Name: 从2DE凝胶点在蛋白质功能：在课慢性淋巴细胞白血病学到HS1 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习使用二维电泳和质谱联用技术，从慢性淋巴细胞白血病患者外周血中分离原代白血病细胞，分析差异表达蛋白，识别预后标志物和治疗靶点，并验证HS1磷酸化状态与临床结局的相关性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢淋巴系统恶性肿瘤研究组、Elisa ten Hacken、Lydia Scarfò、&#160;Massimo Alessio、Antonio Conti、Angela Bachi 以及 Angela Cattaneo。
该项目由意大利癌症研究协会AIRC（研究者资助和分子临床肿瘤学专项计划——5比千项目#9965）资助。
C.S. 和 B.A. 设计了研究，进行了实验，分析了数据并撰写了手稿。M.T.S.B.、U.R.、F.B.、P.R. 协助撰写手稿。P.G. 和 F.C.C. 设计了研究，并提供了患者的样本和临床数据。

注意：所有组织样本均经圣拉斐尔医院（意大利米兰）机构审查委员会批准获取。
1. 人体组织样本与细胞纯化（图1）
注意：白血病性淋巴细胞取自根据Mulligan标准诊断的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的外周血（PB）。 等. 9
1.1）从外周血中分离白血病细胞
<ol>
	<li>使用含肝素钠的真空采血管收集外周血（PB）。</li>
	<li>将血液转移至15 ml离心管中，并按每毫升全血加入50 μL人B细胞富集试剂盒，充分混匀后室温孵育20分钟。</li>
	<li>用等体积的含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释样本，轻轻混匀，然后小心地将血液叠加于Ficoll液面上，注意避免破坏液面界面。Ficoll与稀释后样本的体积比至少为1:2（i.e. 在15 ml离心管中加入4 ml Ficoll和10 ml血液）。</li>
	<li>在室温（20 °C）下以400 × g离心20分钟，不启用刹车。单个核细胞将位于界面处。</li>
	<li>小心吸取界面层以回收细胞，并转移至新离心管中。用PBS洗涤细胞一次，然后在4 °C避光条件下以300 × g离心5分钟。细胞沉淀将位于管底。</li>
	<li>弃去上清液。用手指轻弹离心管，使残留上清液中的沉淀重悬。加入10 ml完全RPMI培养基（RPMI 1640培养基添加10%胎牛血清和15 mg/ml庆大霉素）稀释细胞沉淀，并使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。</li>
</ol>
1.2）纯度评价
注意：所有制备物的纯度必须始终高于 99%。
<ol>
	<li>在FACS管中，将100 μl纯化的细胞悬液与以下抗体（市售；参见材料表）于4 °C孵育20分钟：CD3FITC （5 µl/测试）、CD14PE （5 µl/测试）、CD19ECD （6 µl/测试）、CD16-CD56PC5 （2 µl/测试）、CD5PC7（4 µl/测试）。</li>
	<li>用4 ml PBS洗涤样本（300 x g离心5分钟），并通过流式细胞术检测纯度。在图中检查共表达CD19和CD5的CLL细胞百分比（> 99%），如图1(6)所示。通过检查图中CD3、CD14和CD16-56的百分比（应接近零），确保样本中几乎不含NK细胞、T淋巴细胞和单核细胞。</li>
</ol>
1.3）样品储存
<ol>
	<li>进行蛋白质组学研究时，将 25 × 106 个细胞收集至 1.5 ml 离心管中，在 300 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀冻干 4 小时。保存于 -80 °C 直至使用。</li>
	<li>进行验证实验时，将细胞重悬于完全 RPMI 培养基中（体积取决于所选的具体实验），并继续进行第 4 步操作。</li>
</ol>
2. 双向电泳（2-DE）（图 2）
2.1）等电聚焦电泳（IEF）
<ol>
	<li>用终体积为 380 μl 的 2-DE 缓冲液（344 μl RBthio 溶液（9 M 尿素，10 mM Tris，4% CHAPS），30 μl 65 mM DTT，6 μl 2% IPG 缓冲两性电解质 pH 4-7）溶解 CLL 细胞沉淀。</li>
	<li>将蛋白质样品（1 mg）上样至 18 条 IPG 胶条（pH 4-7），并按照 Conti et al.10 描述的标准程序进行等电聚焦（IEF）。</li>
	<li>将胶条在 2 ml 平衡缓冲液（EB：含 6 M 尿素、30% 甘油、2% SDS 的 50 mM pH 8.8 Tris-HCl 缓冲液）中平衡，加入 2% 新鲜 DTT，室温下振荡孵育 15 分钟。弃去含 DTT 的 EB，加入 2 ml 含 2.5% 碘乙酰胺的 EB，室温下在摇床上继续孵育 15 分钟。</li>
</ol>
2.2）SDS-PAGE
<ol>
	<li>将胶条放在纸巾上干燥，避免触碰凝胶以去除多余的溴化乙锭（EB）。将每条胶条加样至9-16%梯度SDS-PAGE凝胶的上样孔中。在凝胶上方加入少量SDS电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% w/v SDS），以利于胶条的加载。</li>
	<li>加入约5 ml 0.8%琼脂溶液密封凝胶，防止胶条漂浮，然后组装电泳装置并用SDS电泳缓冲液充满。在4 °C条件下，以每块凝胶60 mA的电流电泳4小时。</li>
	<li>从电泳装置中取出凝胶，并将其放入合适的染色盒中。</li>
</ol>
2.3）制备胶的银染法
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>固定剂</td>
			<td>50% Methanol 12% Acetic Acid 
			0,05% Formalin</td>
			<td>2 小时（或过夜）*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤缓冲液</td>
			<td>35% Ethanol</td>
			<td>20 分钟（重复三次）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>致敏处理</td>
			<td>0,02% Sodium Thiosulfate</td>
			<td>2 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤</td>
			<td>H2O</td>
			<td>5 分钟（重复三次）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硝酸银染色</td>
			<td>0,2% Silver Nitrate 0,076% Formalin</td>
			<td>20 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤</td>
			<td>H2O</td>
			<td>1 分钟（重复两次）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>显影液</td>
			<td>6% Sodium Carbonate 0,0004% Sodium Thiosulfate 
			 0,05% formalin</td>
			<td>直至染色达到足够强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>终止反应</td>
			<td>50% Methanol</td>
			<td>30 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>* 蛋白质固定的最短时间为 2 小时</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1.
注意：可通过使用与质谱兼容的银染法染色凝胶来观察蛋白质点11。银染所需的所有溶液均列于表1中。
<ol>
	<li>按照表1中的说明，准备约200 ml的每种溶液/凝胶，并将每种溶液小心加入含有凝胶的染色盒中。所有孵育步骤均在摇床上进行。</li>
	<li>染色完成后，移除终止液，并将凝胶置于1%乙酸溶液中，直至成像前。</li>
</ol>
2.4）凝胶成像与分析
<ol>
	<li>在染色后3天内使用密度计以高分辨率获取图像。</li>
	<li>使用双向电泳凝胶分析软件分析二维蛋白质图谱。 
	注意：该软件可实现快速且可靠的图像比较。
	<ol>
		<li>在上下文菜单中选择“创建新项目”来建立项目。创建文件夹，并通过选择“导入凝胶图像”导入扩展名为 .tif、.png 或 .gel 的凝胶图像。</li>
		<li>将凝胶导入并添加到工作区后，选择待检测的凝胶，然后在菜单中选择“编辑 &gt; 斑点 &gt; 检测”，执行自动斑点检测。</li>
		<li>接下来，在菜单中选择“减除背景”以执行背景扣除。注意：此后可通过定量和/或定性分析，对多个凝胶进行比较，检测其差异或相似性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过MALDI-TOF质谱分析进行蛋白质鉴定（图3）
3.1）蛋白质消化
<ol>
	<li>用清水冲洗凝胶，并通过手动（用洁净的解剖刀切割）或自动切割方式从凝胶中切取目标条带。</li>
	<li>用清水洗涤凝胶颗粒（100-150 μl），离心（400 × g，30 秒），弃去上清液。</li>
	<li>加入等体积（根据凝胶体积而定）的 CH3将CN加入凝胶碎块中，静置10–15分钟，直至凝胶碎块收缩。在真空离心机中干燥凝胶颗粒。</li>
	<li>加入75-100 µl 10 mM 二硫苏糖醇用 50 mM NH 稀释4HCO3 并在37°C下孵育30分钟 56 °C （还原步骤）。再次使用CH缩小胶块3CN，如步骤3.1.3所述。</li>
	<li>加入75-进行烷基化反应100 µl 55 mM 碘乙酰胺用 50 mM NH 稀释成的溶液4HCO3 在室温避光条件下孵育20分钟。</li>
	<li>用 CH 再次收缩凝胶块3用足量的CN溶液覆盖胶粒，具体操作如步骤3.1.3所述。在真空离心机中干燥。</li>
	<li>在含有 25 mM NH₄HCO₃ 的缓冲液中重悬颗粒4HCO3, 5 mM CaCl2,和 12.5 ng/μl 胰蛋白酶的 4 °C 孵育20分钟。使用足量缓冲液以完全覆盖凝胶碎块。移除未被吸收的上清液，加入25 mM NH₄HCO₃4HCO3, 5 mM CaCl2 不使用胰蛋白酶覆盖凝胶。</li>
	<li>将样品放置于 37 °C 至少3小时（肽段消化所需的最短时间）至过夜。</li>
</ol>
3.2）质谱分析（干滴法）
<ol>
	<li>将每份样品各取 1 μl 点样至不锈钢 MALDI 板上，并加入 1 µl 基质 α-氰基-4-羟基肉桂酸（溶于 50% CH3CN 和 0.1% TFA 中）混合。</li>
	<li>在 MALDI–TOF 质谱仪上获取质谱图。每个样品点累计约 200 次谱图，调节激光强度以避免信号饱和或增强信号。通过 Data Explorer 软件处理谱图，步骤如下：
	<ol>
		<li>导入 .dat 文件，选择“process &gt; baseline correction”进行基线校正。使用胰蛋白酶自裂解产物和基质峰进行质量校准：选择“process &gt; mass calibration &gt; manual calibration”，用鼠标左键拖动选择接近 m/z 855.1 和 2163.1 的峰，并选择相应的参考质量，然后在校准窗口中点击“plot”和“apply calibration”。</li>
		<li>调整峰检测阈值（“peak &gt; peak detection”），复制当前谱图（“display &gt; duplicate active trace”），选中新谱图并进行去同位素峰处理（“peak &gt; deisotoping”）。运行宏命令“getpeaklist”，生成用于蛋白质鉴定的质量列表。如有必要，手动去除被误识别为峰的噪声信号，以净化列表，提高鉴定准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 ProFound 和 Mascot 作为搜索引擎，在综合性非冗余蛋白质数据库中进行蛋白质鉴定12。
	<ol>
		<li>所有搜索均使用以下参数：每条肽段允许一次漏切，甲硫氨酸氧化作为可变修饰，半胱氨酸羧氨甲基化作为固定修饰，初始质量误差容限为 50 ppm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞骨架活性检测（图4）
注意：将第1步中纯化的细胞重悬于完全RPMI培养基中（每200 μl含106个细胞）。
4.1）迁移实验。该实验可用于定量分析细胞（淋巴细胞）的迁移能力。使用直径为 6.5 mm、孔径为 5.0 μm 的 Transwell 小室，实验设三个重复。若使用不同类型的细胞，需优化孔径和迁移时间（步骤 4.1.3）。
<ol>
	<li>通过添加准备下室 600 μl 含或不含特定刺激物的完全RPMI即 SDF-1）以分别测量诱导迁移和自发迁移。</li>
	<li>将上室放上并让系统在 37 °C 在培养箱中。</li>
	<li>接种106 细胞200 μl 在上室（总细胞数）中孵育平板，37°C 条件下孵育 4 小时 37 °C 在培养箱中。</li>
	<li>移除上室，收集下室中的培养基，并用 1 ml PBS 清洗下室一次。将 PBS 收集至离心管中。</li>
	<li>离心5分钟，300 × g，弃上清，沉淀重悬于 500 μl PBS</li>
	<li>通过流式细胞术，在采集1分钟的条件下计数迁移细胞的数量。若为单一细胞群体，则无需添加任何表面抗体。通过二维点图分析细胞侧向散射信号及1分钟内检测到的事件数，确定细胞数量，该数值将用于后续计算。</li>
	<li>将迁移指数（MI）计算为： 
	<img alt="Cell migration index equation for quantifying cell movement; formulaic representation in research." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
4.2）黏附实验。该实验可用于测定细胞的黏附能力。请设置三个重复样本进行实验。
<ol>
	<li>在4 °C条件下，将96孔板（平底）每孔加入50 μl的2% BSA-PBS（作为背景对照）或用PBS稀释的1 μg ICAM-1，包被过夜。</li>
	<li>用PBS洗涤板子两次，每孔加入100 μl 2% BSA-PBS，在37 °C孵育1小时以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>同时，将细胞以5 × 106/ml的浓度重悬于完全RPMI培养基中，用1 mM CMFDA绿色细胞示踪剂标记，并在37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>弃去封闭液（步骤4.2.2）后，将1 × 106个细胞/孔加入已包被的孔中，在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>使用ELISA读板仪定量黏附情况（激发滤光片：485 nM，发射滤光片：535 nM）。首先对总加入量（INPUT）进行第一次测量。</li>
	<li>用2% BSA-PBS（每孔200 μl）轻轻洗涤板子4次（x）。每次洗涤后读取一次板子信号（Adhesionx）。</li>
	<li>对每次测量值扣除背景后，计算特异性黏附率（ADHESION）： 
	<img alt="黏附评估公式；黏附计算方程；黏附量与输入量比值乘以100。" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程1"></li>
</ol>
4.3）聚合实验。该比色实验用于定量检测F-肌动蛋白的聚合。请设置三组重复实验。
<ol>
	<li>重悬 1×10^6 个细胞于 100 μl 预热的完全RPMI培养基，并加入特定刺激物（即 α-IgM 20 μg/ml 10分钟</li>
	<li>用以下方法终止反应 400 μl 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次（300 x g 离心 5 分钟， 4 °C).</li>
	<li>弃去上清液，用含 0.2% 皂苷的 PBS 缓冲液对细胞进行透化处理（200 μl在冰上放置 2 分钟。</li>
	<li>用 PBS-皂素 0.1% 洗涤 3 次（100 × g 离心 5 分钟， 4 °C），弃去上清液，重悬于 100 μl PBS-皂苷 0.1%</li>
	<li>用鬼笔环肽-Alexa Fluor 488 染色（3 μg/ml在室温避光条件下孵育30分钟。</li>
	<li>用 PBS-0.1% 皂素洗涤 3 次。弃去上清液，重悬于 300 μl PBS</li>
	<li>通过流式细胞术定量F-actin含量，计算鬼笔环肽（Phalloidin）的平均荧光强度（MFI）。对生成的数据进行一维图分析，以荧光强度为基础绘制直方图，MFI值显示在图形报告中。</li>
	<li>测量F-肌动蛋白聚合（∆ F-actin）如下： 
	<img alt="F-Actin quantification formula, ΔF-actin, MFI_TO/MFI_IgM, static equilibrium equation" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>

<ol><li>Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+are+we+getting+closer+to+understanding+the+pathogenesis+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease.</a> J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).</li>
<li>Rawstron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+B-cell+lymphocytosis+and+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).</li>
<li>Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+B+lymphocytosis+in+the+general+population%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Monoclonal B lymphocytosis in the general population.</a> Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).</li>
<li>Fazi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+population+low-count+CLL-like+MBL+persists+over+time+without+clinical+progression%2C+although+carrying+the+same+cytogenetic+abnormalities+of+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL.</a> Blood. 118, 6618-6625 (2011).</li>
<li>Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+microenvironment+wires+the+natural+history+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in cancer biology. , (2013).</li>
<li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94, 1840-1847 (1999).</li>
<li>Lanham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signaling+via+surface+IgM+is+associated+with+VH+gene+mutational+status+and+CD38+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 101, 1087-1093 (2003).</li>
<li>Wiestner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZAP-70+expression+identifies+a+chronic+lymphocytic+leukemia+subtype+with+unmutated+immunoglobulin+genes%2C+inferior+clinical+outcome%2C+and+distinct+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile.</a> Blood. 101, 4944-4951 (2003).</li>
<li>Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes%2C+B+lymphocytes%2C+and+clonal+CLL+cells%3A+observations+on+the+impact+of+the+new+diagnostic+criteria+in+the+2008+Guidelines+for+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+%28CLL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).</a> Blood. 113, 6496-6497 (2009).</li>
<li>Conti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+study+of+human+cerebrospinal+fluid+following+traumatic+brain+injury+indicates+fibrin%28ogen%29+degradation+products+as+trauma-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers.</a> J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).</li>
<li>Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+silver+staining+protocols+for+high+sensitivity+protein+identification+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization-time+of+flight+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis.</a> Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).</li>
<li>Zhang, W., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProFound%3A+an+expert+system+for+protein+identification+using+mass+spectrometric+peptide+mapping+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information.</a> Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).</li>
<li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+protein+is+differentially+expressed+in+chronic+lymphocytic+leukemia+patient+subsets+with+good+or+poor+prognoses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses.</a> J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).</li>
<li>Muzio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+complexes+with+cytoskeleton+adapters+in+normal+and+malignant+chronic+lymphocytic+leukemia+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells.</a> Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).</li>
<li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+has+a+central+role+in+the+trafficking+and+homing+of+leukemic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells.</a> Blood. 116, 3537-3546 (2010).</li>
<li>Kashuba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukaemia+reveals+a+possible+role+for+kininogen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen.</a> J Proteomics. 91, 478-485 (2013).</li>
<li>Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ongoing+evolution+of+proteomics+in+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The ongoing evolution of proteomics in malignancy.</a> Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).</li>
<li>Ummanni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clinically+relevant+protein+targets+in+prostate+cancer+with+2D-DIGE+coupled+mass+spectrometry+and+systems+biology+network+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文旨在描述一种优化的实验方案，用于鉴定参与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发病机制的分子，尽管该方法也可扩展应用于其他疾病和/或其他类型的样本。16-18通过比较慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者两个亚组的蛋白质组学谱 与 预后不良19我们证实，它们在HS1的磷酸化状态上存在差异，且HS1的活化影响白血病细胞的迁移和黏附能力。
与其他方法相比，本文所述蛋白质组学技术（双向电泳凝胶和质谱）的主要优势在于，它们能够提供细胞蛋白质组的完整图谱，更重要的是，能够提供蛋白质翻译后修饰的相关信息。发生差异磷酸化或糖基化的蛋白质在凝胶中的位置会发生改变，其在细胞中的活性也可能随之改变。
此外，我们描述了用于检测细胞迁移和黏附的实验方案，这些方案可用于评估细胞骨架功能；然而，对于悬浮生长的细胞而言，这类方案的描述仍较为有限，因为它们通常应用于贴壁细胞。例如 伤口愈合）。2DE 和 MS 技术的主要局限性在于所需细胞/蛋白质的数量（≈25 × 106</sup...

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家最常见的成人白血病，起源于单克隆性肿瘤性CD5+ B淋巴细胞的积聚，临床上具有高度异质性。该病可表现为一种前白血病状态，称为单克隆B细胞淋巴细胞增多症（MBL）1,2,3。在其他情况下，疾病可表现为惰性临床过程，可在多年内保持稳定而无需治疗；也可表现为进展性化疗耐药性疾病，尽管接受治疗，预后仍然极差。此外，该病还可能转化为一种常具致死性的高级别淋巴瘤（Richter综合征-RS）2,3,4。患者通常根据一组提供疾病转归和生存预测互补信息的预后因素，分为预后良好和预后不良两大类。临床异质性可能反映了其生物学异质性。已有研究表明，多种遗传、微环境及细胞因素共同参与疾病发病机制，但迄今尚未发现统一的致病机制5。具体而言，多项研究证实，疾病临床进程的差异在一定程度上可通过某些具有预后价值的生物学标志物的存在或缺失加以解释6,7,8。这些数据表明，深入理解疾病的生物学特性，有助于通过识别预后标志物和治疗靶点，为该疾病的临床管理提供新的线索。
本文的目的是展示如何结合不同的蛋白质组学技术，用于鉴定与慢性淋巴细胞白血病（CLL）发生和进展相关的蛋白质。我们的方法表明，可以将基础蛋白质组学数据与临床数据结合起来5。
在本实验流程中，选取部分患者的原代白血病细胞（良好 与 预后不良）的细胞被分离后，制备细胞裂解液以获取蛋白质组图谱。双向电泳（2DE）可对细胞群体的蛋白质组特征进行表征，包括翻译后修饰，从而间接反映每种蛋白质的生物学活性。全细胞裂解液首先基于等电点进行第一维分离，随后在聚丙烯酰胺凝胶上进行第二维分离，依据蛋白质的分子量进行分辨。通过比较蛋白质组图谱，可在凝胶上识别出差异表达的蛋白质（包括丰度变化和翻译后修饰），这些差异蛋白表现为可被切取并经质谱分析的蛋白点。随后可通过多种实验方法进一步探究各候选蛋白的功能。
该方法目前在本文中仅限于慢性淋巴细胞白血病（CLL），但可轻松扩展至其他疾病/样本，从而提供关于两组之间蛋白质组学/生物学差异的信息即 病理的 与 正常，刺激后 与 未刺激的，野生型 与 敲低

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>MERCK</td><td>61830025001730&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>SIGMA</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇</td><td>SIGMA</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>SIGMA</td><td>I6125-25G</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>SIGMA</td><td>223506-25G</td><td></td></tr><tr><td>测序级胰蛋白酶</td><td>ROCHE</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>SIGMA</td><td>T6580</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip&lt;sub&gt;&amp;micro;-C18&lt;/sub&gt;</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18M096</td><td></td></tr><tr><td>人B细胞富集混合液（RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail）</td><td>STEMCELL</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>DOMINIQUE DUTSCHER</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液（Lymphoprep）</td><td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td><td>1114547</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>SIGMA</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07770</td><td>ECD</td></tr><tr><td>CD5</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07754</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07746</td><td>FITC</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>345785</td><td>PE</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07767</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07789</td><td>PC5</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 等电聚焦仪</td><td>GE-Healthcare</td><td>11-0033-64&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>SIGMA</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl缓冲液</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SIGMA</td><td>D9163-5G</td><td></td></tr><tr><td>IPG胶条</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1233-01&amp;nbsp;</td><td>线性pH 4-7，18 cm</td></tr><tr><td>IPG缓冲液</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-6000-86</td><td>pH 4-7</td></tr><tr><td>甘油</td><td>SIGMA</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL 电泳槽</td><td>BIO-RAD</td><td>165-3188</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>INVITROGEN</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>INVITROGEN</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>SIGMA</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>VWR</td><td>631000</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林</td><td>BIO-OPTICAL</td><td>05-K01009</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>9832500</td><td></td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>FLUKA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>FLUKA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Dynamics Personal SI 激光密度计</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageMaster 2D Platinum 5.0</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>MERCK</td><td>A0250292</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Voyager-DE STR</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer 软件（版本 3.2）&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transwell 小室（直径 6.6 mm）</td><td>CORNING</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB2000L</td><td>含 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>SIGMA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>PREPROTECH</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>平底 96 孔板</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>SANTA CRUZ</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Life Technology</td><td>C7025</td><td>绿色</td></tr><tr><td>IgM</td><td>SOUTHERNBIOTECH</td><td>2020-02</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>SIGMA</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td>Alexa Fluor 488</td></tr></tbody></table>

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中hs1蛋白的研究启示

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

肿瘤发生与进展相关分子的鉴定对于理解疾病生物学机制以及患者临床管理至关重要。本文将描述一种优化的蛋白质组学方法，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL）进展过程中涉及的分子。具体而言，白血病细胞裂解液通过二维电泳（2-dimensional Electrophoresis, 2DE）分离，并在2DE凝胶上以“点”的形式显现。通过比较蛋白质组图谱，可识别出差异表达的蛋白质（包括丰度变化和翻译后修饰），这些蛋白点被挑选、分离并经质谱（Mass Spectrometry, MS）鉴定。所鉴定候选分子的生物学功能可通过多种实验方法进行验证即 迁移、黏附和F-actin聚合）的实验方法，我们已针对原代白血病细胞进行了优化。

我们从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血（PB）中分离出原代白血病B细胞，并分析其蛋白质组谱。根据每位患者的临床特征，将样本（n = 104）分为两个主要亚组（预后不良 与 预后良好）并进行了双向电泳凝胶的比较分析。
该分析能够鉴定出两个亚群之间差异表达的蛋白点（基于蛋白点的有无或凝胶上的位置偏移，提示翻译后修饰发生了变化；n ≈ 16）。我们从二维电泳凝胶中切取选定的蛋白点，经还原和烷基化处理后，用胰蛋白酶对蛋白质进行消化，将所得上清液中的肽段点样至MALDI靶板。使用MALDI-ToF Voyager DE仪器采集质谱图谱。所得峰列表提交至MASCOT和ProFound数据库进行检索。在特定质量容差范围内的质谱峰被匹配至数据库中的肽段序列，并拼接成蛋白质序列；若该蛋白质的匹配结果通过特定的概率评分标准，则被认定为已鉴定（图3）。通过该分析，我们鉴定出的蛋白质主要参与细胞骨架活动和代谢过程（未发表数据）。
在这些蛋白中，我们重点关注了造血系细胞特异性蛋白-1（HS1），...

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

肿瘤发生与进展相关分子的鉴定对于理解疾病生物学机制至关重要，并且对于……

以下实验的总体目标是采用整合蛋白质组学方法，鉴定人类疾病中潜在的预后标志物和/或治疗靶点。该目标通过分离来自预后良好或预后不良患者外周血的原代白血病细胞实现，这些细胞同时表达CD19和CD5表面标志物，可用于后续的蛋白质组学分析。白血病细胞裂解物通过双向电泳（2-DE）分离，通过比较蛋白质组图谱，可鉴定出预后良好与预后不良患者之间差异表达的蛋白点，随后可通过质谱（MS）对其进行鉴定。接下来可以采用不同的实验方法，以验证并解析所鉴定出的蛋白质在疾病自然病程中的作用。结果显示，通过两种去糖基化凝胶检测到的HS蛋白不同的磷酸化状态，与患者的临床转归相关。该技术的应用意义延伸至慢性淋巴细胞白血病的治疗领域，因为它有助于识别参与疾病进展的蛋白质，这些蛋白质可被用作预后标志物和/或治疗靶点，本文所述实验流程将为此提供支持。帕梅拉跑向实验室的技术员以及来自外部实验室的一名博士后。在开始此操作之前，使用含肝素钠的真空采血管收集外周血。将血液转移至15毫升离心管中，并按每毫升全血加入50 µL人B细胞富集试剂盒。然后充分混匀，在室温下孵育20分钟。孵育后，加入等体积的含2% FBS的PBS稀释样本，轻柔混匀，小心地将血液叠加到离心管中的分离液界面上，注意避免破坏界面。在室温下以400 × g离心20分钟，无刹车。离心结束后，小心吸取界面层，收集细胞并转移至新的离心管中。离心并去除上清液后，用 PBS 洗涤细胞一次。稀释后，通过手动来回轻弹试管，将沉淀物重悬于残留的上清液中。使用完全 RPMI 培养基，采用台盼蓝排斥法计数细胞。接下来，将以下抗体加入含有100微升纯化细胞悬液的离心管中。在4°C避光条件下孵育20分钟。用4毫升PBS洗涤样本后，通过流式细胞术检测纯度。检测慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的比例，这些细胞表面共同表达 CD19 和 CD5。通过检测图中 CD3、CD14 和 CD16/56 的比例，确认制备物几乎不含 NK T 淋巴细胞和单核细胞，此时这些标记的比例应接近零。用终体积为 380 µL 的双向电泳缓冲液溶解 CLL 细胞沉淀。将一毫克蛋白样品分别加入18条IPG胶条中，进行等电聚焦。电泳结束后，将胶条置于两毫升平衡缓冲液中，在室温下平衡15分钟，缓冲液中添加2%新鲜DTT。弃去该溶液后，加入两毫升平衡缓冲液，其中添加2.5%碘乙酰胺。然后将样品在室温下于摇床上孵育15分钟。随后将胶条放在纸巾上干燥，注意不要触碰凝胶以去除多余的溶液。干燥后，将每条胶条加样至9%至16%的梯度SDS-PAGE凝胶上端。在凝胶上方加入少量 SDS 电泳缓冲液，以利于上样。接着，加入约 5 毫升 0.8% 琼脂溶液密封凝胶，防止胶条漂浮。电泳装置组装完毕后，用 SDS 电泳缓冲液充满电泳槽。然后在4°C条件下，以每块凝胶60毫安的电流运行4小时，或使用冷却系统进行电泳。从电泳装置中取出凝胶后，将其放入合适的染色盒中。每种溶液准备约200毫升。将每种溶液小心加入含有凝胶的染色盒中。所有孵育步骤均在摇床上进行。染色完成后，移除终止液，并将凝胶置于1%乙酸溶液中，直至成像前。对于迁移实验，将先前纯化的细胞重新悬浮。在完全RPMI培养基中，向下层Transwell小室加入600微升含或不含特定刺激物的完全RPMI培养基，以分别检测诱导迁移和自发迁移。将上层小室置于其上，放入37摄氏度培养箱中平衡30分钟。实验结束后，在上室中每200微升加入10的6次方个细胞，并将培养板置于37摄氏度培养箱中孵育4小时。孵育完成后，移除上室，收集下室中的培养基。随后用1毫升PBS将下室洗涤一次。将PBS收集至离心管后，去除上清液，以300 × g离心5分钟。通过流式细胞术，用500 µL PBS重悬样本。采集1分钟后，计数迁移的细胞数量。在二维点图中检查细胞数量，考虑细胞的侧向散射以及在一分钟内观察到的事件数，后者即为用于计算的数值。来自慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的分离原代白血病细胞样本，根据每位患者的临床特征分为两个主要亚群，并通过两种差分电离（DE）和质谱（MS）在特定质量容差范围内进行分析。肽段序列在数据库中进行匹配后，组装成蛋白质；若其通过特定概率评分，则视为已鉴定蛋白质。通过该分析，在这些蛋白质中主要鉴定出参与细胞骨架活动和代谢过程的蛋白质。造血谱系、细胞特异性蛋白质或hs。其中一种蛋白质的差异磷酸化与疾病的临床病程密切相关，且呈差异表达。特别是，携带单个信号点的患者临床预后较差，而具有两个信号点的患者预后良好。携带HS1作为单个信号点的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞，在迁移、黏附和肌动蛋白聚合方面的细胞骨架活性均表现出受损，与低磷酸化的HS1相比尤为明显。单点与双点样本的差异由此解释了其不同的临床行为。观看本视频后，您应能充分理解如何利用蛋白质组学来鉴定参与疾病进展的生物学候选分子，这些分子可作为预后标志物和（或）治疗靶点。

from-2de-gel-spot-to-protein-function-lesson-learned-from-hs1-chronic

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

从2DE凝胶点在蛋白质功能：在课慢性淋巴细胞白血病学到HS1

本方案描述了一种通过深度测序分析淋巴瘤中重排的免疫球蛋白重链VDJ区域的方法，可获取VDJ重排及体细胞高频突变状态，以解析单个肿瘤的克隆结构。通过比较配对的初诊与复发样本之间的克隆结构，揭示淋巴瘤复发过程中的克隆演化模式。...

VDJ-Seq：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析揭示B细胞淋巴瘤的克隆演化模式

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。...

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

现有的算法为生物标志物检测数据集生成单一解决方案。本方案展示了存在多个效果相似的解决方案，并提供了一款用户友好的软件，以帮助生物医学研究人员针对所提出的挑战深入分析其数据集。计算机科学家也可在其生物标志物检测算法中集成此项功能。...

选择具有相似有效二元分类性能的多个生物标志物子集

本文介绍了一项基于欧洲慢性淋巴细胞白血病研究倡议组织（European Research initiative on...

慢性淋巴细胞白血病中的免疫球蛋白基因序列分析：从患者样本到序列解读

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。...

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

利用多步骤培养系统，我们报道了一种体外B细胞向浆细胞分化的模型。...

人正常记忆B细胞体外分化为长寿命浆细胞模型

本文介绍了两种用于表征B淋巴细胞在免疫突触（IS）形成过程中细胞极化事件的方法。第一种方法涉及对细胞器向突触膜募集以及细胞骨架在突触膜处重排的定量分析。第二种为生化方法，用于表征发生向免疫突触极化的中心体在组成上的变化。...

研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学

本方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效制备细胞核与细胞质组分，并对其进行优化。这些样品可用于确定蛋白质的定位，以及在细胞受到刺激或药物处理后，蛋白质在细胞核与细胞质区室之间转运发生的变化。...

原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

本文介绍了一种用于B细胞牵引力显微镜实验的方案。我们描述了软性聚丙烯酰胺凝胶的制备及其功能化方法，以及显微镜下的数据采集和数据分析的概要。...

用于研究B淋巴细胞活化的牵引力显微镜技术

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。...

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

学习使用二维电泳和质谱联用技术，从慢性淋巴细胞白血病患者外周血中分离原代白血病细胞，分析差异表达蛋白，识别预后标志物和治疗靶点，并验证HS1磷酸化状态与临床结局的相关性。

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

探索更多视频