Name: 策略跟踪Anastasis，A细胞存活的现象，细胞凋亡反转 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习利用活细胞显微成像和生物传感器检测并追踪哺乳动物细胞中的细胞凋亡逆转现象（Anastasis）。该方法可观察细胞从凋亡刺激中恢复的形态和分子变化，为研究细胞存活机制及疾病治疗提供重要工具。

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我们感谢拉尔夫·博尔曼牧师博士和詹姆斯·沃伊尔茨牧师博士建议使用“anastasis”一词来描述细胞凋亡的逆转过程；感谢道格拉斯·R·格林提供了稳定表达细胞色素c-GFP的HeLa细胞；感谢查尔斯·M·鲁丁和埃里克·E·加德纳提供了H446细胞；感谢希瑟·兰姆在视频动画绘制方面的协助；感谢杨怡慧对本手稿提出的宝贵讨论意见。本研究得到了西尔·爱德华·尤德纪念奖学金（H.L.T.）、史哲尔·斯泽托博士纪念奖学金（H.L.T.）、富布赖特基金项目007-2009（H.L.T.）、生命科学研究基金会博士后奖学金（H.L.T.）、美国国立卫生研究院基金项目NS037402（J.M.H.）和NS083373（J.M.H.），以及香港大学教育资助委员会AoE/B-07/99项目（M.C.F.）的资助。汤浩岚是生命科学研究基金会Shurl和Kay Curci基金会的博士后研究员。

1. 活细胞成像用细胞的制备
<ol>
	<li>为便于检测形态学变化，应选择贴壁生长的细胞，例如 HeLa（人宫颈癌）细胞，这类细胞在基质上呈扁平状，更有利于观察细胞膜及细胞内细胞器的改变。 
	注意：在多种哺乳动物细胞中均观察到凋亡逆转现象12,13，包括原代小鼠肝细胞、原代小鼠巨噬细胞、原代大鼠心肌细胞，以及多种细胞系，如人胚胎肾 HEK-293T 细胞、非洲绿猴肾上皮 COS-7 细胞、小鼠心肌 HL-1 细胞、小鼠 NIH 3T3 成纤维细胞、雪貂（Mustela putoris furo）脑 CRL1656 细胞、人皮肤癌 A375 细胞、人睾丸癌 CRL1973 细胞、人小细胞肺癌 H446 细胞、人肝癌 HepG2 细胞、人乳腺癌 MCF7 细胞、人前列腺癌 PC3 细胞和人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞。</li>
	<li>使用无水乙醇预清洗玻璃底细胞培养皿中的玻璃盖玻片，以实现清洁与灭菌。 
	注意 1：建议使用玻璃底培养皿进行高质量微分干涉差（DIC）显微镜观察，以及高倍率共聚焦或落射荧光显微镜观察（见讨论部分）。 
	注意 2：在高倍放大（40X、60/63X 或 100X 物镜，数值孔径 1.3 或 1.4）条件下，使用底部玻璃更薄的细胞培养皿（厚度 0.085–0.16 mm）可提供更长的工作距离，有利于成像（见方案 3）。</li>
	<li>根据细胞类型的不同，玻璃底培养皿在接种细胞前可能需要预先包被多聚赖氨酸（0.1 mg/ml）、胶原蛋白（0.01% 溶液溶于 0.01 M 乙酸）和/或纤连蛋白（5 μg/ml）。 
	注意：不同细胞系需优化包被试剂的种类和浓度。HeLa 细胞可直接贴附于未包被的玻璃表面；然而，某些细胞（如小鼠心肌 HL-1 细胞）无法直接贴附于玻璃表面，必须采用特定的培养与包被方案37。</li>
	<li>在 35 mm 预先包被的玻璃底细胞培养皿中接种约 2–3 × 105 个细胞，并在 37 摄氏度（°C）、5% CO2 条件下培养一天，使细胞融合度达到 80%。 
	注意 1：不同细胞类型的最适细胞密度、培养时间及培养条件可能有所不同。细胞融合度会影响细胞的凋亡反应（见方案 2）。高融合度下，细胞对相同浓度的凋亡刺激可能敏感性降低。 
	注意 2：应避免细胞过度融合，因高密度可能遮蔽单个细胞及其细胞器的形态学变化。</li>
</ol>
2. 凋亡细胞刺激物的应用与去除
<ol>
	<li>使用前，将凋亡诱导剂与37 °C的细胞培养基预先混合。本实验中以乙醇（3.6–4.5% vol/vol）作为凋亡诱导剂。 
	注1：我们已发表和未发表的数据表明，细胞也可逆转由其他凋亡刺激所引发的凋亡过程12,13，例如二甲基亚砜（DMSO，8% vol/vol，24小时）、星形孢菌素（STS，0.5 μM，1小时）和紫杉醇（taxol，1 μM，12小时）。针对不同类型的细胞，需优化诱导凋亡的剂量，以确定能够使群体中大多数细胞发生凋亡的最低有效剂量。 
	注意2：将凋亡诱导剂与细胞培养基预先混合，对于避免细胞对凋亡刺激的暴露不均至关重要。</li>
	<li>在加入凋亡诱导剂之前，对细胞培养皿中的健康细胞群进行成像，以建立基线形态学特征。</li>
	<li>从细胞培养皿中移除原始培养基，然后加入 2 ml&#160;加入预混的凋亡诱导剂至培养皿中，以诱导细胞发生凋亡。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 （或其他正常培养条件）。</li>
	<li>孵育后，通过明场、落射荧光或共聚焦显微镜观察细胞，以监测凋亡特征的进展。 
	注意1：发生凋亡的细胞会表现出凋亡的形态学、生物化学和分子特征，这些特征可通过显微镜和基于荧光的生物传感器进行检测（见方案3和4）。 
	注意2：细胞与不同凋亡诱导剂的孵育时间会因细胞类型、细胞状态（如汇合度和营养状况）以及所施加的死亡刺激剂量的不同而有所差异，可能需要进行仔细的滴定。</li>
	<li>当细胞表现出凋亡特征时，用预热至37 °C（或其他正常培养温度）的新鲜细胞培养基洗涤细胞一次，以去除凋亡诱导剂。 
	注意1：由于凋亡细胞在培养板上的贴附较为松散，因此在添加和移除培养基时需轻柔操作，以免细胞被冲洗掉。 
	注意2：可通过轻柔离心（160 × g，1分钟）从上清液中回收活的悬浮细胞，并将其重新加入培养皿中。</li>
	<li>在 37 °C 条件下，用 2 ml/35 mm 培养皿的新鲜细胞培养基（含 5% CO₂）培养细胞2或者，使用条件培养基（从健康细胞收集的无细胞培养液）以进一步提高凋亡细胞的存活率。 
	注意：用新鲜培养基洗涤并孵育细胞可使&#160;大部分细胞在乙醇暴露后可逆转乙醇诱导的细胞凋亡12,13然而，当细胞暴露于其他凋亡刺激时，可能需要重复此洗涤步骤（见讨论部分）。</li>
</ol>
3. 活细胞显微镜观察
<ol>
	<li>我们建议使用带有环境控制功能（37 °C、 5% CO2用于活细胞显微镜观察。 
	注意：也可使用带有水浸物镜的直立显微镜观察细胞。将物镜直接浸入培养基中以观察细胞。然而，在调焦过程中，细胞可能被浸入式物镜压碎。</li>
	<li>成像前至少提前2小时预热显微镜（如环境控制腔室、载物台培养箱和物镜加热器）。 
	注意：这能使显微镜组件达到热平衡，从而避免因组件热胀冷缩导致的焦距漂移和x-y平面偏移。</li>
	<li>将培养的细胞置于35 mm玻璃底培养皿中（见方案1），放置于倒置显微镜载物台上，使用数值孔径（N.A.）为1.3或1.4的40X或63X平场复消色差物镜，透过玻璃盖玻片从培养皿底部对细胞进行成像。 
	注意：避免使用超过 2 ml&#160;将培养基加入35 mm玻璃底培养皿时，应避免过量，因为培养基的重量可能导致玻璃底部弯曲，从而难以在同一焦平面上对细胞区域进行成像。</li>
	<li>在整个成像过程中，将细胞维持在37 °C或相应的正常温度下。 
	注意：细胞凋亡过程以及可能的凋亡逆转过程依赖于温度敏感的酶活性。因此，需将细胞维持在37 °C（例如 在整个实验过程中，使用显微镜载物台培养箱保持恒定温度至关重要。温度降低可能会减缓细胞凋亡反应以及去除凋亡刺激后的恢复反应。</li>
	<li>使用湿度控制装置，或在培养皿上覆盖一层透明膜（见材料），以减少培养基中水分的蒸发损失。 
	注意：锡箔可能会干扰微分干涉差显微镜（DIC）中光的偏振。通过调节光路中的偏振器来恢复偏振状态。</li>
	<li>通过在5% CO₂中孵育，将细胞培养基的pH值维持在6.8–7.3范围内2 使用显微镜配备的环境控制培养室。 
	注意：通过添加 HEPES 缓冲液，或使用商用 CO₂ 培养箱，也可维持培养基中的 pH。2-不含血清的培养基&#160;（参见材料部分）。最佳条件可能因细胞类型不同而有所变化。</li>
	<li>在成像过程中尽量减少荧光/激光（激发光强度）对细胞的暴露，以避免光毒性；可通过将荧光强度降低至获得细胞/亚细胞结构或表达的生物传感器高质量图像所需的最低水平来实现（详见方案4）。</li>
</ol>
4. 凋亡事件期间及之后检测和追踪逆凋亡的策略
<ol>
	<li>质膜起泡、胞质浓缩、细胞皱缩和凋亡小体形成（参见&#160;图1A-C，E).
	<ol>
		<li>采用延时活细胞微分干涉差（DIC）或相差显微技术，对一群健康细胞进行追踪，观察其细胞形态（活细胞显微技术参见方案3，讨论部分参见“讨论”）。 
		注意 1：降低微分干涉差（DIC）/相差成像光源的强度，以避免对细胞产生光毒性。 
		注意2：如果无法使用微分干涉相差（DIC）显微镜和相差显微镜，可使用CellTracker染色细胞质，以在共聚焦或落射荧光显微镜下显示活细胞的形态，并监测细胞形态变化。</li>
		<li>加入细胞死亡刺激物，以诱导细胞发生凋亡（有关凋亡刺激物的施加与去除，参见方案2）。</li>
		<li>观察经处理的细胞，寻找细胞凋亡的形态学特征，例如细胞膜出泡、细胞质浓缩、细胞皱缩以及凋亡小体形成（图1A、1B、1C、1E).</li>
		<li>洗去诱导死亡的刺激物，并在细胞表现出凋亡的形态学特征时，用新鲜培养基重新培养细胞。 
		注意1：在延时活细胞成像过程中，可通过灌流细胞培养腔室施加细胞死亡刺激物或更换细胞培养基，也可在成像间隔期间，通过小心移液（避免触碰培养皿）直接在细胞培养皿中进行。 
		注意2：在更换细胞培养基后，由于显微镜系统热平衡丧失，可能导致细胞失焦，此时应使用焦点漂移补偿系统以避免此问题（见讨论部分）。</li>
		<li>通过连续时间延时成像追踪表现出凋亡特征的细胞命运。经历凋亡逆转的细胞可修复损伤并恢复正常的扁平形态（图1A、1B、1C、1E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体断裂、DNA/染色质凝聚以及细胞核断裂（参见 图1D、1F、1G).
	<ol>
		<li>为观察线粒体，将细胞在培养基中与50 nM MitoTracker Red/Deep Red/Green荧光染料以及10 μg/ml Hoechst 33342蓝色核染料共同孵育20分钟，条件为37 °C、5% CO₂。2. 
		注意1：根据需要降低染料浓度和孵育时间，以避免细胞毒性并减少背景荧光。优化染色条件，以最少的染料用量和最短的孵育时间获得良好的信噪比。 
		注2：使用MitoTracker等线粒体荧光染料&#160;红CMXRos，MitoTracker&#160;深红色荧光染料，或线粒体示踪剂&#160;Green FM，该染料在细胞凋亡期间不会从线粒体中泄漏。这使得能够在细胞凋亡及anastasis过程中观察线粒体形态。有关这些染料的详细信息，请参见材料与设备表。</li>
		<li>将染色后的细胞避光保存，以避免光漂白。</li>
		<li>用37 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液或新鲜细胞培养基洗涤细胞3次，每次在新鲜培养基中孵育1分钟，以去除多余的染料；最后一次洗涤前，在新鲜培养基中继续孵育20分钟，使细胞内过量的染料充分排出，从而降低成像时的非特异性信号背景。 
		注意：染色后用细胞培养基孵育的时间过短可能导致成像背景过高。</li>
		<li>采用实时活细胞共聚焦显微镜或落射荧光显微镜对施加凋亡诱导前的健康细胞进行成像（活细胞显微镜操作详见方案3）。 
		注意：在大多数细胞类型中，健康细胞表现出管状线粒体和圆形细胞核图1D、1F、1G).</li>
		<li>诱导细胞发生凋亡（有关凋亡刺激物的应用及去除，请参见方案2）。</li>
		<li>继续进行活细胞延时显微成像，以观察在向细胞施加死亡刺激后线粒体和细胞核形态的即时变化。观察细胞是否出现凋亡的典型特征，例如线粒体断裂和肿胀、染色质浓缩以及细胞核碎裂，而健康细胞则表现为管状线粒体和圆形细胞核。</li>
		<li>当细胞表现出凋亡特征时，用新鲜培养基洗涤并更换培养基，继续进行延时成像以追踪细胞命运。逆转凋亡的细胞将恢复正常的线粒体和细胞核形态（图1D, 1F, 1G). 
		注意：在可能的情况下，同时进行微分干涉差（DIC）显微镜观察，以通过检测同一细胞群体的形态学变化获取有关细胞凋亡阶段的额外信息（参见第4.1节了解DIC显微镜操作步骤）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞色素c线粒体释放的检测 c 使用稳定表达细胞色素的细胞 c-GFP 融合蛋白（参见 图2).
	<ol>
		<li>对稳定表达细胞色素的细胞进行染色 c-GFP 23,24 使用MitoTracker Red标记具有极性的细胞线粒体（活细胞线粒体染色步骤详见4.2.1至4.2.3）。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜或落射荧光显微镜进行活细胞实时成像，以追踪健康细胞（活细胞成像详见方案3）。 
		注意：细胞色素 c-GFP 信号主要定位于健康细胞的线粒体中（图2Ai，2B).</li>
		<li>诱导细胞发生凋亡（有关凋亡刺激物的应用及去除，请参见方案2）。继续进行活细胞成像以观察细胞色素c的转位 c-GFP 从线粒体到细胞质图2Aii-iii, 2B). 
		注意：线粒体释放细胞色素 c 进入细胞质是线粒体外膜通透化（MOMP）的标志4线粒体依赖性凋亡中的一个关键步骤21,22</li>
		<li>当细胞表现出细胞色素 c- 观察到细胞质中的GFP信号后，移除细胞死亡刺激物，并用新鲜培养基替换（见方案2）。继续进行延时成像，以追踪具有细胞质GFP信号的细胞命运。 
		注意：发生凋亡逆转的细胞会恢复正常的细胞形态，并降低胞质中的细胞色素c水平 c-GFP信号可能通过降解或重新转位回线粒体而消失图2Aiv-vii, 2B).</li>
		<li>并行采集微分干涉相差（DIC）图像，以通过观察单个细胞或细胞群体形态学变化获取有关细胞凋亡阶段的额外信息（详见方案4.1中的DIC显微镜操作步骤）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用半胱天冬酶生物传感器检测半胱天冬酶活性（参见 图3)
	<ol>
		<li>用 caspase 生物传感器 NES-DEVD-YFP-NLS 转染细胞，转染 16 至 24 小时后给予细胞凋亡刺激13.</li>
		<li>使用Hoechst 33342对转染的细胞进行染色以标记细胞核（活细胞核染色步骤详见4.2.1至4.2.3）。</li>
		<li>采用实时活细胞共聚焦或落射荧光显微镜技术追踪健康细胞（活细胞成像详见方案3）。 
		注意：由于核输出信号（NES）的存在，NES-DEVD-YFP-NLS 生物传感器信号主要定位于健康细胞的细胞质中（图3A、3Bi和3C，参见讨论部分）。</li>
		<li>诱导细胞发生凋亡（有关凋亡刺激物的施加与去除，请参见方案2）。继续进行活细胞成像以观察YFP的核转位。 
		注意：caspase 的活化会切割 caspase 生物传感器 NES-DEVD-YFP-NLS 中的 DEVD 基序，导致 YFP-NLS 从细胞质易位至细胞核图3A，图3Bii-iv，参见讨论部分）。</li>
		<li>当细胞显示出细胞核内的YFP时，移除凋亡刺激，并为细胞提供新鲜培养基（参见方案2）。 
		注意：发生凋亡逆转的细胞可恢复正常的细胞形态，但会保留细胞核内的YFP信号（图 3Bv-x， 细胞1和2，以及3D。</li>
		<li>继续进行延时成像，以追踪显示细胞核 YFP 的细胞命运。 
		注意：细胞逆转凋亡数小时后，细胞核内的YFP信号将逐渐减弱图3B，vi-x，细胞1，见结果与讨论）可能通过蛋白酶体降解等正常的细胞清除机制实现。</li>
		<li>平行采集微分干涉相差（DIC）图像，通过观察单个细胞或细胞群体形态学变化，获取用于评估凋亡阶段的额外信息。（DIC显微成像详见方案4.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞表面磷脂酰丝氨酸的暴露（参见 图4)
	<ol>
		<li>将种子细胞接种于玻璃盖玻片上，使其达到80%融合度（参见方案1）。</li>
		<li>用红色荧光MitoTracker和蓝色Hoechst 33342分别对线粒体和细胞核进行共染色（活细胞线粒体和细胞核染色步骤详见4.2.1至4.2.3）。</li>
		<li>使用凋亡诱导剂诱导细胞发生凋亡（参见方案2）。</li>
		<li>在去除凋亡诱导前，加入荧光标记的膜联蛋白 V（见材料表），37 °C 孵育 10 分钟以标记凋亡细胞&#160;诱导剂，用于检测凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸的暴露。 
		注意1：健康细胞不会被V型膜联蛋白（annexin V）染色，因为磷脂酰丝氨酸通常位于细胞质膜内层。38. 凋亡细胞用annexin V染色，annexin V可结合细胞表面的磷脂酰丝氨酸（图4A和图4B). 
		注释2：荧光标记的膜联蛋白V也可在去除凋亡诱导因素后立即用于染色凋亡细胞&#160;诱导剂，孵育10分钟。</li>
		<li>去除细胞死亡刺激物，用预热的PBS或新鲜培养基洗涤染色后的细胞一次，然后在37 °C、5% CO₂条件下用新鲜培养基继续培养细胞2小时。 2 （参见方案2）。 
		注意1：逆转凋亡的细胞恢复正常的形态，并在恢复正常形态后仍保留荧光标记的膜联蛋白V信号图4A和图4B). 
		注2：回收细胞上的annexin V信号随时间延长而减弱（见讨论部分）。</li>
		<li>在选定的时间点，于室温避光条件下，使用含8%蔗糖的4%多聚甲醛（1× PBS配制）固定细胞20分钟。固定后，用PBS洗涤细胞3次以去除多聚甲醛，随后将细胞接种于载玻片上的盖玻片，使用抗荧光淬灭封片剂（见材料）封片，用于共聚焦或落射荧光显微镜观察凋亡细胞去除后细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合蛋白V（annexin V）信号&#160;诱导剂 
		注意1：固定液中的蔗糖可在固定过程中维持细胞膜结构。 
		注意 2：将多聚甲醛溶液置于 4°C 避光保存，以防止降解。&#160; 
		注意3：在将多聚甲醛溶液用于细胞固定前，需将其预热至室温，以避免细胞受到冷休克。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

anastasis 指的是已激活细胞死亡通路的细胞随后逆转死亡过程并存活的现象。在此，我们证明了活细胞成像可用于确认同一个体细胞确实能够在晚期逆转凋亡性细胞死亡过程，并继续存活和增殖。我们的实验方案描述了多种经过优化的细胞类型特异性处理条件，以诱导凋亡，并使大量细胞发生可被多种生物标志物验证的凋亡逆转过程。在技术方面，由于玻璃底培养皿中细胞与物镜之间的薄层玻璃具有高度透光性，允许在高倍率下进行高质量的共聚焦或落射荧光显微观察，提供较长的工作距离，因此我们采用玻璃底培养皿培养用于成像的细胞12,13，便于观察经典的凋亡现象，包括线粒体断裂、细胞色素c释放以及细胞核浓缩和碎裂。此外，玻璃不会扭曲光的偏振状态，因而能够实现高质量的微分干涉差（DIC）显微观察，用于监测凋亡过程中的膜出泡、细胞皱缩及凋亡小体形成。相较于相差显微镜，DIC 显微镜在观察这些凋亡形态学特征方面具有优势，因为 DIC 能增强未染色且透明细胞样本的对比度，从而更清晰地识别细胞形态变化。如果无法获得 DIC 或相差显微镜，可使用 CellTracker 染色细胞质，以在共聚焦或落射荧光显微镜下勾勒活细胞形态，进而监测细胞形态变化。<...

凋亡（希腊语意为“走向死亡”）通常被认为是一个单向过程，最终导致细胞自杀1-7。通过基因手段破坏促死亡基因，可使本应死亡的额外细胞在整体动物中存活下来，包括那些已启动凋亡通路的细胞8,9。类似地，通过基因操作&#160;可使&#160;健康哺乳动物细胞人工展示“吃我”信号，或使其失去与细胞外基质的黏附性，从而分别逃避免疫细胞的全细胞吞噬或细胞间吞噬（entosis）导致的死亡10,11。然而&#160;，我们及其他研究者已证明，在不进行基因操作的情况下，正常的健康哺乳动物细胞及细胞系也能从凋亡的早期阶段恢复12-15。利用单细胞追踪技术，我们进一步证实了细胞可在凋亡晚期阶段恢复12,13，此时细胞已通过通常被认为是“不可逆点”的关键检查点2-6。这些晚期凋亡的检查点&#160;包括线粒体释放细胞色素 c、caspase 的激活、细胞核碎裂以及凋亡小体的形成。我们采用了一个希腊复合词“anastasis”（意为“重获生命”），用来描述细胞在濒临死亡时发生的凋亡逆转现象2-6。
除非通过活细胞成像观察整个凋亡-恢复过程，否则很难区分经历了逆转凋亡（anastasis）的细胞与从未经历凋亡事件的细胞。数十年的研究表明，细胞凋亡过程中典型的形态学特征是由进化上保守的生化和分子事件所驱动的16-19。这些事件通过清除受损或危险的细胞，在单细胞和多细胞生物中调控发育和稳态过程，从而促进细胞的自我毁灭16-19。尽管凋亡细胞可通过标准化的形态学、生化和分子特征明确识别1,5,6,16,20，但目前尚无已知的特异性标记物可用于识别逆转凋亡过程12,13。重要的是，完成逆转凋亡的细胞在外观上表现为正常健康的细胞，而刚刚开始逆转凋亡的细胞则仍呈现为正在死亡的凋亡细胞12,13。因此，亟需开发新的工具，以确切判断某个存活的细胞是否曾经历活跃的凋亡过程。
通常认为细胞凋亡是一种不可逆的级联过程，因为它是一个快速且大规模的破坏过程。尽管某些细胞启动凋亡可能需要数分钟到数天的时间，但一旦线粒体将细胞色素c等促凋亡因子释放到细胞质中21,22，即可在5分钟内激活caspase23,24，随后在10分钟内发生细胞质和细胞核的浓缩25-27，并很快导致细胞死亡25-27。活化的caspase&#160;通过切割并失活关键的结构和功能组分，协调细胞的瓦解过程2,28，例如核酸内切酶抑制剂DFF45/ICAD29,30。caspase还可激活促凋亡因子，如BCL-2家族成员BID，后者转位至线粒体，促进线粒体释放细胞色素c31,32。caspase的活性还会导致磷脂酰丝氨酸在细胞表面暴露，作为“吃我”信号，促进巨噬细胞或邻近细胞通过吞噬作用清除将死细胞33。此外，凋亡事件使线粒体功能受损，破坏细胞的生物能量学和代谢过程34,35,36。因此，从这种破坏中恢复似乎直观上极不可能。
与最初的预期相反，细胞甚至在晚期也能逆转凋亡性细胞死亡过程。通过持续监测培养物中濒死细胞的命运，我们观察到多种原代细胞和细胞系中晚期凋亡具有可逆性12,13。去除死亡刺激后，细胞能够从凋亡的明显特征中恢复，例如线粒体断裂、染色质浓缩、DNA损伤、质膜出泡、磷脂酰丝氨酸在细胞表面的暴露、线粒体细胞色素c的释放、caspase激活、核碎裂、细胞皱缩以及凋亡小体的形成。这些观察结果引发了一系列尚未解答的问题，涉及anastasis（凋亡逆转）的功能、后果及其作用机制。要回答这些问题，前提是能够可靠地识别出已经历anastasis的细胞。本文中，我们描述了活细胞显微镜&#160;技术以及一种caspase生物传感器，用于&#160;检测那些曾逆转晚期凋亡并继续存活的细胞。

<table><tbody><tr><td>LSM780 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>透明 CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 独立培养基</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的膜联蛋白 V</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

追踪复生现象的策略：一种逆转细胞凋亡的细胞存活现象

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis（希腊语意为“起死回生”）指的是濒死细胞的恢复过程。在这些细胞恢复之前，它们已经经历了凋亡的重要检查点，包括线粒体断裂、线粒体细胞色素c释放到细胞质中、caspase的激活、染色质浓缩、DNA损伤、细胞核断裂、质膜出泡、细胞皱缩、磷脂酰丝氨酸在细胞表面的暴露以及凋亡小体的形成。当凋亡刺激在细胞死亡前被移除时，anastasis便可能发生，从而使濒死细胞逆转凋亡过程，甚至可能逆转其他死亡机制。因此，anastasis似乎涉及生理性的修复过程，但也可能不恰当地维持受损细胞的存活。目前anastasis的功能与机制仍不明确，部分原因在于缺乏有效的工具来检测那些看似健康但已恢复细胞的既往凋亡事件。开发用于检测anastasis的策略将有助于研究其生理机制、疾病病理中“不死细胞”可能带来的风险，以及调控anastasis的潜在治疗手段。本文中，我们描述了利用活细胞显微镜和哺乳动物caspase生物传感器&#160;来识别和追踪哺乳动物细胞中anastasis的有效策略。

为了研究细胞凋亡的逆转，首先将组织培养细胞暴露于一种死亡刺激以诱导凋亡。当细胞表现出凋亡的典型特征后，更换新鲜的培养基以清除刺激物，随后继续培养濒死细胞以观察其恢复情况（图1A）。此处所关注的关键问题是：单个濒死的培养细胞在凋亡进程中推进到何种程度后，仍可能发生凋亡逆转（anastasis）。通过以下所述方法，利用生物标志物对细胞命运进行连续监测，可明确回答这一问题。
我们首先介绍利用延时活细胞显微成像技术检测组织培养细胞中凋亡逆转的策略，该技术可用于追踪和记录单个细胞在受到凋亡刺激之前、期间及之后的反应。12,13健康的贴壁细胞在其附着的基质上伸展图1Bi)12,13，治疗前显示出线粒体呈纤维状，细胞核呈圆形图1Ci, Di, Ei, 菲, Gi)12,13在细胞培养基中加入3.8...

“anastasis”一词指的是濒死细胞在细胞自杀过程的晚期逆转该过程，自我修复并最终存活下来的现象。本文中，我们展示了检测和追踪经历anastasis细胞的实验方案。

Anastasis（希腊语“起死回生”之意）指濒死细胞的恢复过程。在这些细胞恢复之前，它们已经经历了重要的……

本实验的总体目标是通过活细胞显微镜检测并追踪培养细胞中细胞凋亡死亡过程的逆转。健康的细胞在基质上铺展，并在细胞核周围含有管状的丝状线粒体。然而，当细胞通过凋亡途径发生程序性死亡时， dying cells 会表现出独特的形态学特征，可用于检测和追踪凋亡的逆转过程。将细胞接种至玻璃底细胞培养皿中。下一步是进行活细胞染色，以标记线粒体和细胞核。这有助于检测健康细胞与凋亡细胞的形态学特征。通过活细胞显微镜观察，将标记的健康细胞暴露于死亡刺激以诱导细胞凋亡。当检测到细胞凋亡时，对正在死亡的细胞进行洗涤，随后在新鲜细胞培养基中孵育，以允许细胞恢复；利用活细胞成像技术检测并追踪细胞凋亡的逆转及其后果，例如分别通过细胞形态恢复和迁移所显示的细胞修复与存活。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，对我们体内清除不需要或危险的细胞具有重要作用。这一细胞合成过程通常被认为不可逆，因为一旦启动，细胞必定会随之死亡。然而，我们发现事实上濒死细胞能够逆转细胞死亡过程，从而存活甚至增殖。在细胞死亡过程中可能存在若干关键步骤，这些步骤过去被认为是不可逆转的临界点，例如细胞色素C的释放、caspase激活、细胞核断裂以及凋亡小体的形成。在咨询了希腊专家后，我们采用了一个术语——anastasis，意为“起死回生”。为了描述细胞凋亡及其他细胞死亡过程的逆转现象，检测凋亡逆转（anastasis）较为困难，因为发生凋亡逆转的细胞在形态上与正常的健康细胞相似。然而，通过连续的活细胞显微成像技术，我们能够在大部分细胞中观察到凋亡逆转的发生。掌握这一技术至关重要，因为它使我们能够研究凋亡逆转的整个过程。我们提出，开花过程可能修复组织损伤，但也可能使受损细胞存活并形成癌症。因此，揭示调控细胞凋亡逆转（anastasis）的机制，可能为我们提供治疗癌症、心力衰竭和退行性疾病等可注射性疾病的全新方法，这些方法通过调控细胞死亡与存活来实现。为了检测和追踪细胞凋亡逆转现象，在发生凋亡事件后，通过延时活细胞显微成像技术，追踪那些在短暂诱导细胞死亡后能够逆转凋亡的细胞。首先，将 1 毫升聚-L-赖氨酸溶液加入带有薄玻璃底的 35 毫米细胞培养皿中。室温孵育 1 分钟以包被玻璃表面后，吸除溶液，并用 2 毫升磷酸盐缓冲液洗涤玻璃表面。在准备细胞时，首先对处于 80% 至 90% 融合度的 HeLa 细胞进行胰蛋白酶消化。待细胞脱落后，加入 10 毫升 37 °C 的培养基以重悬细胞。然后将细胞悬液转移至 10 毫升无菌离心管中，在 160 ×g 条件下离心 1 至 2 分钟。离心后，小心吸除上清液，切勿扰动管底的细胞沉淀。随后用 10 毫升细胞培养基通过轻柔吹打重悬细胞。然后将2 mL悬浮细胞接种到35 mm预先包被的玻璃底细胞培养皿中。在37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中培养一天。可能需要调整细胞数量，以确保细胞在成像时达到80%的融合度。线粒体和细胞核的断裂是细胞凋亡的形态学特征。为观察线粒体和细胞核，在活细胞成像前应进行染色。开始染色步骤时，首先在无菌微量离心管中加入两微升线粒体染料MIT tracker red（50微摩尔储备液）和两微升DNA染料Hoechst 33342（10毫克/毫升储备液）。然后，从细胞培养皿中取出一毫升条件培养基加入该微量离心管中，用移液器充分混匀染料。随后将混合液重新加回培养皿中。将培养皿在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟后，吸去培养基，并用1毫升温热的细胞培养基或磷酸盐缓冲液洗涤染色后的细胞3次。随后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育5分钟。避免染色时间过长，因为过度染色可能导致细胞非特异性背景信号增强。孵育结束后，吸除培养基，再次洗涤细胞，然后加入两毫升细胞培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育细胞。显微镜组件必须达到热平衡，以避免因组件热胀冷缩导致的焦平面漂移和XY平面偏移。为确保达到热平衡，在开始成像前至少两小时开启环境控制腔室和载物台培养箱，将显微镜预热至37摄氏度。然后打开二氧化碳调节器，向环境控制室供应5%的二氧化碳。当无法提供二氧化碳时，可使用不含二氧化碳的培养基来支持细胞生长。成像前，将一滴浸油直接滴加在数值孔径为1.4的40倍物镜上。然后将含有染色细胞的培养皿轻柔地放置于37摄氏度的载物台培养箱中。用透明的冷箔覆盖培养皿，以防止水分蒸发以及样品污染，从而进行微分干涉差显微镜观察。请勿使用塑料培养皿盖，因为塑料可能干扰光的偏振。接下来，定位并聚焦于一群健康细胞，这些细胞在玻璃表面铺展，具有管状线粒体和圆形细胞核。选择培养皿中心位置或靠近中心的细胞，以确保细胞处于相同的焦平面。就位后，通过共聚焦显微镜进行快速曝光，以确定获得细胞及其细胞器清晰图像所需的最低激光强度和曝光时间。此步骤至关重要。由于激光光源对细胞具有光毒性，因此必须进行优化和调整以消除焦平面漂移。可使用基于红外发光二极管的连续自动焦漂补偿装置；或者，也可手动校正焦平面。在确定细胞位置和焦平面后，应优化所有参数并在开始活细胞成像前采集测试图像。然后开始活细胞成像，以每分钟一次的频率连续成像10个周期以诱导细胞凋亡。使用透明移液管移除细胞培养基。将预先与37摄氏度细胞培养基混合的细胞死亡刺激物加入培养皿中。继续用透明培养膜覆盖培养皿。在施加细胞死亡刺激后进行延时成像时，调整成像时间间隔，以观察经处理的细胞，并通过捕获细胞凋亡的形态学特征（如质膜出泡、线粒体断裂、细胞核固缩与碎裂、细胞质浓缩、细胞收缩以及凋亡小体形成）来检测凋亡。一旦观察到细胞凋亡现象，即移除含细胞死亡刺激物的培养基，并加入2毫升新鲜细胞培养基，继续培养细胞。继续进行延时成像，以观察细胞的形态恢复以及复生（anastasis）的结果。在移除细胞死亡刺激后，濒死的人类肺癌 H446 细胞可逆转凋亡过程。尽管这些细胞在复生前表现出凋亡的典型特征，如细胞皱缩、细胞膜出泡、线粒体断裂、细胞核凝聚和碎裂以及凋亡小体形成，但复生后的细胞分裂可能异常。在此示例中，细胞分裂后并未形成两个点状核，而是形成了三个主要细胞核，并伴有微核的出现，表明点状细胞发生了遗传改变。这提示，细胞在受到致死刺激后，回生过程（anastasis）可能具有致突变性。促凋亡因子会转位至线粒体，触发细胞色素C的释放，进而导致凋亡体（apoptosome）的组装以及caspase的激活，最终引发细胞解体和细胞死亡。以下是表达GFP标记的细胞色素C的HELOC细胞，该蛋白在凋亡诱导后定位于线粒体。细胞色素C被释放到细胞质中。然而，在细胞经过洗涤并随后在新鲜培养基中孵育后，细胞质中的细胞色素C水平恢复至正常水平，表明在细胞色素C释放后可能发生逆凋亡（anastasis）。图中显示的是表达基于 CA 的生物传感器 N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S 的 HeLa 细胞。在诱导凋亡后，该传感器首先定位于细胞质，符合预期。由于激活的半胱天冬酶（caspase）切割了 DEVD 序列，Y-F-P-N-L-S 随即转位至细胞核。然而，在去除死亡刺激并用新鲜培养基孵育细胞后，Y-F-P-N-L-S 仍保留在细胞核内，同时细胞恢复正常的形态，表明在半胱天冬酶激活后仍可能发生凋亡逆转。观看本视频后，您应能充分理解如何利用活细胞成像技术检测开花现象及其后续效应。在本演示中，我们使用乙醇作为 ATO 诱导剂。同时，细胞能够逆转由其他死亡刺激因素（如 teso DMSO 和 sporin）所引发的细胞死亡过程。荧光光源对细胞具有光毒性，因此在活细胞成像过程中，最大限度减少光照对样品的热效应至关重要。细胞凋亡及夜间恢复过程依赖于温度敏感性和细胞特异性活性。因此，在整个实验过程中保持细胞温度一致，对于获得可重复的结果至关重要。

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策略跟踪Anastasis，A细胞存活的现象，细胞凋亡反转

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