂和严重细胞丢失。这些病例还伴有组织重新安装困难以及 dm Edge iBank 染色不完全的问题。对五名外科医生实施的九例 DEC 手术患者的预后评估显示，其中一例在术后一天和一周时发生脱位，但无需进行气泡视力矫正；术后一天的视力范围从 2,400 到光感，到术后一周改善至 2,103。一旦掌握该技术，此手术最短可在 20 分钟内完成；随着操作熟练，组织离开原始培养环境的时间可缩短至仅 10 分钟。在进行该操作时，重要的是要从年龄超过45岁的供体获取角膜组织，以最大限度地降低后弹力层膜撕裂的风险。在完成该操作后，可进行额外的处理步骤，例如添加定位标记，以标识出膜发育完成后哪一侧为基质侧。该技术为角膜外科医生快速接受DMEC铺平了道路。

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用于后弹力层内皮角膜移植术的角膜供体组织制备

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