的产生肠杆菌 SP。 YSU营养缺陷型使用转座子突变

以下实验的总体目标是产生野生型细菌菌株的 TRO，这些菌株在补充葡萄糖的最低盐培养基中生长。这是通过将 transpo 区转化为野生型宿主菌株以获得插入片段上具有随机转座的大麻霉素抗性细菌群来实现的。接下来通过复制铺板筛选转化体，该板识别在富培养基上生长但无法在最低盐（补充葡萄糖的培养基）上生长的 TRO。

接下来基因组学，来自突变体的 DNA 被消化、连接并转化到大肠杆菌中，以获得含有转座子的质粒，转座子的每一端两侧是中断基因的片段。根据 DNA 测序和基本的局部比对搜索工具分析获得显示中断基因的推定身份的结果表明。该技术中使用的转座子具有复制起点、卡那霉素抗性基因和嵌合末端。

用于转座蛋白结合。它缺乏转座蛋白基因，因此我们必须将这个转座基因与转座子 DNA 片段一起添加，然后将转座 DNA 和蛋白质之间的复合物电穿孔到宿主中。电穿孔的主要优点是无需转导或偶联。

缺乏转座基因通常会产生稳定的插入片段，并且复制起点和 CIN 抗性基因的存在允许轻松识别突变基因，该基因被回收为重组质粒。这种方法可以帮助回答微生物生理学领域的关键问题，例如识别氨基酸、核酸和维生素生物合成所需的基因。当我在肠杆菌属 YSU 中寻找金属抗性基因时，我第一次有了这种方法的想法，并决定将其纳入我正在开发的微生物生理学实验室中，以使用肠杆菌属的过夜培养物电穿孔感受态细胞。

YSU 在新鲜的 LB 培养基中制备 1 至 20 的稀释液，并在 30 摄氏度和 120 RPM 下孵育至 OD 600，介于 0.4 和 0.6 之间。当细胞达到适当的密度时，将它们在冰上冷却 5 分钟，然后在 4 摄氏度和 7， 000 克下离心 5 分钟。弃去上清液，使用等体积的冰冷水进行 Resus。

悬浮细胞，在 4 摄氏度和 7， 000 克下离心 5 分钟。重复洗涤后，弃去上清液，用冰冷水复苏，以等于细胞沉淀体积的体积悬浮细胞。接下来，将 0.5 μL 的 transpo 区添加到 40 μL 的细胞中。

然后将细胞转运区混合物放入冰冷的电穿孔 Vet 中，并将混合物轻敲到 Q Vet 底部，以 25 微phs、200 欧姆和 2.5 kilovolt 电击细胞。立即加入 960 μL 过滤灭菌 SOC 培养基，通过上下移液混合，然后将细胞转移到无菌的 1.5 mL微量离心管中。将细胞在 30 摄氏度和 120 RPM 下孵育 45 至 60 分钟。

然后将 100 微升细胞涂在 LB 罐琼脂平板上，然后在 30 摄氏度下将平板孵育过夜以网格化转化体。将网格粘在 100 x 15 毫米空培养皿的盖子上。在 LB 罐琼脂板的底部画一条线，并使用一小块胶带将其固定在网格盖上，以便通过螺旋钻用无菌牙签可以看到网格。

选择一个转化体并将其定位在网格中一个正方形的中心，在相邻的方格中定位另一个转化体，然后继续直到板装满。然后在 30 摄氏度下孵育过夜。这是每个网格化的板的母板。

堆放三个新的螺旋盘，编号为 1 到 3。LB 罐头的 1 号，M 的 2 号罐头，9 罐头。LB 的 3 号可以在使用前在 37 摄氏度下将板倒置干燥一夜。

如前所述在每个板的顶部画一条线后，使用 70% 乙醇擦拭复制电镀工具，并在其顶部放置一个无菌 veltin 方块，然后再夹紧 veltin 方块。接下来，将主板上的线与夹具上绘制的线对齐，并将板放在 veltin 方块的顶部。轻轻按压，将细菌从板转移到 veltin 方块。

然后将 1 号板上画的线与夹子上的线对齐，并将其放在 veltin 方块的顶部。轻轻按压，将细菌从 veltin 方块转移到板上。取下 1 号板。

将天鹅绒方块丢弃到装有水的烧杯中，然后将干净的无菌天鹅绒方块放在复制电镀工具上。和以前一样，将 1 号板上的线与夹子上的线对齐，并将其放在新的天鹅绒方块的顶部。轻轻按压，将细菌从 1 号板转移到天鹅绒方块上。

取下 1 号板，将 2 号板上画的线与夹子上的线对齐，然后将其放在天鹅绒方块的顶部。轻轻按压将细菌从天鹅绒十方转移到 2 号板，重复 3 号板的过程后取出 2 号板，在 30 摄氏度下孵育板过夜。在两个 LB 罐板上生长但未能在 M 9 板上生长的菌落被认为是宝库。

从 1 号板中选择 TRO，然后在新的 LB 罐板上划线。孵育过夜后，从条纹板中选择三个菌落，第二天将它们划线到新的 LB 罐板上。将新划线板中的菌落点到 LB 罐网格板上，并使用该板重复复制板，如刚才所示。

进行基因拯救。使用分离的突变菌落生长 3 毫升磅。可在 30°C 下过夜培养。

然后使用市售的基因组 DNA 纯化试剂盒，在 20 μL 冰上反应中，从 0.025 单位 BFUC 1 限制性核酸内切酶的 1 mL培养物中纯化 DNA，与 14 μL 每μL 基因组 DNA 的 1 μg 基因组 DNA 纯化 DNA。然后将反应在 37 摄氏度下孵育 25 分钟，然后将其转移到 80 摄氏度中 20 分钟。要灭活酶，请在 0.8% AROS 凝胶上分析 3 微升部分消化的 DNA。

接下来，在 500 μL 反应中将 800 单位的 T four DNA 连接酶添加到 15 μL 部分消化的基因组 DNA 中，并在第二天在 4 摄氏度下孵育反应过夜。加入 50 微升三摩尔乙酸钠 pH 5.5 和 1 毫升 95% 乙醇，在负 20 摄氏度下孵育 20 分钟，沉淀连接的 DNA。在 4 摄氏度和 13， 500 G 下微量离心 DNA 10 分钟。

倒出 supernat 场地，加入 7 个 70% 乙醇清洗颗粒。在离心真空浓缩器中干燥，并使用 10 微升不含核酸酶的水。重悬 DNA 使用 4 微升重悬的 DNA 通过电穿孔转化 e 大肠杆菌菌株，ECD 100 DPIR 或 ECD 100 DPIR 一 16 接种 5 毫升 LB 罐培养基，带有单个菌落。

在 37 摄氏度和 120 RPM 下生长过夜。第二天，从整个培养物中纯化 DNA 后，使用 Joe one 消化 14 微升质粒。在 0.8% agarro 凝胶上分析 10 μL 未消化和消化的质粒。

对质粒进行测序后，搜索序列 5 引物 GA，G-A-C-A-G 3 引物，这是转座的最后 7 个碱基对，后面是中断基因的序列。使用 blast 确定中断基因的可能功能。成功的电穿孔产生了数千个转化体，每个转化体在该图中的插入片段上至少有一个转座。

黑色方块显示在 LB 罐板上生长的两个菌落，而不是在 M 9 最小培养基板上生长。这些 TRO 可能包含参与氨基酸、核酸或维生素合成的基因中断，这些基因都存在于 lb 中，但不存在于 M 9 最小培养基中。其他 86 个菌落在 M 9 上生长所需的基因没有中断。

如图所示，来自分离的 TRO 的最小培养基部分消化的基因组 DNA 大小从 10 kb 以上到 0.5 kb 以下。挽救的质粒由 2 千克碱基转座子和侧翼宿主 DNA 组成。该图显示了从 tro 中分离的质粒的 blast 结果。

中断序列类似于 ate 变位酶的肠杆菌 cloy 基因，由于多个过夜生长步骤，它参与 L 酪氨酸、L 苯丙氨酸和 L 色氨酸的生物合成。如果执行得当，这项技术可以在 10 或 11 天内完成。在复制 pla 时，重要的是要记住不要涂抹板，您可以通过使用干燥的板并且一旦将其放置在 veltin 方块上就不要移动板来防止这种情况。

按照此程序，可以执行其他方法，如克隆或互补实验，以验证已鉴定基因的功能。看完这个视频，你应该对如何使用转座子诱变生成 TRO 以及如何初步鉴定突变基因有了很好的了解。