测量时空的Ca 2 +在拟南芥信号
September 2nd, 2014
的 Ca 2 +信号调控植物中不同的生物过程。在这里，我们提出的方法用于监测非生物胁迫诱导的时空钙在拟南芥的细胞，并使用基因编码的钙指标水母发光蛋白或Case12组织2 +信号。
该程序的总体目标是展示一种在细胞和整个植物水平监测钙信号的方法。这是通过首先在 MS 琼脂平板上或直接在成像室中培养幼苗来实现的。第二步是将幼苗转移到胶膜上或将它们保存在成像室中。
接下来对幼苗施加刺激以诱导钙信号。最终，生活方式发光或荧光成像用于分别显示整株幼苗或胞质核钙对不同刺激的反应。与现有方法（例如单株植物发生）相比，该技术的主要优点是薄膜粘附幼苗测定简单、灵敏且稳健。
因此，该技术可以适用于钙信号反应改变的突变体的高通量筛选。此外，与基于平面的钙成像相比，使用基于 GFP 的基因编码钙指示剂避免了复杂的显微镜设置和计算。这种方法提供了对拟南芥应激反应期间钙信号传导的见解，但它也可以用于其他环境，例如在其他植物模型中的开发或防御过程中。
演示这种方法将是闪亮的。我们实验室的学生 要开始此程序，用含有 10% Triton 100 的 0.01% 漂白剂溶液对表达 quain 的兔子 opsis 植物的种子进行消毒，将种子播种在含有全强度 MS 1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的方盘上。接下来，将板垂直放置在生长室中，在 4 摄氏度分层两天后。
然后，将幼苗转移到薄膜上。在板上生长的 7 到 10 天龄的幼苗上贴上一层胶膜。用手轻轻推动薄膜，确保幼苗粘附在薄膜上。
然后轻轻剥开薄膜，使幼苗保持粘附在薄膜上。接下来，通过将 A adhere 幼苗放在含有 15 毫升/毫升 2 微克 HCTZ 的水中方板上，将幼苗与辅因子一起孵育。将幼苗在室温下孵育 4 小时至过夜。
为了准备发光成像，从 HCTZ 溶液中取出胶片，然后将其从中间切成两块。将两片幼苗朝上的薄膜放在两个不同的盘子中。然后将板在黑暗中放置 5 分钟，以便在黑暗中获取发光图像。
将两块板彼此相邻地放在发光成像系统的载物台上。同时向板中加入 20 毫升刺激溶液后立即采集图像。要分析发光图像，请为所有发光图像选择相同的显示范围，裁剪 ROI 并将图像生成为 jpeg 文件。
或者，将图像导出为 SPE 格式文件并将其导入 Image J 图像分析软件。设置用于计算 ROI 平均灰度值的测量值，选择相同大小的 ROI 区域。然后测量平均灰度值并以条形图的形式呈现数据。
准备用于共聚焦成像的幼苗。用含有 0.01% Triton 的 10% 漂白剂溶液对表达情况 12 的 opsis 植物的种子进行消毒。因此，将无菌种子放在含有全浓度 MS 盐、1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的盘子上。
然后将板垂直放置在生长室中，在 4 摄氏度下分层两天。同时，组装一个带有载玻片和盖玻片的成像室。将一块浸过水的棉绒放在载玻片的顶部。
然后将一两个 5 天大的幼苗从板转移到载玻片的中间。然后将小块粘土粘在盖玻片的每个角落，并将盖玻片放在幼苗的顶部，以在盖玻片和载玻片之间形成间隙。之后，将聚乙烯管的一端连接到 1 毫升注射器，并将管的另一端紧邻腔室。
用胶带将管子固定到位，以组装带有有机玻璃室的成像室。在两根聚乙烯管周围涂上一层薄薄的硅脂，然后将涂有涂层的管子压入有机玻璃腔室两侧的通道中。然后在包含管槽的腔室表面涂上一层薄薄的硅脂，并在润滑脂上盖上一张盖玻片以密封腔室开口的一侧。
接下来，将一株五天大的幼苗从盘子中转移到腔室中，并将一块浸过水的棉絮放在幼苗顶部。将硅脂涂抹在腔室的另一个表面上，然后将另一个盖玻片压在顶部以密封。然后，将其中一根管的末端连接到 1 毫升注射器，并保持另一根管的末端打开。
要制备带有腔室盖玻片的成像室，首先用 70% 乙醇对腔室盖玻片进行消毒，然后将其留在罩中，直到以 0.6 毫升或 0.2 毫升全强度 MS 干燥。将含有 1% 蔗糖和 0.5% 战士凝胶的培养基分别放入 2 孔室或 8 孔室的每个孔中。然后对种子进行消毒，将它们直接播种在装有一层薄薄透明凝胶的带腔室的盖玻片上，让它们垂直生长五天。用于图像采集。
使用共聚焦显微镜在采集图像之前，将 200 微升 150 毫摩尔氯化钠、冰冷水或 1 毫摩尔过氧化氢溶液缓慢注入腔室中，以施加应力刺激。应用刺激溶液后立即捕获图像。使用带有 20 x 水浸透镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜。
以 4 秒的间隔收集时间序列图像，激发和发射波长分别为 4 88 纳米和 500 至 550 纳米，AIX 分辨率为 5 12 x 5 12 或使用 Nikon 元件进行图像分析。ROI 围绕每个感兴趣的单元格绘制。使用时间测量对话框测量每个 ROI 中的总强度随时间的变化。
然后导出总强度测量值并在显示的数据图表中进行处理。这是 10 天幼苗的时空钙反应的比较。这里不同的应力刺激是发光的时间序列，幼苗经受 400 毫摩尔甘露醇和 400 毫摩尔 ole 加 1 毫摩尔氯化铜、75 毫摩尔氯化钠和 75 毫摩尔氯化钠加 1 毫摩尔氯化铜和 1 毫摩尔过氧化氢或 1 毫摩尔过氧化氢加 1 毫摩尔氯化铜的图像。
上下面板分别是在前 40 秒和第二个 40 秒内采集的发光图像。这是幼苗响应指示的应激刺激的平均发光强度的条形图，此处显示为胞质钙振荡和核钙振荡。作为对盐胁迫的响应，共聚焦图像显示，情况 12 在表达情况 12 的转基因植物的根细胞和叶细胞的细胞质和细胞核中表达。
这张图像出现了，叶绿体的红色、自发荧光和案例 12 的绿色荧光的图像。这两个图显示了盐胁迫诱导的胞质溶胶（根细胞核）中的钙振荡。在尝试此过程时，重要的是要记住使用生长良好的幼苗。
观看此视频后，您应该对如何在蜂窝和整个植物级别监测 dynas 有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种方法，用于监测拟南芥植物在非生物应激下的钙（Ca2+）信号。该技术利用基因编码的Ca2+指示剂来可视化钙水平的空间和时间变化。
研究的主要组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 细胞信号传导
- 非生物应激反应
背景
- 钙信号对于植物的各种生物过程至关重要。
- 了解Ca2+动态可以帮助阐明植物对环境应激的反应。
- 基因编码的指示剂提供了一种可视化这些信号的新方法。
- 与该技术相比，现有方法可能缺乏灵敏度或稳健性。
研究目的
- 展示一种监测植物钙信号的可靠方法。
- 评估细胞和整个植物对非生物应激的反应。
- 改进现有的研究Ca2+信号传导的技术。
使用的方法
- 幼苗在MS琼脂平板上或成像室中生长。
- 幼苗转移到粘附膜上进行成像。
- 通过特定的刺激诱导钙信号。
- 发光或荧光成像捕捉钙响应。
主要结果
- 该技术有效地在细胞和整个植物水平上可视化钙响应。
- 与传统方法相比，它表现出高灵敏度和稳健性。
- 响应因所施加的刺激类型而异。
- 结果有助于通过钙信号了解植物应激反应。
结论
- 这种方法为研究植物中的钙信号传导提供了一个强大的工具。
- 它增强了对植物如何响应非生物应激的理解。
- 研究结果可能为未来关于植物适应性和韧性的研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring spatial and temporal Ca2+ signals in plant systems supports target validation in agrochemical discovery by linking stimulus-specific responses to molecular mechanisms. The method enables phenotypic screening of mutants with altered calcium signaling, providing mechanistic de-risking for compounds targeting stress response pathways. Quantitative, reproducible readouts at tissue and cellular levels improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking Ca2+ flux patterns to specific abiotic stimuli and downstream signaling cascades.
- Operational Value: Enables functional validation of ion channels and transporters as drug targets through stimulus-specific response profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that modulate specific Ca2+ signatures associated with desired phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares disease-relevant biological systems for downstream screening by establishing baseline Ca2+ dynamics in wild-type and mutant lines.
- Operational Value: Delivers standardized, robust luminescence and fluorescence outputs suitable for high-throughput adaptation.
- Scalability: The FAS luminescence system allows simple, sensitive tissue-level monitoring compatible with multi-well formats for mutant screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by demonstrating conserved Ca2+ signaling mechanisms across stress conditions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target modulation of Ca2+ handling versus off-target effects.
- Biomarker Alignment: Cytosolic and nuclear Ca2+ oscillations serve as quantifiable pharmacodynamic readouts for pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative refinement of compounds based on Ca2+ signaling phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how genetic or chemical perturbations alter stimulus-specific Ca2+ spatiotemporal patterns.
- Screening: Provides assay readiness through stable transgenic lines expressing compartment-targeted Ca2+ indicators, ensuring reproducible signal detection.
- Analytics: Generates quantitative luminescence intensity and ratiometric fluorescence readouts that enable comparison across genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Demonstrates continuity from cellular signaling to whole-plant responses, supporting extrapolation to complex physiological outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening diverse chemical libraries or genetic backgrounds under standardized stress paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanism-of-action assignment.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility across laboratories through well-defined imaging protocols and indicator systems.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on Ca2+ signaling fidelity rather than phenotypic anchors alone.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by identifying compounds that produce desired Ca2+ signatures without triggering maladaptive stress responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transformation, confocal microscopy, and luminescence imaging systems.
- Dependent on availability of transgenic Arabidopsis lines expressing aequorin or Case12 and access to plate readers or confocal microscopes.
- Necessitates standardization of stimulus delivery, incubation times, and imaging parameters across users and sites.
- Adaptation to non-Arabidopsis species may require optimization of transformation efficiency and indicator localization.
- Practical limitations include signal bleed-through in autofluorescent tissues and the need for dark-adapted conditions for luminescence detection.
