从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示
2014年10月19日
本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。
以下实验的总体目标是采用整合蛋白质组学方法，鉴定人类疾病中潜在的预后标志物和/或治疗靶点。该目标通过分离来自预后良好或预后不良患者外周血的原代白血病细胞实现，这些细胞同时表达CD19和CD5表面标志物，可用于后续的蛋白质组学分析。白血病细胞裂解物通过双向电泳（2-DE）分离，通过比较蛋白质组图谱，可鉴定出预后良好与预后不良患者之间差异表达的蛋白点，随后可通过质谱（MS）对其进行鉴定。
接下来可以采用不同的实验方法，以验证并解析所鉴定出的蛋白质在疾病自然病程中的作用。结果显示，通过两种去糖基化凝胶检测到的HS蛋白不同的磷酸化状态，与患者的临床转归相关。该技术的应用意义延伸至慢性淋巴细胞白血病的治疗领域，因为它有助于识别参与疾病进展的蛋白质，这些蛋白质可被用作预后标志物和/或治疗靶点，本文所述实验流程将为此提供支持。
帕梅拉跑向实验室的技术员以及来自外部实验室的一名博士后。在开始此操作之前，使用含肝素钠的真空采血管收集外周血。将血液转移至15毫升离心管中，并按每毫升全血加入50 µL人B细胞富集试剂盒。然后充分混匀，在室温下孵育20分钟。
孵育后，加入等体积的含2% FBS的PBS稀释样本，轻柔混匀，小心地将血液叠加到离心管中的分离液界面上，注意避免破坏界面。在室温下以400 × g离心20分钟，无刹车。离心结束后，小心吸取界面层，收集细胞并转移至新的离心管中。
离心并去除上清液后，用 PBS 洗涤细胞一次。稀释后，通过手动来回轻弹试管，将沉淀物重悬于残留的上清液中。使用完全 RPMI 培养基，采用台盼蓝排斥法计数细胞。
接下来，将以下抗体加入含有100微升纯化细胞悬液的离心管中。在4°C避光条件下孵育20分钟。用4毫升PBS洗涤样本后，通过流式细胞术检测纯度。
检测慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的比例，这些细胞表面共同表达 CD19 和 CD5。通过检测图中 CD3、CD14 和 CD16/56 的比例，确认制备物几乎不含 NK T 淋巴细胞和单核细胞，此时这些标记的比例应接近零。用终体积为 380 µL 的双向电泳缓冲液溶解 CLL 细胞沉淀。
将一毫克蛋白样品分别加入18条IPG胶条中，进行等电聚焦。电泳结束后，将胶条置于两毫升平衡缓冲液中，在室温下平衡15分钟，缓冲液中添加2%新鲜DTT。弃去该溶液后，加入两毫升平衡缓冲液，其中添加2.5%碘乙酰胺。
然后将样品在室温下于摇床上孵育15分钟。随后将胶条放在纸巾上干燥，注意不要触碰凝胶以去除多余的溶液。干燥后，将每条胶条加样至9%至16%的梯度SDS-PAGE凝胶上端。
在凝胶上方加入少量 SDS 电泳缓冲液，以利于上样。接着，加入约 5 毫升 0.8% 琼脂溶液密封凝胶，防止胶条漂浮。电泳装置组装完毕后，用 SDS 电泳缓冲液充满电泳槽。
然后在4°C条件下，以每块凝胶60毫安的电流运行4小时，或使用冷却系统进行电泳。从电泳装置中取出凝胶后，将其放入合适的染色盒中。每种溶液准备约200毫升。
将每种溶液小心加入含有凝胶的染色盒中。所有孵育步骤均在摇床上进行。染色完成后，移除终止液，并将凝胶置于1%乙酸溶液中，直至成像前。
对于迁移实验，将先前纯化的细胞重新悬浮。在完全RPMI培养基中，向下层Transwell小室加入600微升含或不含特定刺激物的完全RPMI培养基，以分别检测诱导迁移和自发迁移。将上层小室置于其上，放入37摄氏度培养箱中平衡30分钟。
实验结束后，在上室中每200微升加入10的6次方个细胞，并将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育4小时。孵育完成后，移除上室，收集下室中的培养基。随后用1毫升PBS将下室洗涤一次。
将PBS收集至离心管后，去除上清液，以300 × g离心5分钟。通过流式细胞术，用500 µL PBS重悬样本。采集1分钟后，计数迁移的细胞数量。
在二维点图中检查细胞数量，考虑细胞的侧向散射以及在一分钟内观察到的事件数，后者即为用于计算的数值。来自慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的分离原代白血病细胞样本，根据每位患者的临床特征分为两个主要亚群，并通过两种差分电离（DE）和质谱（MS）在特定质量容差范围内进行分析。肽段序列在数据库中进行匹配后，组装成蛋白质；若其通过特定概率评分，则视为已鉴定蛋白质。
通过该分析，在这些蛋白质中主要鉴定出参与细胞骨架活动和代谢过程的蛋白质。造血谱系、细胞特异性蛋白质或hs。其中一种蛋白质的差异磷酸化与疾病的临床病程密切相关，且呈差异表达。
特别是，携带单个信号点的患者临床预后较差，而具有两个信号点的患者预后良好。携带HS1作为单个信号点的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，在迁移、黏附和肌动蛋白聚合方面的细胞骨架活性均表现出受损，与低磷酸化的HS1相比尤为明显。单点与双点样本的差异由此解释了其不同的临床行为。
观看本视频后，您应能充分理解如何利用蛋白质组学来鉴定参与疾病进展的生物学候选分子，这些分子可作为预后标志物和（或）治疗靶点。
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概述
本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术——二维电泳（2DE）和质谱分析（MS）——用于鉴定原代白血病细胞中差异表达蛋白质的实验方案。该方法旨在揭示与人类疾病相关的预后标志物和治疗靶点。
关键研究要素
科学领域
- 蛋白质组学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 从预后不同的患者中分离白血病细胞。
- 使用CD19和CD5表面标志物进行蛋白质组学分析。
- 采用双向电泳（2DE）分离白血病细胞裂解液。
- 质谱技术用于鉴定差异表达的蛋白质。
研究目的
- 确定白血病患者中潜在的预后标志物。
- 探索慢性淋巴细胞白血病的治疗靶点。
- 验证所鉴定蛋白质在疾病进展中的作用。
使用的方法
- 从外周血中分离原代白血病细胞。
- 应用二维电泳（2DE）。
- 比较不同患者组之间的蛋白质组图谱。
- 利用质谱法（MS）鉴定蛋白质。
主要结果
- 鉴定与临床结局相关的差异表达蛋白。
- HS1的磷酸化状态与患者预后相关。
- 在慢性淋巴细胞白血病中识别潜在治疗靶点的可能性。
- 验证实验确认了所鉴定蛋白的作用。
结论
- 联合蛋白质组学方法在鉴定预后标志物方面具有显著效果。
- 该技术可促进靶向治疗的开发。
- 需要进一步研究以探讨这些发现的潜在意义。
常见问题
行业重要性概述
利用双向电泳（2DE）和质谱技术进行蛋白质组学分析，可鉴定与慢性淋巴细胞白血病（CLL）疾病进展相关的蛋白质，有助于早期靶点验证和预后标志物的发现。该工作流程在发现生物学与转化研究的转折点上提高了预测的可信度，直接为项目组合筛选和基于风险评估的推进决策提供依据。结合功能验证实验可进一步加强候选靶点的机制性风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 实现慢性淋巴细胞白血病（CLL）中与疾病相关通路的比较蛋白质组学图谱分析。
- 通过将蛋白质磷酸化状态与临床结局关联，支持功能靶点的验证。
- 通过对原代细胞中蛋白质功能的直接测量，促进生物学风险的降低。
- 提高对候选预后标志物和治疗靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游功能检测制备经过验证的白血病细胞体系。
- 标准化蛋白质丰度及翻译后修饰的定量检测读数。
- 实现对不同患者亚群间差异表达蛋白的可重复鉴定。
- 支持在细胞迁移、黏附和肌动蛋白聚合实验中对候选靶点进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 将蛋白质组学发现与原发性慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中与疾病相关的功能表型进行关联。
- 实现从分子发现到预后标志物临床前验证的连贯性。
- 为推进候选靶点进入转化研究的风险调整决策提供依据。
- 加强对于疾病进展机制的理解，以促进生物标志物的合理匹配。
流程与工作流整合
该蛋白质组学工作流程通过整合慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的蛋白质鉴定、功能验证和临床相关性分析，连接了早期发现与转化研究。
- 发现生物学：通过绘制与预后相关的差异蛋白表达图谱，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供标准化的定量结果，用于蛋白丰度和修饰状态的分析。
- 分析：对不同患者组间的蛋白质组谱进行可靠的统计学比较。
- 转化研究：将分子发现与原代细胞中的功能表型及临床结局相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的蛋白质组学和功能分析平台，适用于各类血液系统恶性肿瘤。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点选择的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：提供标准化、可重复的蛋白质组学和功能检测工作流程。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项或终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持对预后标志物和治疗靶点进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质组学、质谱分析和原代细胞操作方面的专业知识。
- 需要具备双向电泳（2DE）、质谱（MS）仪器和流式细胞术设备，用于细胞表征。
- 需要跨团队对样本制备和数据分析流程进行标准化。
- 可能需要针对不同的血液系统肿瘤或实体瘤模型系统进行适应性调整。
- 依赖于特征明确的患者样本的可获得性以及可靠的统计分析。
