Name: 对于耐药性突变对激酶抑制剂的筛选和验证方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学习利用随机突变文库和体外筛选技术识别并验证激酶抑制剂耐药性突变的方法。本方案结合测序与定点诱变技术，为癌症治疗中的耐药机制研究提供可靠实验基础。

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本研究得到了美国国家癌症研究所（NCI，项目编号：1RO1CA155091）、美国国家心肺血液研究所（NHLBI，项目编号：1R21HL114074）以及白血病研究基金会对 M.A. 的资助。M.A. 是 V 基金会 V-Scholar 奖的获得者。作者感谢 Sara Rohrabaugh 博士在编辑方面的帮助。

注意：本方案中的所有操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）关于动物伦理待遇与护理的指南，以及经批准的IACUC动物使用方案进行。
1. 细胞系的维持
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清、青霉素/链霉素（100 单位/ml 和 100 µg/ml）以及Wehi细胞用过的培养基的RPMI-1640培养基中培养BAF3细胞。在添加了10%胎牛血清和青霉素/链霉素（100 单位/ml 和 100 μg/ml）的DMEM培养基中培养HEK293T细胞。将细胞维持在37 °C、含5% CO2的湿润环境中。</li>
</ol>
2. 质粒构建
<ol>
	<li>使用标准的重组克隆方法，通过LR克隆酶将小鼠JAK2及其致癌性剪接变异体JAK2-V617F克隆至pMSCV-puro-GW载体中。</li>
	<li>用于构建荧光素酶表达载体（pMSCV-Luc-Cherry-GW）的 体内 成像，通过PCR使用引物（LUC-SD/RP TTACAATTTGGACTTTCCG 和 LUC-SD/FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC）从pLVX-Tet-ON载体中扩增荧光素酶基因，随后克隆至pENTR-SD-TOPO载体中以构建pENTR-Luc，该载体用于通过LR Clonase介导的重组克隆将荧光素酶基因转移至逆转录病毒载体pMSCV-Cherry-GW中。</li>
</ol>
3. 随机突变文库的制备、筛选及突变鉴定
3.1）随机诱变
<ol>
	<li>使用商业化的重组克隆技术，将 JAK2 野生型全长序列及其 V617F 突变体克隆至 pMSCV-puro-GW 逆转录病毒载体中。</li>
	<li>取 1 µg 的 JAK2-V617F 质粒 DNA 转化 XL-1 Red E. coli 感受态细胞，该菌株存在 DNA 修复机制缺陷，因此可在复制过程中引入随机突变。具体操作如下：将 50–100 ng 的 DNA（超过 100 ng 会降低转化效率）与 100 µl 感受态细胞在预冷的聚丙烯管中混合，冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟轻柔摇动一次。为获得良好的文库覆盖率，建议使用四至六管感受态细胞。 
	注意：DNA 用量超过 100 ng 会降低转化效率</li>
	<li>将离心管置于 42 °C 水浴中进行 45 秒热激处理，随后冰上孵育 2 分钟。接着加入 1 ml SOC 培养基（2.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.05% NaCl、10 mM MgCl₂、10 mM MgSO₄ 和 0.4% D-葡萄糖），在 37 °C 摇床中以 225–250 rpm 振荡培养 90 分钟。</li>
	<li>将每管中的菌液分别涂布于四个含 100 µg/ml 氨苄青霉素的 10 cm LB 琼脂平板上，于 37 °C 培养 16–24 小时。</li>
	<li>待菌落可见后，使用无菌刮刀刮取菌落。合并各平板中的菌体，并使用商业质粒提取试剂盒提取质粒 DNA。 
	注意：由于该菌株生长较慢，菌落通常较小，需 18–24 小时方可肉眼可见。在此阶段，可通过限制性内切酶（如 Sau3A1 或 Taq1）消化或测序分析文库中突变的异质性。</li>
</ol>
3.2）逆转录病毒上清液的制备与转导
<ol>
	<li>转染前一天，将 4 × 106 个 HEK 293T 细胞接种至 100 cm 培养皿中，培养基为含 10% FCS、青霉素/链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺的 DMEM。</li>
	<li>次日，更换培养基，并用突变的 pMSCV-JAK2-V617F 文库转染细胞。每 10 cm 培养皿中，将 10 µg DNA（5 µg 质粒文库和 5 µg 逆转录病毒包装质粒 pCLEco）与 40 µl FuGENE 用无血清 DMEM 培养基稀释至终体积 400 µl。室温孵育 DNA 与脂质混合物 20 分钟。20 分钟后，将 DNA-脂质复合物逐滴加至 HEK293T 细胞表面。</li>
	<li>转染 6 小时后，更换为新鲜培养基，并于 37 °C 继续培养 48 小时以产生病毒。培养 48 小时后，收集病毒上清液，经 0.45 µm acrodisc 滤器过滤。</li>
</ol>
3.3）体外抗性克隆的筛选 In Vitro
<ol>
	<li>对于耐药性 JAK2-V617F 突变体，使用病毒滴度为 0.5–1 × 106 的 100 ml 病毒上清液转导一亿个 BAF3 细胞。具体操作为：将 108 个细胞与 100 ml 病毒上清液混合，用含 10% 血清和 24 µg/ml 多聚素（终浓度为 8 µg/ml）的 RPMI 培养基定容至 300 ml。将细胞混合物分装至多个六孔板中（每孔 4–5 ml）。</li>
	<li>在 25 °C 下以 1,250 × g 离心 90 分钟。离心后，将六孔板在 37 °C 下孵育 24 小时。</li>
	<li>次日，收集细胞，与芦可替尼及含软琼脂的培养基混合后接种于六孔板中。针对每个药物浓度，将 10 ml 转导后的 BAF3 细胞（含 1,000 万至 2,000 万个细胞）与适量芦可替尼加入 50 ml 离心管中，用含 20% 血清的 RPMI 培养基补至 40 ml。向细胞中加入 10 ml 1.2% 琼脂，轻轻混匀后接种至六孔板。</li>
	<li>将六孔板在 37 °C 下孵育两周。使用 0.2 ml 移液器吸头挑取耐药克隆，并分别接种至 24 孔板中进行继代培养 3–4 天。</li>
	<li>通过在室温下以 450 × g 离心 5 分钟收集耐药 BAF3 细胞。使用商用基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。以 100 ng 基因组 DNA 为模板，采用引物（mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG 和 mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG）及长片段高保真 PCR 扩增系统扩增全长 JAK2 cDNA。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物。切取代表 JAK2 编码区的 3.4 kb DNA 条带，使用商用凝胶回收试剂盒回收 DNA。使用覆盖编码序列的 8 个内部引物（P1–P8）对全长 cDNA 进行测序，并利用商用软件分析序列。</li>
</ol>
4. 体外 耐药突变的验证
许多细胞克隆携带不止一个突变，为了检测每个突变对耐药表型的贡献，使用 pMSCV-JAK2V-617F 质粒作为模板，通过定点诱变生成选定的变异体。
<ol>
	<li>使用商业化的定点突变试剂盒和设计用于引入点突变的寡核苷酸，对pMSCV-JAK2-V617F质粒进行定点突变。通过测序确认突变克隆的身份。</li>
	<li>用由突变质粒制备的逆转录病毒感染BAF3细胞，并在含1 µg/ml嘌呤霉素的培养基中进行筛选。</li>
	<li>将104个BAF3-JAK2-V617F细胞（50 µl含10%胎牛血清的RPMI培养基）接种至96孔板的每个孔中。分别向板中各孔加入含不同浓度鲁索利替尼（ruxolitinib）的培养基50 µl（终浓度：0、1、3、5、10和20 µM），在37 °C下孵育60小时。</li>
	<li>通过向每孔加入10 µl WST-1试剂，再于37 °C孵育2–4小时，评估细胞活力。使用酶标仪在A450波长处记录吸光度。所有实验重复三次，将平均吸光度对INCB018424浓度作图，并采用非线性曲线拟合算法拟合最佳S型曲线。将导致50%细胞活力的药物浓度记为细胞IC50值。</li>
	<li>接下来，将表达JAK2变异体的六百万BAF3细胞接种至6孔板中，每孔加入含10%血清的RPMI培养基，并添加不同浓度的鲁索利替尼，在37 °C下孵育4–6小时。</li>
	<li>在4 °C下以450 × g离心5分钟收集细胞，用PBS洗涤一次，然后在裂解缓冲液（20 mM Tris-Cl（pH 7.5）、50 mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS、5 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM氟化钠、2 mM钒酸钠、5%甘油）中裂解，该缓冲液需新鲜加入蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂。将细胞悬液超声处理1分钟，随后加入5×上样缓冲液（350 mM Tris-HCl [pH 6.8]、500 mM DTT、15% SDS、10 mM苯甲脒、5 mM EDTA、5 mM EGTA、5 mM钒酸钠、蛋白酶抑制剂混合物、50%甘油和0.001%溴酚蓝），并在70 °C下变性5–10分钟。</li>
	<li>在变性条件下，使用8% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。用小鼠单克隆抗磷酸化STAT5抗体进行免疫印迹。将印迹膜剥离后，再用兔多克隆抗STAT5抗体重新杂交。根据供应商建议使用ECL试剂显影条带。</li>
</ol>
5. 在体 内 验证
<ol>
	<li>转导表达荧光素酶和Cherry（通过pMSCV-Luc-cherry GW逆转录病毒载体转导）的BAF3细胞，使其感染表达JAK2-V617F及其耐药突变体的病毒。通过嘌呤霉素筛选，选择能够存活并表达JAK2及其耐药突变体的细胞。</li>
	<li>向6只Balb/C小鼠注射200 µl PBS中含有的两百万个处于活跃生长期的携带JAK2-V617F及其耐药突变体的BAF3-Luc/cherry细胞 通过 尾静脉注射</li>
	<li>细胞移植后三天，以100 mg/kg剂量向小鼠每日两次注射Ruxolitinib，持续两周。</li>
	<li>使用成像系统进行基于荧光素酶的生物发光成像。
	<ol>
		<li>简而言之，将300 mg荧光素溶解于25 ml无菌去离子水中配制荧光素溶液，分装成小份后保存。 
		注意：荧光素应于 -80 °C 避光保存，直至使用。</li>
		<li>每只小鼠腹腔注射 250 µl，以达到每只 125 mg/kg 的剂量。将同组小鼠置于密闭箱中，使用吸入式异氟烷（1.5%–2.0%）进行麻醉。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。 
		注意：小鼠入睡所需时间（10-15 分钟）可使荧光素酶活性达到峰值。各组之间应保持时间一致，以避免差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠立即转移至成像室载物台上，在成像过程中以1.5–2%异氟烷维持麻醉状态。依次采用0.1、0.5、1、5、30、60和300秒曝光时间对小鼠进行成像。使用图像采集与分析软件获取图像并定量生物发光强度。成像结束后，将小鼠放回饲养笼中。</li>
	<li>因为， 体内 嵌合体收获全部骨髓细胞。用 CO₂ 处死小鼠2 5分钟后实施颈椎脱位处死。取出骨骼，于4 ml冷PBS中研磨以收集骨髓。在荧光显微镜下分析樱桃红阳性细胞百分比，并通过流式细胞术进行定量。每份样本采集两万个事件数据。</li>
</ol>

<ol><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+plasticity+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li>
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<li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR%2FABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+%28STI571%29+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li>
<li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571%2Fimatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li>
<li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR%2FABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li>
<li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li>
<li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li>
<li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+research%22%5BJournal%5D)">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li>
<li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li>
<li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li>
<li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437(2012).</li>
<li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+cancer+journal%22%5BJournal%5D)">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138(2013).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

伊马替尼在治疗慢性髓性白血病（CML）中的临床成功，不仅展示了小分子抑制剂靶向异常激酶的潜力，也揭示了靶向治疗的局限性：临床复发以及靶基因中耐药突变的出现。鉴定耐药突变有助于改善临床管理并推动下一代抑制剂的研发。本实验方案描述了一种用于识别靶基因中耐药突变的方法。该方法利用在大肠杆菌（E. coli）中构建的随机诱变质粒文库来表达突变蛋白。随后将该文库导入BAF3细胞（可被癌基因转化的细胞系），并在化疗药物存在条件下筛选出存活的细胞克隆。对耐药克隆中靶基因进行测序，可鉴定出导致耐药性的突变。最后，通过定点诱变重新构建所发现的突变，以验证其是否介导药物耐药性。
利用该策略，我们分别定义了JAK2和BCR/ABL基因中导致对鲁索利替尼（Ruxolitinib）和伊马替尼（Imatinib）产生耐药性的突变谱。我们在BCR/ABL中鉴定出超过一百种突变。除了识别出患者中检测到的所有主要突变外，我们的筛选方法还使我们能够鉴定出激酶结构域内及以外残基的新型取代突变。有趣的是，我们筛选中发现的所有突变均已在患者样本中被发现，但这一过程耗时超过10年15，...

蛋白激酶是细胞内信号转导通路中的关键调控酶，几乎调节着所有细胞功能。对激酶介导的信号传导进行恰当调控，对于维持稳态和发育至关重要，这主要依赖于激酶、磷酸酶以及泛素-蛋白酶体系统（UPS）对它们的降解之间的精确调控。异常激活的激酶在多种癌症中处于核心地位，并与大量人类疾病相关1。人类基因组编码超过500种蛋白激酶，这些激酶直接或间接地与约400种人类疾病相关联2。这些发现支持了利用小分子抑制剂靶向激酶进行治疗的策略3-5。
ABL激酶抑制剂（如伊马替尼）在慢性髓性白血病（CML）治疗中的应用为此类方法提供了概念验证6,7这一发现不仅革新了抗激酶治疗策略，还推动了在其他肿瘤性疾病中识别遗传学异常以实现靶向治疗的理念，从而促成了在真性红细胞增多症（PV）及骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中发现JAK2的致癌突变。该发现激发了通过小分子激酶抑制剂靶向JAK2治疗MPN的广泛兴趣。目前，已有近十种JAK2抑制剂处于临床试验阶段，其中一种已近期获批用于骨髓纤维化的治疗。尽管在癌症中利用小分子抑制剂特异性靶向致癌激酶带来了令人期待的疗效，但治疗耐药性的出现仍是重大挑战。事实上，迄今为止，接受激酶抑制剂（如伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼和达沙替尼）治疗的患者大多因激酶结构域发生突变而产生耐药性，这些突变通常直接影响药物的作用靶点。 8-10. 基因突变导致的耐药性凸显了针对致癌性激酶的靶向单药治疗的局限性，也构成了开发更有效癌症化疗药物所面临的下一个挑战。对药物耐药性的机制及功能后果的研究，应为辅助性化合物的筛选与设计提供理论依据。通过以下方式鉴定出的突变 体外 筛选结果与患者中发现的结果显示出高度相关性。因此， 体外 筛选在临床或临床前研发阶段针对特定药物靶点的耐药性突变，有助于识别可能导致临床复发的耐药模式。鉴定这些突变形式不仅有助于监测患者对药物的反应及复发情况，而且对于设计更高效的下一代抑制剂至关重要。例如，新一代BCR/ABL抑制剂尼洛替尼（Nilotinib）和普纳替尼（Ponatinib）的研发，正是基于通过诱变、结构和功能研究获得的更深入的作用机制理解。
此前，我们已报道了利用BCR/ABL的随机诱变筛选结果，揭示了导致对伊马替尼11,12、PD16632612和AP2416313等抑制剂产生耐药性的突变谱。这些结果不仅鉴定了导致临床耐药和疾病复发的突变，还提供了对药物耐药机制以及激酶功能调控原理的深入理解11,14。本文中，我们以鲁索利替尼（Ruxolitinib）和JAK2作为药物-靶点组合，进一步提供更详细的实验方法，以促进该筛选策略的更广泛应用。

<table><tbody><tr><td>细胞与组织培养&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>Ross Levine 惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro（corning）</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>亚特兰大生物制品</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA 1X</td><td>Cellgro（Corning）</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Cellgro（Corning）</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco（Life Technologies）</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml 水溶液储存液</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro（康宁）</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424（鲁索利替尼）</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>罗氏</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 微米圆盘滤膜</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 微米尼龙细胞筛</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 细胞</td><td>安捷伦科技</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml 储存液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>极佳的肉汤</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>试剂盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液&amp;amp；组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>长片段模板PCR扩增系统</td><td>罗氏</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶和 PCR 纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield 质粒小量提取系统</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>使用 Gateway 技术和 pDONR 221 的 PCR 克隆系统 &amp;和 OmniMAX 2 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;nbsp; LR Clonase 酶混合液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>小鼠试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo 荧光素酶底物（活体级）</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc 低剂量u-100胰岛素注射器，28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>Coor tek&amp;nbsp;</td><td>60316 和 60317</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isothesia TM）</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>仪器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO 系列 8000 WJ CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摆桶式转子离心机 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10全自动细胞计数仪</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>这并非必需，可使用标准血细胞计数板进行细胞计数</td></tr></tbody></table>

一种筛选和验证激酶抑制剂耐药突变的方法

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

BCR/ABL 作为慢性髓性白血病（CML）驱动癌基因的发现，促成了伊马替尼（Imatinib）的开发，该药物通过有效治疗 CML 患者，实际上证明了以激酶为靶点治疗癌症的潜力。这一发现彻底改变了药物研发方向，推动了针对多种其他恶性肿瘤中致癌激酶（如 EGFR、B-RAF、KIT 和 PDGFRs）的靶向治疗。然而，抗激酶疗法的一个主要缺点是耐药性突变的出现，导致靶点对药物的亲和力降低或完全丧失。了解耐药突变体所采用的机制，不仅有助于下一代抑制剂的开发，也为采用个体化医疗进行临床管理提供了推动力。我们曾报道一种基于逆转录病毒载体的筛选策略，用于鉴定赋予 BCR/ABL 耐药性的突变谱，该策略已助力下一代 BCR/ABL 抑制剂的研发。本文以鲁索利替尼（Ruxolitinib）和 JAK2 作为药物-靶点组合，描述了一种利用表达 JAK2 激酶随机突变文库的小鼠 BAF3 细胞的 体外 筛选方法。

基因突变的出现对靶向激酶治疗构成了重大挑战。突变研究不仅能够提供机制和功能层面的深入见解，有助于下一代药物的筛选与设计，还可改善临床管理，并在未来可能更有效地推动个体化治疗。在本实验中，我们展示了对JAK2-V617F激酶中鲁索利替尼（ruxolitinib）耐药突变的筛选（图1）。我们通过将全长的小鼠JAK2-V617F cDNA插入pMSCV-Cherry-GW载体，构建了pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway载体。推荐使用细菌宿主（大肠杆菌E. coli的XL-1 red菌株）来引入随机突变，相较于常用的PCR方法，该方法可避免序列偏好性问题，且更适用于较长基因片段的突变构建。将随机诱变的DNA文库转染至HEK293T细胞以产生逆转录病毒。这些突变型病毒随后用于转导BAF3细胞，并在不含IL-3的条件下，分别在1或5 µM鲁索利替尼存在下，通过软琼脂克隆形成实验筛选克隆。在此条件下，仅携带表达功能性且具有耐药性的激酶变异体的JAK2V-617F cDNA的细胞才能形成克隆。培养10至14天后，挑选出分离良好、大小不一的单个克隆，并在液体培...

针对激酶抑制剂治疗产生遗传性耐药性，对有效癌症治疗构成了重大挑战。鉴定和表征针对新开发药物的耐药突变，有助于改善临床管理并指导下一代药物设计。本文中，我们描述了体外筛选和验证耐药突变的实验方案。

BCR/ABL 作为慢性髓性白血病（CML）驱动癌基因的发现，促成了伊马替尼的开发，该药物实际上证明了……

本实验的总体目标是鉴定并验证耐药性突变。首先构建靶向癌基因的随机突变文库，随后通过体外筛选获得耐药克隆，从而实现这一目标。该流程的第三步是对耐药克隆进行测序，以鉴定耐药突变。最后一步是通过定点突变技术重新构建这些突变，并结合体外和体内实验验证其耐药性。最终可鉴定出针对特定药物靶标的具有临床意义的耐药突变。与现有的 ENU 或基于 PCR 的方法相比，该技术的主要优势在于其无偏性；与基于 PCR 的 METAGENE ssis 不同，该方法不受癌基因大小或任何基因 GC 含量的限制。通常，初学者由于缺乏分子生物学和细胞生物学方面的知识，会遇到困难。因此，对该方法进行可视化演示至关重要。由于新生和筛选步骤较难掌握，原因是许多人缺乏病毒制备、细胞培养以及半细胞培养基方面的经验。本实验首先将携带JAK2 V617F（JAK2的一种致癌异构体）质粒转化至XL1-Red大肠杆菌细胞中。XL1-Red大肠杆菌细胞的DNA修复机制存在缺陷，因此可在复制过程中引入随机突变。将50至100纳克质粒DNA与100微升感受态细胞在预冷的聚丙烯管中混合。DNA用量不得超过100纳克，以免降低转化效率。冰上孵育30分钟，每隔5分钟轻柔涡旋，以确保文库覆盖充分。使用四到六个感受态细胞管。将聚丙烯管浸入42摄氏度的水浴中进行45秒的热激处理，然后在冰上孵育两分钟。接着，向每根管中加入一毫升SOC培养基。将试管在37摄氏度、225至250转/分钟振荡条件下孵育90分钟。将细胞接种于四个含有100微克/毫升氨苄青霉素的10厘米LB琼脂平板上。将平板在37摄氏度孵育16至24小时。当菌落可见时，使用无菌细胞刮刀刮取平板上的菌落。将每块平板上的细胞收集到一起。随后，使用商业质粒提取试剂盒提取质粒DNA，并通过测序分析文库中突变的多样性。在转染前一天，将四次10的6次方个HEK 293T细胞接种至含有10% FCS、青霉素、链霉素和2毫摩尔L-谷氨酰胺的DMEM中，置于100毫米培养皿中培养。次日，为每个 100 毫米培养皿准备转染试剂。使用无血清 DMEM 培养基将 5 微克质粒文库、5 微克逆转录病毒包装质粒和 40 微升 FU 基因混合，总体积为 400 微升。将 DNA 与脂质混合物在室温下孵育 20 分钟。接下来，将 HEK 293T 细胞的培养基更换为新鲜培养基，并将 DNA-脂质复合物逐滴加入细胞表面。在 37 摄氏度下孵育 6 小时。6 小时后，将转染培养基更换为新鲜培养基，继续在 37 摄氏度下孵育培养板 48 小时，以进行病毒生产。孵育48小时后，收集经0.45微米Acro圆盘滤器过滤的病毒上清液，用于开始筛选和鉴定耐药性JAK2 V617F突变体。用逆转录病毒上清液转导BAF3细胞。将1亿个BAF3细胞与100毫升病毒上清液混合，用含10%血清和polybrene的RPMI培养基调整至总体积为300毫升。将该细胞与病毒上清液的混合物分装至多个6孔板中，每孔加入4至5毫升。将培养板在37摄氏度下以1,250 ×g离心90分钟。离心后，于次日在37摄氏度下孵育培养板24小时，收集每个药物浓度下的转导细胞。在50毫升离心管中，将10毫升细胞与鲁索利替尼混合。本示例中测试的芦可替尼浓度为 1、5、2、0.5 和 10 微摩尔。使用含 20% 血清的 RPMI 培养基将体积补足至 40 毫升。向细胞中加入 10 毫升 1.2% 琼脂糖，轻轻混匀后接种于六孔板中。每孔加入四毫升。将培养板在37摄氏度下孵育两周。待抗性菌落可见后，使用0.2毫升移液器吸头挑取菌落，并分别进行转接培养。在24孔板中培养三至四天后，通过离心（450 ×g，室温，5分钟）收集抗性BAF3细胞。使用商用基因组DNA提取试剂盒分离基因组DNA后，通过PCR从基因组DNA中扩增全长JAK2 cDNA。随后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并回收3.4 kb的DNA条带。使用商业化的凝胶回收试剂盒分离JAK2包被框。最后，利用覆盖编码序列的八个内部引物对全长cDNA进行测序，并使用商业软件分析序列，以验证耐药突变。体外筛选获得的变异体通过定点诱变JAK2 V617F序列产生，并重新导入BAF3细胞中。向培养板的各个孔中分别加入含有不同浓度鲁索利替尼（ruxolitinib）的50 µL培养基，每孔接种10⁴个BAF3 JAK2 V617F细胞至96孔板中，于37°C孵育60小时。为评估细胞活力，向每孔加入10 µL的WST-1试剂，于37°C继续孵育2至4小时。使用酶标仪在450 nm波长处记录吸光度。所有实验均需设三个复孔，以平均吸光度对鲁索利替尼浓度作图。使用非线性曲线拟合算法进行最佳拟合的S型曲线分析。以药物浓度导致50%细胞存活率作为细胞IC50，随后按照随附文本方案所述进行耐药突变的体内验证。由于通过随机诱变产生的耐药细胞克隆可能携带多个突变，这些突变必须通过体外和体内实验分别进行单独验证。在体外实验中，通过定点诱变JAK2 V607F序列生成选定的突变体，并将其重新导入BAF3细胞，随后在不同浓度的鲁索利替尼处理下检测细胞增殖能力，以评估IC50值。此外，对经梯度增加浓度的鲁索利替尼孵育后的BAF3细胞蛋白裂解液进行抗磷酪氨酸或抗磷-STAT5免疫印迹分析，以排除任何脱靶介导的耐药性。在较高鲁索利替尼浓度下表现出IC50值升高及持续自磷酸化的突变体，由此确认为耐药突变体，可用于体内耐药性的验证。将表达JAK2 V617F突变体和荧光素酶樱桃蛋白（luciferase cherry）的BF三细胞注射入小鼠体内，随后对小鼠注射芦可替尼持续两周。两周后，通过检测荧光素酶催化的生物发光信号来成像，并通过测定樱桃阳性细胞的荧光来评估骨髓和外周血中BAF三嵌合体的比例。结果显示，表达 JAK2 V617F 的小鼠对鲁索利替尼敏感，而耐药突变体在治疗期间表现出生物发光信号的持续增加。一旦掌握，若操作得当，随机新生可在四到五天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何针对任何药物靶点组合，构建用于体外筛选的随机化质粒DNA文库。请注意，操作逆转录病毒可能具有极高的危险性。进行此操作时必须始终采取预防措施。

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科研

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Biology

生物学

对于耐药性突变对激酶抑制剂的筛选和验证方法

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一种筛选和验证激酶抑制剂耐药突变的方法

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