Name: 测量时空的Ca 2 +在拟南芥信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习利用基因编码钙指示剂在拟南芥中监测钙信号时空动态的方法。该技术通过发光或荧光成像在细胞及整株水平可视化非生物胁迫响应，为植物逆境生物学研究提供简单、灵敏且稳健的工具。

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我们感谢 B. Stevenson 提供的技术支持，以及 Marc R. Knight 博士提供 Aequorin 转基因品系。本工作由美国国立卫生研究院基金项目 R01 GM059138 资助。

1. 利用FAS系统进行基于水母发光蛋白的Ca2+成像
<ol>
	<li>准备用于生物发光成像的幼苗。用含有 0.01% Triton-100 的 10% 次氯酸钠溶液对表达 Aequorin 的拟南芥种子进行表面灭菌。将灭菌后的种子播种于方形培养皿（10 × 10 cm 带网格的培养皿）中，培养基为含 1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的 1 倍 MS（Murashige 和 Skoog 基本盐混合物）。在 4 °C 下层积处理 2&#160;天后，将培养皿垂直放置于生长培养箱中（图 1A）。</li>
	<li>将幼苗转移至薄膜上。将一张粘性薄膜（图 1B）覆盖在培养皿中生长 7–10 天的幼苗表面，用手轻轻按压薄膜，确保幼苗粘附于其上（图 1C）。然后轻柔剥离薄膜，使幼苗保留在薄膜上（图 1D 和 1E）。</li>
	<li>用辅因子孵育幼苗。将粘附有幼苗的薄膜转移至另一方形培养皿（10 × 10 cm）中，皿内加入 15 ml 含 2 μg/ml h-CTZ（腔肠素）的水溶液。于室温下避光孵育 4 小时至过夜（图 1F）。</li>
	<li>准备进行生物发光成像。将薄膜从 h-CTZ 溶液中取出，沿中线剪成两半，形成两片。将每片薄膜连同幼苗正面朝上分别放入两个不同的培养皿中，静置于暗处 5 分钟。</li>
	<li>采集生物发光图像。在暗环境中，将两个培养皿并排置于生物发光成像系统的载物台上（图 1G），同时向两个培养皿中各加入 20 ml 刺激溶液后立即采集图像。</li>
	<li>分析生物发光图像。所有生物发光图像应使用相同的显示范围。裁剪出感兴趣区域（ROI），并将图像保存为 JPEG 格式文件（图 2A）。或者，将图像导出为 SPE 格式文件，并导入 ImageJ 图像分析软件。设置测量参数以计算 ROI 的平均灰度值。选取相同大小的 ROI 区域，测量平均灰度值，并以柱状图形式呈现数据（图 2B）。</li>
</ol>
2. 活细胞共聚焦 Ca2+&#160;成像
<ol>
	<li>准备用于共聚焦成像的幼苗。用含有 0.01% Triton 的 10% 次氯酸钠溶液对表达 case12 的拟南芥种子进行表面灭菌。将灭菌后的种子播种于含有全浓度 MS 盐、1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的培养基平板上。在 4 °C 下春化处理 2&#160;天后，将平板垂直放置于生长培养箱中。</li>
	<li>搭建成像室
	<ol>
		<li>使用载玻片和盖玻片组装一个成像室（成像室 A）。将一小块吸水后的棉絮置于载玻片中央，然后将一至两株 5 日龄幼苗从平板转移至湿棉絮表面。在盖玻片的四个角粘上小块黏土，将盖玻片盖在幼苗上方，使盖玻片与载玻片之间形成一个间隙（成像室）（图 3A，左图）。将聚乙烯管（直径 0.58 mm）的一端连接至 1 ml 注射器，另一端紧邻成像室放置，并用胶带固定管路位置（图 3A，右图）。</li>
		<li>使用有机玻璃成像室（成像室 B）组装成像室。
		<ol>
			<li>在两根聚乙烯管（直径 0.58 mm）周围涂上一层薄硅脂，然后将涂有硅脂的管子压入有机玻璃成像室两侧的槽道中（图 3B 左图）。在成像室带有管槽的一侧表面涂上一层薄硅脂，然后将盖玻片压入硅脂中，以密封成像室开口（切口）的一侧。</li>
			<li>将一株 5 日龄幼苗从平板转移至成像室内，并在幼苗上方放置一块吸水后的棉絮。在成像室另一侧表面涂上硅脂，再压上另一块盖玻片进行密封。将其中一根管的一端连接至 1 ml 注射器，另一根管的末端保持开放（图 3B 右图）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用带腔室的盖玻片（成像室 C）制备成像室。用 70% 乙醇对带腔室的盖玻片进行灭菌，并置于超净台中晾干。分别向 2 孔或 8 孔腔室的每个孔中加入 0.6 ml 或 0.2 ml 含 1% 蔗糖和 0.5% Phytagel 的全浓度 MS 培养基（图 3C 右图）。对种子灭菌后，直接将其播种于含有薄层透明凝胶的带腔室盖玻片中，并垂直培养 5 天（图 3C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜采集图像。为施加胁迫刺激（如盐、低温或过氧化氢），在图像采集前，缓慢向成像室（成像室 A 或 B）注入约 200 μl 的 150 mM NaCl 溶液、冰冻水或 1 mM H2O2 溶液；或分别向 2 孔或 8 孔腔室的孔中轻轻加入 500 μl 或 100 μl 刺激溶液。使用配备 20X 水浸物镜（数值孔径 0.75）的倒置 Nikon A1R 共聚焦激光扫描显微镜，在刺激施加后立即采集图像。以 4 秒间隔采集时间序列图像，激发波长和发射波长分别为 488 nm 和 500 - 550 nm，像素分辨率为 512 x 512。</li>
	<li>图像分析 
	使用 Nikon Elements 软件，在每个感兴趣细胞（或区域）周围绘制感兴趣区域（ROI）。通过“时间测量”对话框（也可使用 ImageJ）测量每个 ROI 随时间变化的总荧光强度。将强度数据导出并在 DataGraph 中进行处理。Ca2+ 尖峰振幅定义为峰值强度减去静息强度，持续时间定义为尖峰起始至结束的时间，周期定义为两个相邻尖峰峰值之间的时间间隔。采用 t-检验比较均值差异。</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
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<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已展示了一种用于记录拟南芥幼苗时空Ca2+响应的FAS系统。该FAS Ca2+记录系统提供了一种简单、灵敏且稳健的方法，除本文所展示的非生物胁迫刺激外，还可适用于测量由多种其他刺激引发的Ca2+动态变化。利用该系统，我们可以在全植株水平上轻松比较组织或刺激特异性的时空Ca2+动态。FAS系统的高灵敏度允许使用低强度刺激来检测Ca2+响应，这对于避免使用高强度胁迫时因细胞物理损伤而产生的假象至关重要。7至10天大的拟南芥幼苗表现出组织或刺激特异性的Ca2+响应，尽管处于不同生理阶段的幼苗对同一刺激的响应可能具有不同的敏感性和特异性。因此，建议使用7–10天大的幼苗以提高FAS测量的通量，在此条件下约100株幼苗可粘附于一张薄膜上。结合操作简便、高灵敏度和良好重复性，FAS系统还可用于筛选EMS诱变后Ca2+响应发生改变的突变体。在筛选过程中，确保幼苗生长均匀且在培养板上状态良好并牢固粘附于薄膜上至关重要。粘附有幼苗的薄膜与h-CTZ孵育4至5小时&#160;通常足以完成腔肠素的重建。...

植物细胞通过协调细胞活动的信号转导来响应环境变化。在环境刺激下，早期的细胞信号事件是瞬时的 Ca2+ 浓度升高。游离 Ca2+ 浓度瞬时升高的模式或特征，由其幅度、频率和持续时间来表征。不同的时空特异性 Ca2+ 信号特征可调控不同的细胞活动1。特定刺激（如高温、低温、盐胁迫、干旱、光照或植物激素）可能精细调节定位于膜上的 Ca2+ 通道和/或转运蛋白的时空活性，从而产生特异性的 Ca2+ 信号特征。尽管 Ca2+ 转运蛋白已被广泛研究，但植物中 Ca2+ 通道的分子身份及其功能仍知之甚少1。针对应激刺激下 Ca2+ 响应发生改变的突变体进行遗传筛选，可能是鉴定构成 Ca2+ 信号组分的有效方法。近年来，已开发出多种基于水母发光蛋白（Aequorin）的 Ca2+ 检测系统，有助于开展针对病原体侵袭和非生物胁迫响应中 Ca2+ 信号组分的遗传筛选2-4。
早在20世纪90年代初，Aequorin即被用于检测植物中的Ca2+信号5。此后，Aequorin已被靶向至不同的细胞区室，如细胞质5、细胞核6、叶绿体7、液泡膜8、线粒体9和基质10，以及根部的不同细胞类型，以监测特定细胞的Ca2+信号11。基于Aequorin的Ca2+测量可揭示细胞群体对胁迫刺激产生的时空Ca2+响应。然而，在大多数情况下，响应组织中单个细胞的Ca2+响应是不同步的4。因此，Aequorin记录的Ca2+信号并不一定反映单个细胞内的Ca2+信号。近年来，基于遗传编码的荧光蛋白（FP）的Ca2+探针，如黄色彩虹蛋白（YCs）12和CASEs1213，已被用于以高亚细胞分辨率研究Ca2+信号传导。YCs是一类基于荧光共振能量转移（FRET）的Ca2+探针，包含通过Ca2+结合蛋白钙调蛋白（calmodulin）及其结合肽M13连接的CFP和YFP变体。当钙调蛋白结合Ca2+时发生构象变化，使CFP与YFP彼此靠近，从而增强能量转移（FRET增强）。随时间变化的FRET水平大致以YFP与CFP信号强度的比值计算，可反映细胞内Ca2+动态变化。已有多种YC版本应用于植物研究。YC3.6已被靶向至细胞质14,15、细胞核16、线粒体17和质膜18，YC4.6和D4ER被靶向至内质网15,19，D3cpv则被靶向至过氧化物酶体20。表达YCs的转基因植物可实现对不同类型细胞中不同细胞区室内Ca2+动态的活细胞成像。CASEs（推测为Calcium sensor）是一类包含钙调蛋白及钙调蛋白结合肽M13的单个环状重排荧光蛋白（cpFPs）。当结合Ca2+时，CASEs发生构象变化，导致荧光强度增加。CASE荧光响应与Ca2+浓度之间的相关性使得细胞内Ca2+动态可被定量测定。Case12变体在Ca2+饱和状态下荧光强度提高12倍。N. benthiminana植物瞬时表达Case12或拟南芥植物稳定表达Case12已被用于研究防御反应及非生物胁迫中的Ca2+信号传导4,21。基于Case12的Ca2+成像揭示了病原体攻击或脱水胁迫下细胞中异步的空间和时间Ca2+振荡现象。
本文详细介绍了基于Aequorin的拟南芥幼苗组织和刺激特异性Ca2+动态的发光成像方法，以及表达Case 12的拟南芥根细胞中细胞质和细胞核Ca2+动态的共聚焦成像方法。FAS的发光成像技术可进一步拓展，用于分析完整植株或未在此描述的组织中由胁迫诱导的Ca2+动态，或用于筛选经诱变处理的拟南芥群体中胁迫诱导Ca2+信号发生改变的突变体。活细胞Ca2+成像系统也可通过使用其他Ca2+探针，适配于分析不同亚细胞区室或不同类型细胞中的Ca2+动态。

<table><tbody><tr><td>10 cm x 10 cm 方形培养皿</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>粘性封口膜</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>硅脂</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>双孔腔载玻片&amp;nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>八孔腔载玻片</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>发光成像系统</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>倒置共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Elements&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 为最新版本</td></tr><tr><td>腔肠素</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>通用漂白剂</td><td>任意本地商店</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS 盐</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>植物凝胶</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

测量拟南芥植物中的空间和时间ca2+信号

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

发育和环境信号会诱导植物细胞内产生 Ca2+ 波动。细胞内的 Ca2+ 结合蛋白可感知特定刺激所引发的时空特异性 Ca2+ 模式，并启动 Ca2+ 信号级联反应。然而，目前我们对这些特定刺激如何产生特异性的 Ca2+ 信号仍知之甚少。Ca2+ 信号的特异性可能源于在特定刺激下，Ca2+ 通道和/或转运蛋白活性受到的精密调控。为了鉴定这些细胞组分并理解其功能，至关重要的是采用能够在组织和细胞水平上灵敏且稳健地记录 Ca2+ 信号的系统。靶向不同细胞区室的基因编码 Ca2+ 指示剂为活细胞共聚焦成像观察细胞内 Ca2+ 信号提供了平台。本文中，我们描述了两种 Ca2+ 检测系统的使用方法：基于 aequorin 的 FAS（film adhesive seedlings，薄膜粘附幼苗）发光 Ca2+ 成像系统，以及基于 Case12 的活细胞共聚焦荧光 Ca2+ 成像系统。利用 FAS 系统进行发光成像可在组织水平上简便、稳健且灵敏地检测时空 Ca2+ 信号；而利用 Case12 进行活细胞共聚焦成像则可高分辨率地同时检测细胞质和细胞核内的 Ca2+ 信号。

甘露醇、NaCl 和 H2O2 分别作为脱水、盐胁迫和氧化胁迫刺激的模拟物。为了检测重金属离子 Cu2+ 是否与这三种胁迫刺激中的任何一种产生协同作用，我们比较了在有或无 Cu2+ 存在条件下，每种刺激所引发的 Ca2+ 响应。如图2所示，FAS 发光成像结果显示，拟南芥幼苗对脱水、盐胁迫和氧化胁迫的响应各不相同。在本研究中所检测的刺激浓度下，75 mM NaCl 在暴露的前 40 秒内，在叶片和根中均诱导出最强的 Ca2+ 响应（图2A 中间图和图2B）；而 1 mM H2O2 在暴露的第一和第二个 40 秒内，在叶片和根中均诱导出强烈的 Ca2+ 响应（图2A 右图）。400 mM 甘露醇溶液仅在前 40 秒内在根中诱导出 Ca2+ 响应，在第二个 40 秒内在叶片中仅产生极微弱的信...

Ca2+ 信号调控植物中多种多样的生物学过程。本文介绍了利用基因编码的 Ca2+ 探针 Aequorin 或 Case12，监测非生物胁迫在拟南芥细胞和组织中诱导产生的时空 Ca2+ 信号的方法。

测量拟南芥植物中的空间和时间Ca2+信号

发育和环境信号会诱导植物细胞内产生 Ca2+ 波动。细胞内的 Ca2+ 传感器可感知刺激特异性的时空 Ca2+ 模式。

本实验的总体目标是展示一种在细胞水平和整株植物水平上监测钙信号的方法。首先，将幼苗在MS琼脂平板上或直接在成像室中培养；第二步，将幼苗转移至粘附膜上，或保留在成像室内。接下来对幼苗施加不同的刺激以诱导钙信号。最终分别利用生活方式生物发光或荧光成像技术，展示整个幼苗或细胞质及细胞核内的钙离子响应。该技术相较于现有方法（如单株植物检测）的主要优势在于，薄膜粘附幼苗检测法具有操作简单、灵敏度高且结果可靠的特点。因此，该技术可适用于高通量筛选钙信号响应发生改变的突变体。此外，与基于平面培养的钙成像相比，使用基于GFP的遗传编码钙指示剂可避免复杂的显微镜设置和计算。该方法有助于研究拟南芥在胁迫响应过程中的钙信号传导，也可应用于其他植物模型的发育或防御等其他研究场景。演示该方法的将是 shiny。我们实验室的一名学生将开始此操作：首先，用含有 0.01% Triton 100 的 10% 次氯酸钠溶液对表达 quain 的兔耳芥（rabbit opsis）植物种子进行表面灭菌，然后将种子播种于含有全浓度 MS 培养基、1% 蔗糖和 1.2% 琼脂的方形培养皿中。接着，将培养皿在 4°C 条件下 stratification 处理两天后，垂直放置于生长培养箱中。随后，将幼苗转移至薄膜上。将一张粘性薄膜覆盖在培养皿中生长了7到10天的幼苗上方，用手轻轻按压薄膜，确保幼苗牢固地粘附在薄膜上。然后轻轻剥离薄膜，使幼苗仍附着在膜上。接着，将附着幼苗置于含有15毫升、每毫升含2微克氢氯噻嗪（HCTZ）水溶液的方形培养皿中，以提供辅因子进行孵育。在室温下孵育幼苗4小时至过夜。为进行生物发光成像，将薄膜从HCTZ溶液中取出，并沿中间切割成两片。将两片薄膜分别放入两个不同的培养皿中，确保幼苗朝上。随后将培养皿置于黑暗环境中静置五分钟，以便在暗处采集生物发光图像。将两块培养板并排放置在发光成像系统的载物台上。同时向两块培养板中各加入20毫升刺激溶液后，立即采集图像。分析发光图像时，为所有发光图像选择相同的显示范围，裁剪出目标区域（ROI），并将图像生成为jpeg文件。或者，将图像导出为 SPE 格式文件，并导入 ImageJ 图像分析软件中。设置测量参数以计算 ROI 的平均灰度值，选择相同大小的 ROI 区域。然后测量平均灰度值，并以柱状图形式呈现数据。为共聚焦成像准备幼苗。用含有0.01%吐温的10%次氯酸钠溶液对表达case 12的opsis植物种子进行表面消毒。将消毒后的种子接种于含有全量MS盐、1%蔗糖和1.2%琼脂的培养皿中。在4°C下层积处理两天后，将培养皿垂直放置于培养室中。同时，用载玻片和盖玻片组装一个成像室。将一小块吸有水的棉絮放在载玻片上方。然后将一到两株培养五天的幼苗从培养板转移到载玻片中央。接着在盖玻片的每个角落粘上小块黏土，并将盖玻片盖在幼苗上方，以在盖玻片与载玻片之间形成间隙。之后，将聚乙烯管的一端连接到1 mL注射器上，将管的另一端紧邻观察 chamber 放置。用胶带固定管路，以组装带有聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）腔室的成像室。在两根聚乙烯管周围涂上一层薄薄的硅脂，然后将涂覆好的管子压入聚甲基丙烯酸甲酯腔室两侧的通道中。接着，在含有管槽的腔室表面涂上一层薄薄的硅脂，并将盖玻片放置于硅脂上，以密封腔室的一侧开口。接着，将一个培养五天的幼苗从培养皿转移到观察室中，并在幼苗上方放置一块浸透水的棉絮。将硅脂涂抹在观察室的另一表面，然后盖上另一块盖玻片以密封。随后，将其中一根管子的一端连接到1毫升注射器上，另一根管子的末端保持开放。 准备带有腔室盖玻片的成像室时，首先用70%乙醇对腔室盖玻片进行灭菌，并将其置于超净台中晾干。随后，向双孔腔室的每个孔中加入0.6毫升、或向八孔腔室的每个孔中加入0.2毫升含1%蔗糖和0.5%凝胶剂的完全MS培养基。然后对种子进行灭菌处理，并将其直接播种于含有薄层透明凝胶的腔室盖玻片上，于垂直方向培养五天，用于图像采集。使用共聚焦显微镜时，在开始采集图像前，向腔室中缓慢注入200微升150毫摩尔氯化钠、冰冻水或1毫摩尔过氧化氢溶液，以施加刺激应力。在施加刺激溶液后立即采集图像。使用配备20倍水浸物镜的倒置共聚焦激光扫描显微镜。以488纳米的激发波长和500至550纳米的发射波长，每隔四秒采集一次图像序列，AIX分辨率为512×512，或使用Nikon Elements进行图像分析。在每个感兴趣细胞周围绘制感兴趣区域（ROI）。通过时间测量对话框，测量每个ROI内随时间变化的总荧光强度。然后将总强度测量值导出并在数据图中进行处理。此处展示了10天幼苗的空间-时间钙响应比较结果。不同的胁迫刺激包括：荧光时间序列，以及幼苗在400毫摩尔甘露醇、400毫摩尔甘露醇加1毫摩尔氯化铜、75毫摩尔氯化钠、75毫摩尔氯化钠加1毫摩尔氯化铜、1毫摩尔过氧化氢，或1毫摩尔过氧化氢加1毫摩尔氯化铜处理下的图像。上图和下图分别为前40秒和后40秒内获取的发光图像。此处为幼苗在所示胁迫刺激下平均发光强度的柱状图，该结果反映了胞质和细胞核内的钙离子振荡。在盐胁迫条件下，共聚焦图像显示，在表达case 12的转基因植株中，case 12在根细胞和叶细胞的胞质及细胞核中均有表达。此图像显示了叶绿体的红色自发荧光和Case 12的绿色荧光。这两个图显示了盐胁迫在根细胞的细胞质和细胞核中诱导的钙振荡。进行该实验操作时，务必使用生长良好的幼苗。观看本视频后，您应能够充分理解如何在细胞水平和整个植株水平上对 dynas 进行监测。

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生物学

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