使用转座子诱变法构建 Enterobacter sp. YSU 营养缺陷型菌株

以下实验的总体目标是获得能够在添加了葡萄糖的最低盐培养基中生长的野生型细菌菌株的TRO。为此，将一个转座子导入野生型宿主菌株，从而获得对卡那霉素具有抗性的细菌群体，其基因组中随机插入了转座子。随后通过影印平板法筛选转化子，鉴定出那些在富集培养基上能够生长，但在添加葡萄糖的最低盐培养基上无法生长的TRO。

接下来，将突变体的基因组DNA进行消化、连接并转化至大肠杆菌中，以获得一个质粒，该质粒包含被转座子插入的基因片段，且转座子两端侧翼为中断基因的片段。通过DNA测序及基于BLAST（局部比对基本搜索工具）分析，获得结果以确定被中断基因的假定身份。本技术中使用的转座子含有复制起点、卡那霉素抗性基因以及镶嵌末端。

用于转座的蛋白质结合。它缺乏转座蛋白质基因，因此我们必须将该转座基因与转座子DNA片段一同加入，然后将转座DNA与蛋白质形成的复合物通过电穿孔导入宿主细胞。电穿孔的主要优点是无需进行转导或接合。

由于转座子缺乏转座酶基因，通常会产生稳定的插入突变；而复制起点和氯霉素抗性基因的存在则有助于快速鉴定突变基因，该基因可被回收为重组质粒。该方法有助于解答微生物生理学领域的关键问题，例如鉴定氨基酸、核酸和维生素生物合成所必需的基因。我最初在寻找肠杆菌属YSU菌株中的金属抗性基因时提出了该方法的想法，并决定将其整合到我正在开发的微生物生理学实验课程中，利用肠杆菌属菌株的过夜培养物制备感受态细胞进行电穿孔。

YSU 在新鲜的 LB 培养基中制备 1:20 的稀释液，并在 30 摄氏度、120 RPM 条件下振荡培养，使 OD600 达到 0.4 至 0.6 之间。当细胞达到适当密度时，将菌液置于冰上冷却 5 分钟，然后在 4 摄氏度、7,000 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并加入等体积的预冷无菌水重悬菌体。

将细胞在4°C、7,000 G条件下离心5分钟。重复洗涤一次后，弃去上清液，并用预冷的冰水重悬细胞，重悬体积与细胞沉淀体积相等。接着，向40微升细胞中加入0.5微升的转座酶混合液。

然后将细胞转染混合物置于预冷的电穿孔杯中，轻轻敲击使混合物沉降至管底。在25 µF、200 Ω和2.5 kV条件下对细胞进行电击。电击后立即加入960 µL过滤除菌的SOC培养基，用移液器吹打混匀，随后将细胞转移至无菌的1.5 mL离心管中。在30 °C、120 rpm条件下孵育45至60分钟。

然后取100微升菌液涂布于LB卡那霉素琼脂平板上，于30摄氏度过夜培养以获得转化子。将网格图固定在空的100 mm × 15 mm培养皿的皿盖上。在LB卡那霉素琼脂平板底部画一条线，并用一小片胶带将其与带网格的皿盖固定，使网格可通过琼脂表面观察到。使用无菌牙签进行操作。

选择一个转化子，将其点样在网格中某个方格的中心位置，再将另一个转化子点样在相邻的方格中，依此类推，直至平板布满。然后在30摄氏度下过夜培养。此平板即为每个网格化平板的主平板。

准备三块新的螺旋刮板，按顺序编号为一至三。编号一用于LB，编号二用于M9，编号三用于LB。使用前将这些平板倒置，在37摄氏度下干燥过夜。

在每块平板的顶部画一条线（如前所述），然后用70%乙醇擦拭复制平板工具，并在夹紧前将一块无菌绒布放在其顶部。接着，将主平板上的线条与夹具上画的线条对齐，并将平板放置在绒布上方。轻轻按压，以将细菌从平板转移到绒布上。

然后将1号平板上画的线与夹子上的线对齐，并将其放在veltin方块的上方。轻轻按压，将细菌从veltin方块转移到平板上。取下1号平板。

将带有菌体的丝绒方块弃于盛水的烧杯中，并在复制平板工具上放置一块干净无菌的丝绒方块。同前，将一号平板上的刻线与夹具上的刻线对齐，然后将其压在新的丝绒方块上。轻轻施加压力，以将细菌从一号平板转移到丝绒方块上。

取下1号平板，将2号平板上的划线与夹具上的线条对齐，然后将其放置在绒布方块上。轻轻按压，将细菌从绒布方块转移到2号平板上。重复上述步骤处理3号平板后，取下2号平板，将所有平板在30°C条件下过夜培养。在LB平板上生长但在M9平板上不能生长的菌落被视为营养缺陷型菌落。

从1号平板中挑选TROs，划线接种至新鲜的LB卡那平板上。过夜培养后，于次日在划线平板上挑选三个菌落，并将其分别划线接种至新的LB卡那平板上。从新划线的平板上挑取菌落，点样至LB卡那网格平板，并用此平板重复进行如前所述的影印平板操作。

进行基因挽救实验。用分离的突变菌落接种3毫升LB培养基，在30°C条件下过夜培养。

然后使用市售的基因组DNA纯化试剂盒，从1毫升培养物中纯化DNA，加入0.025单位的BFUC一种限制性内切酶至14微升浓度为每微升1微克的基因组DNA中，在20微升反应体系中冰上反应。随后将反应体系在37摄氏度孵育25分钟，再转移至80摄氏度加热20分钟。为灭活酶活性，取3微升部分酶切的DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

接下来，将800单位的T4 DNA连接酶加入到500微升反应体系中的15微升部分消化的基因组DNA中，于4°C过夜孵育次日。通过加入50微升3摩尔的醋酸钠（pH 5.5）和1毫升95%乙醇沉淀连接后的DNA，在-20°C孵育20分钟。在4°C、13,500 ×g条件下离心10分钟以收集DNA。

倒掉上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀。在离心真空浓缩仪中干燥，加入10 µL无核酸酶水以重悬DNA。取4 µL重悬的DNA通过电穿孔转化大肠杆菌菌株ECD 100 DPIR或ECD 100 DPIR。挑取单菌落接种于5 mL LB培养基中。

在37摄氏度、120转/分钟条件下过夜培养。第二天，从全量培养物中纯化DNA后，用Joe一酶消化14 µL质粒。取10 µL未消化和已消化的质粒，在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。

测序质粒后，寻找5'端GA、G-A-C-A-G 3'端序列，该序列为转座子的最后七个碱基对，其后将跟随被中断基因的序列。使用BLAST确定被中断基因的可能功能。一次成功的电转化可获得数千个转化子，每个转化子至少含有一个转座子插入，如本图所示。

黑色方块表示在 LB 氯霉素平板上生长，但在 M9 最小培养基平板上不生长的两个菌落。这些 TRO 可能含有在氨基酸、核苷酸或维生素合成相关基因中的插入突变，而这些成分均存在于 LB 培养基中，但不存在于 M9 最小培养基中。其余 86 个菌落则没有在 M9 培养基生长所必需的基因中发生插入突变。

如图所示，最小培养基中部分消化的分离TRO基因组DNA片段大小从10千碱基以上至0.5千碱基以下不等。回收的质粒包含一个2千碱基的转座子及其侧翼的宿主DNA。该图显示了从一个tro中分离出的质粒的BLAST比对结果。

该中断序列与肠杆菌属的 cloy 基因相似，该基因编码的酶为参与 L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和 L-色氨酸生物合成的氨基变位酶。由于需要多次过夜培养步骤，若操作得当，该技术可在 10 至 11 天内完成。在进行影印平板操作时，需注意避免划破培养基表面，可通过使用干燥的平板以及将平板放置于绒布方格上后不再移动来防止此类情况发生。

完成此操作后，可进行其他方法，如克隆或互补实验，以验证所鉴定基因的功能。观看本视频后，您应能充分理解如何利用转座子突变生成TROs，以及如何初步鉴定突变基因。