对于耐药性突变对激酶抑制剂的筛选和验证方法
December 7th, 2014
针对激酶抑制剂治疗遗传性的出现带来了有效的癌症治疗显著的挑战。对新开发的药物鉴定和耐药突变特性有助于更好的临床管理和下一代药物设计。在这里，我们描述了体外筛选及耐药突变的验证协议。
该程序的总体目标是识别和验证耐药突变。这是通过首先创建目标癌基因的随机突变文库来实现的。第二步是进行体外筛选，以发现耐药性克隆。
该程序的第三步是对耐药克隆进行测序以识别耐药突变。最后一步是通过使用定点诱变重建突变来验证耐药突变，然后进行体外和体内测定。最终，可以针对给定的药物靶点对识别临床相关的耐药突变。
与现有方法（如基于 ENU 或 PCR 的方法）相比，该技术的主要优点是它是无偏差的，并且与基于 PCR 的 METAGENE ssis 不同，该技术不限于癌基因的大小或任何基因的 GC 含量。一般来说，由于缺乏分子和细胞生物学知识，那些刚接触这项技术的人会很挣扎。这种方法的视觉演示至关重要。
由于新生和筛查步骤很难学习。这是因为许多人缺乏病毒生产、细胞培养和半细胞培养基方面的经验。该程序从用带有 JAK 2 V 617 f 的致癌亚型的质粒转化 XL one 红色 E 大肠杆菌细胞开始，JAK 2 个 XL 1 个红色 E 大肠杆菌细胞在 DNA 修复机制方面存在缺陷，因此允许它们在复制过程中掺入随机突变。
在预冷的聚丙烯管中将 50 至 100 ng 质粒 DNA 与 100 μL 感受态细胞混合。不要使用超过 100 ng 的 DNA，因为它会降低转化效率。在冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟轻轻旋转一次，以获得良好的文库覆盖。
使用 4 到 6 管感受态细胞。将聚丙烯管浸入 42 摄氏度的水浴中热休克 45 秒，然后在冰上孵育 2 分钟。接下来，向每个试管中加入 1 毫升 SOC 培养基。
将试管在 37 摄氏度下孵育，同时以 225 至 250 RPM 的速度摇动 90 分钟。将细胞铺在四个 10 厘米 LB 螺旋板上，每毫升含有 100 微克氨苄青霉素。将板在 37 摄氏度下孵育 16 至 24 小时。
一旦可见菌落，就用无菌板刮刀刮板来收集它们。汇集来自每个板的细胞。随后，使用市售质粒提取试剂盒分离质粒 DNA，并在转染板前一天通过测序评估文库中突变的异质性，将 10 倍至第六个 HEK 2 93 T 细胞放到 100 毫米培养皿中，放入含有 10% FCS、青霉素、链霉素和两个毫摩尔 L-谷氨酰胺的 DM EM 中。
第二天，为每个 100 毫米培养皿准备转染试剂。使用无血清 DM E EM 培养基，将 5 微克质粒文库、5 微克逆转录病毒包装质粒和 40 微升 FU 基因混合，总体积为 400 微升。在室温下将 DNA 和脂质混合物孵育 20 分钟。
接下来，用新鲜培养基替换 HEK 2 93 T 细胞的培养基，并在细胞顶部滴加 DNA 脂质复合物。在 37 摄氏度下孵育 6 小时。6 小时后，用新鲜培养基更换转染培养基，并在 37 摄氏度下孵育板 48 小时，每次生产病毒。
孵育 48 小时后，收集通过 0.45 微米 acro 盘式过滤器过滤的病毒上清液，以开始筛选和鉴定耐药 JAK 两个 V 607 F 突变体用逆转录病毒上清液转导 BAF 三个细胞的程序。使用含有 10% 血清和多脑的 RPMI 培养基，将 1 亿个 BAF 三个细胞与 100 毫升病毒上清液混合，总体积为 300 毫升。将这种细胞和病毒 supernat 混合物分配到多个 6 孔板中，每个孔板填充 4 到 5 mL。
将板在 1， 250 GS 下在 37 摄氏度下离心 90 分钟。离心后，第二天将板在 37 摄氏度下孵育 24 小时，合并每种药物浓度的转导细胞。在 50 毫升试管中将 10 毫升细胞与 ruxolitinib 混合。
本例中测试的 ruxolitinib 浓度为 1、5、2、0.5 和 10 微摩尔。使用含有 20% 血清的 RPMI 补足至 40 毫升。向细胞中加入 10 毫升 1.2% 螺旋钻，并在 6 个孔板中小心混合。
每孔分配 4 mL。将板在 37 摄氏度下孵育两周。一旦可见耐药菌落，使用 0.2 毫升移液器吸头挑选菌落并单独传代培养。
在 24 孔板中，在 3 到 4 天的时间里，通过在室温下以 450 GS 离心 5 分钟来收获抗性 BAF 三个细胞。使用市售基因组 DNA 提取试剂盒分离基因组 DNA 后，通过 PCR 从基因组 DNA 中扩增全长 JAK two CDNA。然后通过 Agar Rose 凝胶电泳和 3.4 KILOBASE DNA 条带分离 PCR 产物。
代表 JAK 两个包被框架使用市售凝胶提取试剂盒分离。最后，使用跨越编码序列的 8 个内部引物对全长 CDNA 进行测序，并使用商业软件分析序列以验证耐药突变。体外选择的变体由 JAK 2 V 617 F 序列的定点诱变产生，并重新引入 BAF 三个细胞中。
将 50 微升含有不同浓度 ruxolitinib 的培养基分别加入到板对面的孔中，将板 10 到第四个 BAF 三个 JAK 两个 V 617 F 细胞放入 96 孔板的每个孔中 将板在 37 摄氏度下孵育 60 小时为了评估细胞活力，向每个孔中加入 10 微升 WST 一种试剂，并在 37 摄氏度下孵育 2 至 4 小时。使用读板器记录 450 时的吸光度。一式三份进行所有测定，并绘制 ruxolitinib 浓度的平均吸光度。
使用非线性曲线拟合算法分数执行最佳拟合 S 形曲线。导致 50% 细胞活力的药物浓度作为细胞 IC 50 随后对耐药突变进行体内验证，如随附文本方案中所述。由于随机诱变产生的耐药细胞克隆可能携带不止一种突变，因此必须通过体外和体内测定分离验证这些突变。
在体外测定中，通过 JAK 2 V 607 F 序列的定点诱变产生选定的变体，并重新引入 BAF 三个细胞，然后测量不同剂量 ruxolitinib 的细胞增殖能力以评估 IC 50 值。此外，对 BF 3 细胞的蛋白质裂解物进行磷酸酪氨酸或磷酸化 STAT 5 的免疫印迹，这些细胞与增加剂量的 ruxolitinib 一起孵育，以排除任何脱靶介导的耐药性。因此，在较高 ruxolitinib 浓度下表现出增强 IC 50 值和持续自磷酸化的突变体被证实为耐药变体，以验证体内耐药性。
将基因改造为表达 JAK 2 V 6 17 F 变体和荧光素酶樱桃的 BF 3 细胞注射到小鼠体内，随后注射 ruxolitinib 两周。两周后。对小鼠进行荧光素酶催化的生物发光成像，通过测量 Cherry 阳性细胞的荧光来评估骨髓和 BAF 三合体和外周血流。
结果表明，表达 JAK two V 607 F 的小鼠对 ruxolitinib 敏感，而耐药变体在治疗期间显示生物发光的进行性增加。一旦掌握，如果作得当，可以在 4 到 5 天内进行随机 neogenesis。看完这个视频后，您应该对如何开发随机化质粒、DNA 文库有一个很好的了解，用于针对任何药物靶标对的体外筛选。
不要忘记，使用逆转录病毒可能非常危险。执行此过程时应始终采取预防措施。
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概览
本研究概述了一种用于识别和验证癌症治疗中药物耐药突变的协议。通过创建随机突变库并筛选耐药克隆，研究人员可以更好地理解遗传耐药机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 癌症生物学
- 遗传学
- 药理学
背景
- 遗传耐药的出现使癌症治疗变得复杂。
- 理解耐药突变有助于临床管理。
- 下一代药物设计受益于这些知识。
- 体外筛选对于识别耐药性至关重要。
研究目的
- 识别针对激酶抑制剂的药物耐药突变。
- 验证这些突变以制定更好的治疗策略。
- 增强对耐药机制的理解。
使用的方法
- 创建靶向癌基因的随机突变库。
- 体外筛选耐药克隆。
- 对耐药克隆进行测序以识别突变。
- 使用定点诱变和各种测定验证突变。
主要结果
- 识别临床相关的药物耐药突变。
- 通过实验测定成功验证了突变。
- 洞察特定药物耐药机制。
- 建立未来研究的协议。
结论
- 理解耐药突变对癌症治疗至关重要。
- 该协议可以指导未来的药物开发工作。
- 需要进一步研究以探索耐药机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Resistance to kinase inhibitors remains a critical challenge in oncology drug discovery, directly impacting the durability of targeted therapies and portfolio risk. This screening and validation workflow enables systematic identification of resistance-conferring mutations, supporting predictive confidence in target selection and next-generation inhibitor design. Integrating such unbiased mutational screening early in the pipeline informs mechanistic de-risking and accelerates risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of resistance mechanisms for kinase targets.
- Supports functional validation of drug-target interactions under selective pressure.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing escape mutations prior to clinical development.
- Informs prioritization of targets and chemical series based on resistance liability.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell-based systems for robust resistance screening workflows.
- Delivers quantitative IC50 measurements for resistant variants, supporting assay standardization.
- Enables reproducible evaluation of compound efficacy against engineered resistance mutations.
- Provides a scalable platform for iterative screening of multiple inhibitor candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro resistance findings with in vivo validation for translational continuity.
- Supports identification of clinically relevant resistance mutations for biomarker development.
- Enables risk-adjusted go/no-go decisions for advancing inhibitor candidates.
- Strengthens predictive value for clinical resistance emergence.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, lead optimization, and preclinical validation, providing a bridge from mechanistic hypothesis testing to translational risk assessment.
- Discovery Biology: Systematically tests null hypotheses regarding resistance emergence and target vulnerability.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing compound efficacy against resistant clones.
- Analytics: Provides IC50 and phosphorylation readouts to benchmark resistance thresholds.
- Translational Research: Connects in vitro resistance profiles to in vivo validation, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse kinase targets and inhibitor classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and inhibitor design by mapping resistance landscapes.
- Operational Value: Standardizes resistance screening and validation workflows for cross-program comparability.
- Strategic Value: Enables earlier, data-driven go/no-go decisions, reducing late-stage attrition due to unforeseen resistance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets with favorable resistance profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral transduction techniques.
- Demands access to sequencing, quantitative viability assays, and in vivo imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data integrity.
- Adaptation to other kinase targets may require optimization of mutagenesis and screening parameters.
- Safety protocols for retroviral work are essential due to biohazard risks.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preparation of Random Mutation Library by Random Mutagenisis
3:38
Production of Retroviral Supernatants
5:13
Selection of Resistant Clones In Vitro
8:15
In Vitro Validation of Resistant Mutations
9:58
Results: Identification and Validation of Ruxolitinib Resistant Mutations
12:04
Concluion
