Name: 的产生肠杆菌 SP。 YSU营养缺陷型使用转座子突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 了解利用转座子诱变技术构建Enterobacter sp. YSU营养缺陷型突变株的完整实验流程。该方法通过电转化和影印平板筛选，结合基因拯救与测序技术，帮助研究者鉴定细菌生长必需基因的功能。

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作者谨向所有在2010年至2014年春季学期期间参与测试我关于转座子诱变构想的本科独立研究学生以及微生物生理学专业的研究生表示感谢。本工作由扬斯敦州立大学生物科学系资助。

1. 感受态细胞的电穿孔5,11
<ol>
	<li>将一株过夜培养的 Enterobacter sp. YSU 1/20 LB 培养物稀释至 50 ml 新鲜 LB 培养基中，在 30 °C、120 rpm 振荡条件下培养，使其在 600 nm 处的光密度（O.D.）达到 0.4 至 0.6 之间。可选：在各自最适生长温度下培养其他细菌菌株。</li>
	<li>将细胞置于冰上冷却 5 分钟，然后在 4 °C、7,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 50 ml 无菌冰水之中，在 4 °C、7,000 × g 条件下再次离心 5 分钟。重复此步骤一次。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于与菌体沉淀体积相等的冰水中。如需长期保存，先用 10 ml 冰冷的 10% (v/v) 甘油洗涤细胞，再将其重悬于与菌体沉淀体积相等的冰冷 10% (v/v) 甘油中，于 -80 °C 保存，并在电穿孔前置于冰上解冻。</li>
	<li>向 40 µl 细胞中加入 0.5 µl 转座子复合物。市售的转座子溶液 DNA 浓度为 0.33 µg/µl。尽管推荐使用 0.33 µg，但 0.165 µg DNA 已足够。</li>
	<li>将细胞与转座子的混合物加入预冷的 0.2 mm 电穿孔杯中，并轻弹管壁使混合液沉至杯底。在 25 µF、200 Ω、2.5 kV 条件下进行电击。为确保细胞保持低温，使用前应将电穿孔杯存放于 -20 °C 冰箱中。</li>
	<li>立即向其中加入 960 µl 经滤膜除菌的含分解代谢物阻遏的超优肉汤（SOC）培养基，用移液器吹打混匀，然后将细胞转移至无菌的 1.5 ml 微量离心管中。 
	注意：电击后细胞开始死亡，但 SOC 培养基中的盐分有助于细胞恢复。为节约试剂，阴性对照组细胞无需添加转座子或进行电击，仅需加入 960 µl 无菌 SOC 培养基即可。</li>
	<li>将细胞在 30 °C、120 rpm 振荡条件下孵育 45–60 分钟。此步骤可使转座子有足够时间与宿主基因组合并，并使细胞表达卡那霉素抗性。</li>
	<li>取 100 µl 细胞涂布于 LB-卡那霉素琼脂平板上，于 30 °C 过夜培养&#160;。将剩余的转化混合物于 4 °C 冰箱中保存。如有需要，可在初次电穿孔后的两周内分次取出剩余样品进行涂板。</li>
</ol>
2. 转化子的划线接种
<ol>
	<li>将一个网格图用胶带固定在直径为100 × 15 mm的空培养皿的皿盖上。可参考《细菌遗传学简明教程》12中的网格图进行复制。</li>
	<li>在LB-卡那霉素琼脂平板底部画一条直线。使用一小段胶带将平板底部与带有网格的皿盖固定，使网格可通过琼脂清晰可见。确保平板底部的直线与网格顶部中央对齐。用胶带固定平板可防止其滑动，从而实现均匀划格。该直线有助于在复制平板后识别菌落。</li>
	<li>用无菌牙签挑取单个转化子，并将其点种在网格中方格的中心位置。仅需轻轻接触菌落和点种位置，切勿将牙签插入琼脂中。为避免污染平板，操作时仅握持牙签的一端。</li>
	<li>参照步骤2.3，在相邻的方格中点种另一个转化子。当平板点种完毕后，在30 °C条件下过夜培养。此平板即为母板。</li>
</ol>
3. 复制平板接种法确定营养缺陷型表型12
<ol>
	<li>对于每一块已划线的平板，准备三块新鲜的琼脂平板并按顺序编号：一块用于LB-kan培养基，二块用于M-9-kan培养基，三块用于LB-kan培养基。使用前将平板倒置于37 °C过夜干燥。</li>
	<li>在每块平板的顶部画一条线，方法同步骤2.2。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭复制接种工具，在其表面放置一块无菌的丝绒布，并用夹具固定。即使洗手后，手上仍可能携带大量微生物。为防止污染微生物的引入，请仅通过丝绒布边缘进行操作。</li>
	<li>将主平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将平板放置在丝绒布上。轻轻按压，以将细菌从平板转移到丝绒布上。注意避免涂抹导致菌落扩散。转移完成后，移开主平板。</li>
	<li>将编号为一的平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将其放置在丝绒布上。轻轻按压，将细菌从丝绒布转移到该平板上。随后移开编号为一的平板。</li>
	<li>将使用过的丝绒布丢弃至盛有水的烧杯中，并按照步骤3.3的方法在复制接种工具上更换一块干净且无菌的丝绒布。此步骤可防止过度接种，从而避免穿透性生长和假阳性结果的出现。</li>
	<li>将编号为一的平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将其放置在新的丝绒布上。轻轻按压，将细菌从该平板转移到丝绒布上。随后移开编号为一的平板。</li>
	<li>将编号为二的平板上的线条与夹具上的线条对齐，然后将其放置在丝绒布上。轻轻按压，将细菌从丝绒布转移到编号为二的平板上。随后移开编号为二的平板。</li>
	<li>对编号为三的平板重复步骤3.8。第三块平板用于检测从主平板到其他两块平板的完全转移情况。将使用过的丝绒布丢弃至盛有水的烧杯中。若需重复使用丝绒布，可将装有污染丝绒布的烧杯进行高压灭菌，随后清洗、干燥、用铝箔包裹，并再次高压灭菌。</li>
	<li>将平板在30 °C下过夜培养。在两块LB-kan琼脂平板上生长但在M-9-kan平板上不能生长的菌落被认定为营养缺陷型菌株（图2）。</li>
	<li>从编号为一的平板上挑取营养缺陷型菌落，在一块新的LB-kan琼脂平板上划线，并在30 °C下过夜培养。</li>
	<li>从步骤3.11的划线平板上选取3个单菌落，在一块新的LB-kan平板上进行分离划线，每块平板分为三个区域，每个菌落分别划线于一个区域。在30 °C下过夜培养。此步骤可确保突变株得到良好分离。</li>
	<li>将步骤3.12获得的纯化菌落点种到一块新的LB-kan平板上，形成网格状排列，方法同步骤2.1–2.4。每个突变株均以三份重复进行重新测试。</li>
	<li>按照步骤3.1–3.10再次进行复制接种，以确认营养缺陷型表型。</li>
</ol>
4. 基因挽救
<ol>
	<li>从步骤 3.13 中分离的突变单菌落接种，于 30 °C 条件下在液体 LB-kan 培养基中培养 3 ml 过夜培养物。使用 commercially available 基因组 DNA 纯化试剂盒，从 1 ml 培养物中提取基因组 DNA。</li>
	<li>在冰上配制包含 0.025 U BfuC I 限制性内切酶和 14 µl 浓度为 1 μg/μl 的基因组 DNA 的 20 µl 反应体系。由于 BfuC I 可在转座子上十二个不同位点进行切割，使用 Bfa I 或 Hae III 限制性内切酶可能更为高效，它们分别在转座子上的两个和三个不同位点进行切割。</li>
	<li>将反应体系在 37 °C 孵育 25 分钟，随后在 80 °C 孵育 20 分钟以灭活酶活性。取 3 µl 部分消化的 DNA 在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 3）。成功的部分消化结果应呈现从 10 kb 以上至凝胶底部的连续弥散条带。</li>
	<li>在 500 µl 反应体系中，使用 800 单位 T4 DNA 连接酶对 15 µl 部分消化的基因组 DNA 进行连接反应。在 4 °C 条件下过夜孵育。较大的反应体积有助于最大化单一片段的自连效率，并减少两个或多个 DNA 片段之间的相互作用。</li>
	<li>通过加入 50 µl 3 M 醋酸钠（pH 5.5）和 1 ml 95% 乙醇，于 -20°C 孵育 20 分钟，对连接后的 DNA 进行沉淀。</li>
	<li>在 4 °C、13,500 × g 条件下离心 10 分钟，用 70% 乙醇洗涤沉淀，于离心真空浓缩仪中干燥，然后将其重悬于 10 µl 无核酸酶水中。或者，也可在室温下空气中干燥 15 分钟。</li>
	<li>取 4 µl 重悬的 DNA，通过电穿孔法转化至 E. coli 菌株 ECD100D pir 或 ECD100D pir116 中（如第 1 节所述）。R6kγ 复制起点需要含有 pir 基因的细菌菌株才能复制6。pir 菌株产生低拷贝质粒，而 pir116 菌株含有一个 pir 突变基因，可产生高拷贝质粒。每个转化子均含有一个携带转座子及一段中断染色体区域的新质粒（图 1E）。</li>
	<li>用单个菌落接种 5 ml LB-kan 培养基，在 120 rpm 振荡条件下于 37 °C 培养过夜，使用 commercial kit 从整个过夜培养物中纯化质粒 DNA。</li>
	<li>使用限制性内切酶 Xho I 对 14 µl 质粒 DNA 进行消化，确保反应终体积为 20 µl。该酶识别位于卡那霉素抗性基因 5’ 端转座子中部的一个酶切位点。取 10 µl 未消化和已消化的质粒在 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 3）。该质粒由 2 kb 的转座子及两侧的宿主 DNA 组成。</li>
</ol>
5. DNA 测序
<ol>
	<li>使用市售测序试剂盒、与转座子两端同源的引物以及毛细管测序分析系统对质粒进行测序。或者，可将质粒送至外部机构进行测序。</li>
	<li>利用凝胶中的分子量标准（1 kb DNA ladder）估算质粒的大小，然后估算获得 50 fmol 所需的质粒纳克数（ng）。</li>
	<li>使用分光光度计在 260 nm（A260）和 280 nm（A280）波长下测定质粒 DNA 的浓度。确保比色皿中的光程为 1 cm。通过将 260 nm 处的吸光度乘以 50 ng/µl 来确定浓度。高质量的质粒 DNA 其 A260/A280 比值应在 1.8 至 2.0 之间。</li>
	<li>每轮测序反应所需的 DNA 体积为 50 fmol 所需的 ng 数除以质粒浓度。将所需体积的质粒与水混合，使总体积达到 10 µl。</li>
	<li>将质粒 DNA 与水的混合物在 96 °C 加热 1 分钟，然后冷却至室温。</li>
	<li>加入 8 µl 测序试剂盒中的预混液（master mix）以及 2 µl 浓度为 1.6 μM 的其中一种测序引物。</li>
	<li>按照测序试剂盒提供的说明书设置热循环仪程序并进行反应后纯化。</li>
	<li>使用毛细管 DNA 分析系统对每个样品进行分析。</li>
	<li>使用市售软件查看 DNA 序列，搜索序列“5’-GAGACAG-3’”，该序列是转座子的最后 7 个碱基对（图 4）。此 7 bp 片段 5’端之前的序列属于转座子部分，3’端之后的序列则属于被中断的基因。</li>
	<li>使用基本局部比对搜索工具（BLAST）7,8 确定被中断基因的可能功能。访问以下链接：<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;#38;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;#38;PAGE_TYPE=BlastSearch</a>。将被中断基因的序列粘贴至查询框中，在数据库选项下选择“others”，然后点击页面底部的“BLAST”按钮。结果出现后，向下滚动页面查看比对结果（图 5）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

利用转座子复合物（transposome）进行转座子诱变是构建Enterobacter sp. YSU以及其他革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌营养缺陷型菌株的有效工具3,4。该过程首先通过电穿孔将Tn5衍生的转座子复合物导入宿主细胞。为了筛选含有插入片段的菌落，未转化的目标菌株必须对卡那霉素敏感，以便利用转座子携带的抗性标记进行筛选。某些宿主菌株会产生限制性内切酶，在转座子DNA与宿主基因组发生重组前将其降解。在电穿孔混合物中添加限制性内切酶抑制剂可减少DNA降解，提高转化效率3。在制备电转化感受态细菌时，必须尽可能去除盐分，以防止因盐离子存在而产生电弧或火花，导致细菌死亡。即使未出现电弧，细胞在电击后也会迅速开始死亡。立即加入含盐的SOC生长培养基可恢复渗透压平衡，最大限度减少细胞死亡，并提高转化效率5。将获得的卡那霉素抗性转化子点种至新鲜的LB-kan平板，并复制到M-9最小培养基琼脂平板上进行筛选。为防止接种过量而导致假阳性结果，遗漏潜在的营养缺陷型菌株，在接种其余平板之前，应在步骤3.6中更换丝绒布方块。随后在复制平板过程中，施加适当...

野生型细菌可在含有葡萄糖的M-9最低盐培养基（M-9培养基）中生长，通过中心碳代谢途径将葡萄糖转化为生物合成所需的前体物质，例如氨基酸、核酸和维生素1。M-9培养基含有氯化铵作为氮源，磷酸钠和磷酸钾作为缓冲剂及磷源，硫酸镁作为硫源，葡萄糖作为碳源和能源。LB培养基（Luria-Bertani培养基）富含胰蛋白胨提供的氨基酸以及酵母提取物提供的维生素和生长因子，能够支持营养缺陷型菌株的生长，这些菌株无法合成在M-9培养基上生长所必需的氨基酸、维生素及其他生长因子。因此，野生型菌株可在LB培养基和M-9培养基中生长，而营养缺陷型菌株只能在LB培养基中生长，不能在M-9培养基中生长。通过向野生型细菌群体中引入突变，并鉴定导致营养缺陷型表型的突变基因，可更深入地理解细菌菌株的代谢机制。
转座子诱变可用于鉴定在M-9培养基中葡萄糖生长所必需的众多基因。转座子会随机插入宿主基因组中2通过将转座子转化子点种在LB琼脂平板上，并复制平板至M-9培养基琼脂平板，可筛选营养缺陷型菌株。中断基因通过基因拯救法进行鉴定。本研究采用一种 commercially available Tn5-衍生的转座子，以线性转座子DNA片段与转座酶蛋白混合溶液的形式提供。该DNA片段不含转座酶基因，但包含卡那霉素抗性基因， R6Kγ 复制起点和两个镶嵌基序，后者是位于该片段两端、供转座酶结合的DNA序列3,4由于转座酶蛋白直接添加到DNA中，因此仅将DNA片段定义为转座子，而将DNA/转座酶蛋白复合物定义为转座复合体。转座复合体通过电穿孔法转化。5 进入卡那霉素敏感的宿主（图1A）。在含有卡那霉素的LB琼脂平板（LB-kan）上生长的菌落含有转座子插入。图1B)，并将转化子影印接种到含卡那霉素的M-9培养基琼脂平板（M-9-kan）上，不能生长的转化子为营养缺陷型（auxotrophs）图1C）。从突变体中纯化基因组DNA，并使用识别4个碱基的限制性内切酶进行部分消化， BfuC I (图1D）。连接的DNA被转化至一种菌株中 大肠杆菌 (E. coli）包含的 pir 基因图1E）。该基因使得含有转座子及侧翼宿主染色体区域的新质粒能够在 大肠杆菌6卡那霉素抗性基因作为新质粒的可筛选标记。最后，使用与转座子两端互补的引物进行测序，并进行局部比对基本搜索工具（BLAST）分析。7,8 利用测序结果确定被中断基因的身份。
这种转座子突变策略具有三个优势3。首先，由于转座酶蛋白直接与转座子结合，插入过程不依赖于宿主细胞内转座酶基因的表达。一旦转座子插入宿主基因组，转座酶即被降解，从而防止转座子进一步移动。然而，如果宿主本身含有内源性的Tn5转座元件，则无法阻止其额外移动。其次，通过电穿孔将转座子复合物导入宿主，使其可在多种宿主中使用，同时避免了通过细菌接合或病毒感染的方式引入转座子，而这两种过程均依赖宿主的易感性。第三，在转座子中包含卡那霉素抗性基因和R6Kγ复制起点，有助于识别被中断的基因。转座子插入的区域可作为质粒保存并进行测序，从而无需采用反向聚合酶链式反应（PCR）技术进行基因鉴定。
本视频中介绍的实验方案详细描述了使用转座子对Enterobacter sp. YSU9进行转座子诱变的每一步操作，从转座子复合物导入细菌细胞，到鉴定其插入中断的潜在基因。除此前已发表的实验方案3,4,10外，本文还提供了利用影印平板法筛选营养缺陷型菌株的详细方法。该诱变技术可用于研究不同类型细菌的其他表型，例如对抗生素和金属的抗性；也可用于合成生物学研究中确定特定培养条件下生长所必需的最少基因数量，或用于遗传学或微生物生理学课程的实验教学部分。

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&amp;gamma;ori/KAN-2 Tnp 转座子试剂盒</td><td>Epicentre（Illumina）</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 电转感受态大肠杆菌</td><td>Epicentre（Illumina）</td><td>ECP09500</td><td>能够复制含有 R6K 的质粒&amp;gamma; 低拷贝数的复制起点</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 电转感受态大肠杆菌</td><td>Epicentre（Illumina）</td><td>EC6P095H</td><td>能够复制含有 R6K 的质粒&amp;gamma; 高拷贝数的复制起点</td></tr><tr><td>5X M-9 盐溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB 肉汤</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>固体培养基含有1.6%（w/v）琼脂</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素&amp;nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>必要时，培养基中含有 50 &amp;mu;g/ml 硫酸卡那霉素</td></tr><tr><td>D-葡萄糖一水合物</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>含分解代谢物阻遏的超优肉汤（SOC）培养基</td><td></td><td></td><td>0.5% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 胰蛋白胨，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，20 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 20 mM 葡萄糖</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>基因组DNA的部分消化</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>质粒消化</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>用于溶解沉淀的DNA和限制性内切酶反应</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - 快速启动试剂盒</td><td>贝克曼库尔特</td><td>608120</td><td>DNA测序</td></tr><tr><td>Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>质粒纯化</td></tr><tr><td>复制平板接种块</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>天鹅绒方块</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>09-718-2</td><td>复制平板接种</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>用于复制平板的网格</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>伯乐（BioRad）</td><td></td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿 &amp;ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA 真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>干燥DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA分析系统</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td>DNA测序</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>DNA序列分析</td></tr></tbody></table>

使用转座子诱变法构建 enterobacter sp. ysu 营养缺陷型菌株

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

原养型细菌可在添加葡萄糖的M-9最低盐培养基（M-9培养基）上生长，其中葡萄糖作为碳源和能源。可通过转座子构建营养缺陷型突变株。本实验方案中使用的商业化Tn5衍生转座子包含一段线性DNA，其上具有R6Kγ复制起点、卡那霉素抗性基因以及两个镶嵌序列末端（作为转座酶结合位点）。该转座子以DNA/转座酶蛋白复合物的形式提供，通过电穿孔法导入原养型菌株Enterobacter sp. YSU中，并随机插入至宿主基因组内。将转化子复制接种于含卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板（LB-kan）和含卡那霉素的M-9培养基琼脂平板（M-9-kan）上。在LB-kan平板上生长但在M-9-kan平板上不生长的转化子被认定为营养缺陷型突变株。从营养缺陷型菌株中提取纯化的基因组DNA，经部分酶切、连接后转化至pir+ Escherichia coli（E. coli）菌株中。R6Kγ复制起点使质粒可在pir+ E. coli菌株中复制，而卡那霉素抗性标记则可用于质粒筛选。每个转化子均携带一种新的质粒，其中含有被中断染色体区域所侧翼包围的转座子。通过Sanger测序及基本局部比对搜索工具（BLAST）分析，可推测被中断基因的可能身份。采用该转座子诱变策略具有三个优势：第一，该方法不依赖宿主表达转座酶基因；第二，转座子通过电穿孔导入目标宿主，而非通过接合或转导，因而效率更高；第三，R6Kγ复制起点使得被突变基因易于鉴定，因其部分序列可在一个重组质粒中被回收。该技术可用于研究Enterobacter sp. YSU中参与其他性状的基因，或更广泛种类细菌菌株中的相关基因。

通过电穿孔将转座子导入 Enterobacter sp. YSU，实现了转座子在宿主基因组中的随机插入（图1A,B）。一次成功的电穿孔可获得数千个转化子，这些转化子可在LB-kan平板上生长。为获得每板300–400个分布良好的单菌落，优化了涂布于每块LB-kan琼脂平板上的转化混合物体积。每个转化子至少含有一个转座子插入，但在通过影印培养法筛选前，尚不清楚是否已有影响M-9培养基生长的关键基因被中断。将转化子以88个为一组转移至新的LB-kan平板，并影印接种至M-9培养基上。需注意的是，为确保转座子在转化子中稳定维持，方案部分建议在M-9培养基平板中添加卡那霉素。本实验中M-9培养基未添加卡那霉素，但仍可成功筛选出营养缺陷型突变株。在图2中，黑色方块表示两个菌落在LB-kan平板上生长（2A），但在M-9基本培养基平板上不生长（2B）。这些营养缺陷型菌株的转座子可能插入并中断了参与合成氨基酸、核酸或维生素的基因，而这些物质存在于LB培养基中，但不存在于M-9基本培养基中（图1C）。其余86个菌落则未在M-9基本培养...

Enterobacter sp. YSU 可在葡萄糖最低盐培养基中生长。通过将转座子导入该菌株，可使其基因组随机插入并产生营养缺陷型突变体。通过从完全培养基到最低培养基的影印平板法筛选获得突变体。通过基因拯救及测序方法鉴定被插入中断的基因。

使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

原养型细菌在添加了葡萄糖的M-9最低盐培养基（M-9培养基）上生长，葡萄糖作为碳源和能源。营养缺陷型菌株可以……

以下实验的总体目标是获得能够在添加了葡萄糖的最低盐培养基中生长的野生型细菌菌株的TRO。为此，将一个转座子导入野生型宿主菌株，从而获得对卡那霉素具有抗性的细菌群体，其基因组中随机插入了转座子。随后通过影印平板法筛选转化子，鉴定出那些在富集培养基上能够生长，但在添加葡萄糖的最低盐培养基上无法生长的TRO。接下来，将突变体的基因组DNA进行消化、连接并转化至大肠杆菌中，以获得一个质粒，该质粒包含被转座子插入的基因片段，且转座子两端侧翼为中断基因的片段。通过DNA测序及基于BLAST（局部比对基本搜索工具）分析，获得结果以确定被中断基因的假定身份。本技术中使用的转座子含有复制起点、卡那霉素抗性基因以及镶嵌末端。用于转座的蛋白质结合。它缺乏转座蛋白质基因，因此我们必须将该转座基因与转座子DNA片段一同加入，然后将转座DNA与蛋白质形成的复合物通过电穿孔导入宿主细胞。电穿孔的主要优点是无需进行转导或接合。由于转座子缺乏转座酶基因，通常会产生稳定的插入突变；而复制起点和氯霉素抗性基因的存在则有助于快速鉴定突变基因，该基因可被回收为重组质粒。该方法有助于解答微生物生理学领域的关键问题，例如鉴定氨基酸、核酸和维生素生物合成所必需的基因。我最初在寻找肠杆菌属YSU菌株中的金属抗性基因时提出了该方法的想法，并决定将其整合到我正在开发的微生物生理学实验课程中，利用肠杆菌属菌株的过夜培养物制备感受态细胞进行电穿孔。YSU 在新鲜的 LB 培养基中制备 1:20 的稀释液，并在 30 摄氏度、120 RPM 条件下振荡培养，使 OD600 达到 0.4 至 0.6 之间。当细胞达到适当密度时，将菌液置于冰上冷却 5 分钟，然后在 4 摄氏度、7,000 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并加入等体积的预冷无菌水重悬菌体。将细胞在4°C、7,000 G条件下离心5分钟。重复洗涤一次后，弃去上清液，并用预冷的冰水重悬细胞，重悬体积与细胞沉淀体积相等。接着，向40微升细胞中加入0.5微升的转座酶混合液。然后将细胞转染混合物置于预冷的电穿孔杯中，轻轻敲击使混合物沉降至管底。在25 µF、200 Ω和2.5 kV条件下对细胞进行电击。电击后立即加入960 µL过滤除菌的SOC培养基，用移液器吹打混匀，随后将细胞转移至无菌的1.5 mL离心管中。在30 °C、120 rpm条件下孵育45至60分钟。然后取100微升菌液涂布于LB卡那霉素琼脂平板上，于30摄氏度过夜培养以获得转化子。将网格图固定在空的100 mm × 15 mm培养皿的皿盖上。在LB卡那霉素琼脂平板底部画一条线，并用一小片胶带将其与带网格的皿盖固定，使网格可通过琼脂表面观察到。使用无菌牙签进行操作。选择一个转化子，将其点样在网格中某个方格的中心位置，再将另一个转化子点样在相邻的方格中，依此类推，直至平板布满。然后在30摄氏度下过夜培养。此平板即为每个网格化平板的主平板。准备三块新的螺旋刮板，按顺序编号为一至三。编号一用于LB，编号二用于M9，编号三用于LB。使用前将这些平板倒置，在37摄氏度下干燥过夜。在每块平板的顶部画一条线（如前所述），然后用70%乙醇擦拭复制平板工具，并在夹紧前将一块无菌绒布放在其顶部。接着，将主平板上的线条与夹具上画的线条对齐，并将平板放置在绒布上方。轻轻按压，以将细菌从平板转移到绒布上。然后将1号平板上画的线与夹子上的线对齐，并将其放在veltin方块的上方。轻轻按压，将细菌从veltin方块转移到平板上。取下1号平板。将带有菌体的丝绒方块弃于盛水的烧杯中，并在复制平板工具上放置一块干净无菌的丝绒方块。同前，将一号平板上的刻线与夹具上的刻线对齐，然后将其压在新的丝绒方块上。轻轻施加压力，以将细菌从一号平板转移到丝绒方块上。取下1号平板，将2号平板上的划线与夹具上的线条对齐，然后将其放置在绒布方块上。轻轻按压，将细菌从绒布方块转移到2号平板上。重复上述步骤处理3号平板后，取下2号平板，将所有平板在30°C条件下过夜培养。在LB平板上生长但在M9平板上不能生长的菌落被视为营养缺陷型菌落。从1号平板中挑选TROs，划线接种至新鲜的LB卡那平板上。过夜培养后，于次日在划线平板上挑选三个菌落，并将其分别划线接种至新的LB卡那平板上。从新划线的平板上挑取菌落，点样至LB卡那网格平板，并用此平板重复进行如前所述的影印平板操作。进行基因挽救实验。用分离的突变菌落接种3毫升LB培养基，在30°C条件下过夜培养。然后使用市售的基因组DNA纯化试剂盒，从1毫升培养物中纯化DNA，加入0.025单位的BFUC一种限制性内切酶至14微升浓度为每微升1微克的基因组DNA中，在20微升反应体系中冰上反应。随后将反应体系在37摄氏度孵育25分钟，再转移至80摄氏度加热20分钟。为灭活酶活性，取3微升部分酶切的DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。接下来，将800单位的T4 DNA连接酶加入到500微升反应体系中的15微升部分消化的基因组DNA中，于4°C过夜孵育次日。通过加入50微升3摩尔的醋酸钠（pH 5.5）和1毫升95%乙醇沉淀连接后的DNA，在-20°C孵育20分钟。在4°C、13,500 ×g条件下离心10分钟以收集DNA。倒掉上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀。在离心真空浓缩仪中干燥，加入10 µL无核酸酶水以重悬DNA。取4 µL重悬的DNA通过电穿孔转化大肠杆菌菌株ECD 100 DPIR或ECD 100 DPIR。挑取单菌落接种于5 mL LB培养基中。在37摄氏度、120转/分钟条件下过夜培养。第二天，从全量培养物中纯化DNA后，用Joe一酶消化14 µL质粒。取10 µL未消化和已消化的质粒，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。测序质粒后，寻找5'端GA、G-A-C-A-G 3'端序列，该序列为转座子的最后七个碱基对，其后将跟随被中断基因的序列。使用BLAST确定被中断基因的可能功能。一次成功的电转化可获得数千个转化子，每个转化子至少含有一个转座子插入，如本图所示。黑色方块表示在 LB 氯霉素平板上生长，但在 M9 最小培养基平板上不生长的两个菌落。这些 TRO 可能含有在氨基酸、核苷酸或维生素合成相关基因中的插入突变，而这些成分均存在于 LB 培养基中，但不存在于 M9 最小培养基中。其余 86 个菌落则没有在 M9 培养基生长所必需的基因中发生插入突变。如图所示，最小培养基中部分消化的分离TRO基因组DNA片段大小从10千碱基以上至0.5千碱基以下不等。回收的质粒包含一个2千碱基的转座子及其侧翼的宿主DNA。该图显示了从一个tro中分离出的质粒的BLAST比对结果。该中断序列与肠杆菌属的 cloy 基因相似，该基因编码的酶为参与 L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和 L-色氨酸生物合成的氨基变位酶。由于需要多次过夜培养步骤，若操作得当，该技术可在 10 至 11 天内完成。在进行影印平板操作时，需注意避免划破培养基表面，可通过使用干燥的平板以及将平板放置于绒布方格上后不再移动来防止此类情况发生。完成此操作后，可进行其他方法，如克隆或互补实验，以验证所鉴定基因的功能。观看本视频后，您应能充分理解如何利用转座子突变生成TROs，以及如何初步鉴定突变基因。

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的产生肠杆菌 SP。 YSU营养缺陷型使用转座子突变

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

来源：Kazi, M. I., 等.，利用高通量测序技术构建革兰氏阴性菌转座子插入文库。 J. Vis. Exp.

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利用一种新型转座子介导的方法确定 Escherichia coli 中 DNA 元件的最佳染色体位置

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利用细菌接合在肠杆菌科菌株（如Escherichia coli或Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库

我们在此介绍一种将转座子诱变与高通量测序相结合的技术，用于在仓鼠攻毒后鉴定并定量组织中的转座子钩端螺旋体突变株。该方案可用于筛选突变株在动物体内的存活与播散能力，也可应用于 体外...

高通量并行测序检测适应性 问号钩端螺旋体 转座子插入突变体在金黄叙利亚仓鼠感染过程中的研究

Pseudomonas aeruginosa 感染在易感宿主中可引起显著的发病率。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株 PA14 的非冗余转座子插入突变体文库（命名为 PA14NR 文库）可用于分析众多生物学过程中的基因功能。本文介绍了一种用于制备高质量 PA14NR...

铜绿假单胞菌 PA14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制

通过测序实现的相互半合子化（RH-seq）是一种强大的新方法，可用于定位物种间性状差异的遗传基础。该方法利用转座子诱变生成半合子池，并通过高通量测序结合竞争性生长来追踪其适合度。对所得数据的分析可精确定位控制该性状的基因。...

Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter...

在革兰氏阴性菌中构建转座子插入文库用于高通量测序

了解利用转座子诱变技术构建Enterobacter sp. YSU营养缺陷型突变株的完整实验流程。该方法通过电转化和影印平板筛选，结合基因拯救与测序技术，帮助研究者鉴定细菌生长必需基因的功能。

使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

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