一种筛选和验证激酶抑制剂耐药突变的方法

本实验的总体目标是鉴定并验证耐药性突变。首先构建靶向癌基因的随机突变文库，随后通过体外筛选获得耐药克隆，从而实现这一目标。

该流程的第三步是对耐药克隆进行测序，以鉴定耐药突变。最后一步是通过定点突变技术重新构建这些突变，并结合体外和体内实验验证其耐药性。最终可鉴定出针对特定药物靶标的具有临床意义的耐药突变。

与现有的 ENU 或基于 PCR 的方法相比，该技术的主要优势在于其无偏性；与基于 PCR 的 METAGENE ssis 不同，该方法不受癌基因大小或任何基因 GC 含量的限制。通常，初学者由于缺乏分子生物学和细胞生物学方面的知识，会遇到困难。因此，对该方法进行可视化演示至关重要。

由于新生和筛选步骤较难掌握，原因是许多人缺乏病毒制备、细胞培养以及半细胞培养基方面的经验。本实验首先将携带JAK2 V617F（JAK2的一种致癌异构体）质粒转化至XL1-Red大肠杆菌细胞中。XL1-Red大肠杆菌细胞的DNA修复机制存在缺陷，因此可在复制过程中引入随机突变。

将50至100纳克质粒DNA与100微升感受态细胞在预冷的聚丙烯管中混合。DNA用量不得超过100纳克，以免降低转化效率。冰上孵育30分钟，每隔5分钟轻柔涡旋，以确保文库覆盖充分。

使用四到六个感受态细胞管。将聚丙烯管浸入42摄氏度的水浴中进行45秒的热激处理，然后在冰上孵育两分钟。接着，向每根管中加入一毫升SOC培养基。

将试管在37摄氏度、225至250转/分钟振荡条件下孵育90分钟。将细胞接种于四个含有100微克/毫升氨苄青霉素的10厘米LB琼脂平板上。将平板在37摄氏度孵育16至24小时。

当菌落可见时，使用无菌细胞刮刀刮取平板上的菌落。将每块平板上的细胞收集到一起。随后，使用商业质粒提取试剂盒提取质粒DNA，并通过测序分析文库中突变的多样性。在转染前一天，将四次10的6次方个HEK 293T细胞接种至含有10% FCS、青霉素、链霉素和2毫摩尔L-谷氨酰胺的DMEM中，置于100毫米培养皿中培养。

次日，为每个 100 毫米培养皿准备转染试剂。使用无血清 DMEM 培养基将 5 微克质粒文库、5 微克逆转录病毒包装质粒和 40 微升 FU 基因混合，总体积为 400 微升。将 DNA 与脂质混合物在室温下孵育 20 分钟。

接下来，将 HEK 293T 细胞的培养基更换为新鲜培养基，并将 DNA-脂质复合物逐滴加入细胞表面。在 37 摄氏度下孵育 6 小时。6 小时后，将转染培养基更换为新鲜培养基，继续在 37 摄氏度下孵育培养板 48 小时，以进行病毒生产。

孵育48小时后，收集经0.45微米Acro圆盘滤器过滤的病毒上清液，用于开始筛选和鉴定耐药性JAK2 V617F突变体。用逆转录病毒上清液转导BAF3细胞。将1亿个BAF3细胞与100毫升病毒上清液混合，用含10%血清和polybrene的RPMI培养基调整至总体积为300毫升。将该细胞与病毒上清液的混合物分装至多个6孔板中，每孔加入4至5毫升。

将培养板在37摄氏度下以1,250 ×g离心90分钟。离心后，于次日在37摄氏度下孵育培养板24小时，收集每个药物浓度下的转导细胞。在50毫升离心管中，将10毫升细胞与鲁索利替尼混合。

本示例中测试的芦可替尼浓度为 1、5、2、0.5 和 10 微摩尔。使用含 20% 血清的 RPMI 培养基将体积补足至 40 毫升。向细胞中加入 10 毫升 1.2% 琼脂糖，轻轻混匀后接种于六孔板中。

每孔加入四毫升。将培养板在37摄氏度下孵育两周。待抗性菌落可见后，使用0.2毫升移液器吸头挑取菌落，并分别进行转接培养。

在24孔板中培养三至四天后，通过离心（450 ×g，室温，5分钟）收集抗性BAF3细胞。使用商用基因组DNA提取试剂盒分离基因组DNA后，通过PCR从基因组DNA中扩增全长JAK2 cDNA。随后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并回收3.4 kb的DNA条带。

使用商业化的凝胶回收试剂盒分离JAK2包被框。最后，利用覆盖编码序列的八个内部引物对全长cDNA进行测序，并使用商业软件分析序列，以验证耐药突变。体外筛选获得的变异体通过定点诱变JAK2 V617F序列产生，并重新导入BAF3细胞中。

向培养板的各个孔中分别加入含有不同浓度鲁索利替尼（ruxolitinib）的50 µL培养基，每孔接种10⁴个BAF3 JAK2 V617F细胞至96孔板中，于37°C孵育60小时。为评估细胞活力，向每孔加入10 µL的WST-1试剂，于37°C继续孵育2至4小时。使用酶标仪在450 nm波长处记录吸光度。所有实验均需设三个复孔，以平均吸光度对鲁索利替尼浓度作图。

使用非线性曲线拟合算法进行最佳拟合的S型曲线分析。以药物浓度导致50%细胞存活率作为细胞IC50，随后按照随附文本方案所述进行耐药突变的体内验证。由于通过随机诱变产生的耐药细胞克隆可能携带多个突变，这些突变必须通过体外和体内实验分别进行单独验证。

在体外实验中，通过定点诱变JAK2 V607F序列生成选定的突变体，并将其重新导入BAF3细胞，随后在不同浓度的鲁索利替尼处理下检测细胞增殖能力，以评估IC50值。此外，对经梯度增加浓度的鲁索利替尼孵育后的BAF3细胞蛋白裂解液进行抗磷酪氨酸或抗磷-STAT5免疫印迹分析，以排除任何脱靶介导的耐药性。在较高鲁索利替尼浓度下表现出IC50值升高及持续自磷酸化的突变体，由此确认为耐药突变体，可用于体内耐药性的验证。

将表达JAK2 V617F突变体和荧光素酶樱桃蛋白（luciferase cherry）的BF三细胞注射入小鼠体内，随后对小鼠注射芦可替尼持续两周。两周后，通过检测荧光素酶催化的生物发光信号来成像，并通过测定樱桃阳性细胞的荧光来评估骨髓和外周血中BAF三嵌合体的比例。

结果显示，表达 JAK2 V617F 的小鼠对鲁索利替尼敏感，而耐药突变体在治疗期间表现出生物发光信号的持续增加。一旦掌握，若操作得当，随机新生可在四到五天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何针对任何药物靶点组合，构建用于体外筛选的随机化质粒DNA文库。

请注意，操作逆转录病毒可能具有极高的危险性。进行此操作时必须始终采取预防措施。