Name: 分离和游离感觉神经元的文化活动从鸡胚 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学习从鸡胚背根神经节分离和培养原代感觉神经元的实验方法。该技术利用免疫荧光标记鉴定神经元标志物，为研究神经发育、轴突导向和生长锥动态提供可靠的细胞模型。

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我们感谢 Alison Philbrook、Belinda Barbagallo 和 Michael Francis 对本文提出的深刻见解。本出版物报道的研究工作得到了 MLL 获得的 R15 AREA 项目资助 1R15NS070172-01A1 的支持。

1. 盖玻片准备：酸洗和烘烤
<ol>
	<li>至少 2&#160;解剖前数天（步骤2），开始以下步骤以准备盖玻片。进行酸洗步骤以去除油脂并彻底清洁盖玻片。</li>
	<li>将盖玻片装入瓷质支架中，该支架可垂直固定盖玻片并防止其相互接触。将支架及盖玻片浸入装有2 M盐酸（HCl）的玻璃组织学容器中。若无瓷质支架，可将约20片盖玻片平铺于100 mm玻璃培养皿底部，并用2 M HCl浸没盖玻片。</li>
	<li>将玻璃容器（内含浸没在酸中的盖玻片）置于通风橱内的摇床上，室温下轻轻摇动至少5小时。或者，在相同条件下用酸浸泡盖玻片过夜。</li>
	<li>用蒸馏水清洗盖玻片2O(dH2O）将载有盖玻片的瓷架从2 M HCl转移至盛有dH₂O的洁净玻璃组织学容器中2O. 或者，将玻璃培养皿中的2 M HCl倾倒出来，重新加入去离子水2O.</li>
	<li>通过倾析法用 dH₂O 清洗2O 再次并用新鲜的 dH₂O 重新填充玻璃容器2O. 重复以上步骤，共进行 3 次&#160;快速洗涤。</li>
	<li>通过将玻璃容器（内含盖玻片和dH₂O）放回原位，开始更长时间的洗涤程序2O）置于摇床上，室温下轻柔振荡10–30分钟。随后，倾去dH2O 并加入新鲜的 dH₂O2O. 重复上述洗涤步骤，总共至少洗涤十次；或者，可选择继续洗涤过夜。</li>
	<li>将清洗后的盖玻片放入已预热至 350 °C 的炉中。若使用瓷质支架，需将支架从 dH2O填充的玻璃容器，然后将载玻片连同支架直接放入炉中。若使用玻璃培养皿，倾去dH2O，并将装有盖玻片的玻璃皿放入炉中。</li>
	<li>将盖玻片在350 °C下烘烤至少五小时或过夜。</li>
	<li>烘烤完成后，用精细镊子将盖玻片从瓷架上取下，并放入无菌的100 mm玻璃培养皿中。原本未放置于瓷架上的盖玻片也一并保留在玻璃培养皿中。</li>
</ol>
2. 鸡胚解剖及背根神经节的分离
<ol>
	<li>从孵育器（保持在37-38.5 °C并轻轻摇动）中取出受精的白来航鸡种蛋 
	注意：既往研究采用胚胎第7至10天进行背根神经节的分离2,8,11-13,16.</li>
	<li>将选中的卵置于层流罩内。在层流罩中，使用无菌溶液和器械，以无菌条件进行以下所列全部操作。将所有溶液在37 °C水浴中预热。</li>
	<li>将鸡蛋打碎，把内容物放入一个100 mm的塑料培养皿中。使用标准镊子将胚胎转移至另一个100 mm培养皿中。</li>
	<li>使用巴斯德吸管，加入温热的1x&#160;将 PBS 加入培养皿中以保持组织湿润。用精细镊子夹住胚胎颈部将其断头。将躯体转移至另一干净的 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>用巴斯德吸管向培养皿中加入预热的F12HS10（Ham’s F12，10 mM HEPES，100单位/毫升青霉素，0.1毫克/毫升链霉素，10%胎牛血清），以保持组织湿润。用镊子将胚胎置于背侧图1A).</li>
	<li>将含有胚胎组织的100 mm塑料培养皿置于超净工作台内的体视显微镜上。&#160;使用精细镊子从正中垂直切开&#160;通过捏住发育中的真皮从尾部到颈部撕开，以暴露心脏、肺及其他器官。或者，可通过制作一系列小切口来暴露内脏器官。</li>
	<li>轻轻使用 2&#160;使用无菌精细镊子：a) 夹住颈部，以及 b) 夹住心脏上方的主动脉或其他组织，向尾部方向牵拉，使动物内脏脱出。</li>
	<li>用巴斯德移液管将预热的F12HS10培养基滴加到组织上。用镊子去除残留的心血管、呼吸或消化器官，以暴露正在发育的肋骨、脊柱和背根神经节（DRGs）。图1B-1D).</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用精细镊子进一步去除器官，沿腰椎两侧、肋骨下方收集背根神经节（DRGs）。通过从胚胎中完整摘取DRGs来收集。夹住并切断从DRG延伸至脊髓的根部，同时夹住从DRG延伸至外周的发育中神经，或反向操作。</li>
	<li>将完整的背根神经节放入盛有温热F12HS10的35 mm培养皿中。用精细镊子夹除附着在背根神经节上的多余组织，例如可能黏附的背根或腹根，操作在35 mm培养皿中进行。</li>
	<li>为了获取腰椎区域以上的背根神经节（DRG），需去除胸段和颈段椎体的腹侧半部分。操作方法为：在颈椎上段区域沿脊髓轴垂直方向对发育中的椎柱进行切割，并在腰椎上段区域做另一处切割，随后沿椎柱左右两侧平行于脊髓轴方向进行切割。将胚胎椎体的腹侧半部分抬起，即可暴露脊髓图1E-1F).</li>
	<li>为便于获取背根神经节，用精细镊子夹住脊髓，移除胸段和颈段脊髓。用镊子将脊髓从椎管中抬起并取出。作为参考，胸段脊髓大致位于肋骨水平，而颈段脊髓位于肋骨上方。</li>
	<li>用精细镊子采集完整的胸段和颈段背根神经节，放入含其他背根神经节的温热F12HS10中。去除可能附着在背根神经节上的多余组织。</li>
	<li>用 F12HS10 冲洗一支新的玻璃巴斯德移液管内部，以帮助防止背根神经节（DRGs）黏附在移液管管壁上。用该冲洗过的移液管将小培养皿中的所有背根神经节及 F12HS10 转移至无菌 15 ml 锥形管中，并立即进行步骤 3。 
	注意：可解剖更多胚胎以增加数量&#160;背根神经节。背根神经节应保存在F12HS10中，置于37 °C环境下，直至进行第3步操作。</li>
</ol>
3. 背根神经节神经元的分离、富集与培养——第一部分
<ol>
	<li>将装有完整背根神经节（DRGs）的锥形管放入离心机，轻轻离心（200 × g）2–3 分钟。确认 DRGs 已沉降至管底；若未完全沉淀，需再次离心。</li>
	<li>使用移液器小心吸除 F12HS10，保持 DRG 沉淀不受扰动。加入 2 ml 1×&#160;无钙镁磷酸盐缓冲液（CMF PBS），轻轻吹打使 DRG 沉淀重新悬浮。再次离心后吸除 CMF PBS，保留 DRG 沉淀。重复此洗涤步骤共三次，以彻底去除 F12HS10 中的胎牛血清，避免其干扰下一步的胰蛋白酶消化。</li>
	<li>向含有 2 ml CMF PBS 和 DRGs 的 15 ml 管中加入 2 ml 预热的胰蛋白酶溶液。将管子置于 37 °C 水浴中孵育 10–15 分钟&#160;，使 DRGs 消化为单细胞悬液。</li>
	<li>在孵育期间，配制含补充剂的 F12H 培养基（Ham’s F12，10 mM HEPES，100 单位/ml 青霉素，0.1 mg/ml 链霉素，10 ng/ml NT3，10 ng/ml NGF，200 mM L-谷氨酰胺和 N2），并置于 37 °C 水浴中预热。通常，10 ml 培养基足以用于接种 4–5 个 35 mm 培养皿的原代感觉神经元。同时开始解冻用于包被盖玻片的层粘连蛋白-1（laminin-1）（见步骤 4）。</li>
	<li>用 p1000 移液器在胰蛋白酶溶液中轻柔吹打 DRGs，并肉眼观察是否仍有完整 DRGs 存在。持续吹打直至肉眼不可见完整 DRGs；或延长 37 °C 水浴中的胰蛋白酶孵育时间，直至 DRGs 完全解离。为保护 DRG 神经元免受损伤，吹打过程中应避免产生气泡，并将胰蛋白酶消化时间控制在 &#60;30 分钟以内。</li>
	<li>将含有解离 DRGs 和胰蛋白酶的管子以 200 × g 离心 3–5 分钟&#160;，形成沉淀。若沉淀未完全形成，可适当延长离心时间。</li>
	<li>小心吸除上清胰蛋白酶，避免扰动沉淀。向沉淀中加入 2 ml F12HS10 培养基，用 p1000 移液器轻轻吹打重悬 DRGs。</li>
	<li>将 15 ml 锥形管中的全部内容物转移至 100 mm 培养皿中。用 8 ml F12HS10 分次（每次 2 ml）冲洗原管，并将冲洗液全部转移至培养皿，最终总体积为 10 ml。此冲洗步骤有助于回收可能黏附在管壁上的细胞。</li>
	<li>将含 10 ml F12HS10 和解离 DRG 细胞的 100 mm 培养皿放入湿润的 37 °C 培养箱中孵育 3 小时。 
	注：由于 HEPES 可在无 CO2 条件下维持培养基 pH，因此培养箱中无需提供 CO2。孵育期间，胶质细胞会贴附于组织培养塑料表面，而神经元则倾向于松散地附着于胶质细胞层上。</li>
</ol>
4. 用层粘连蛋白-1 包被经酸洗和烘烤的盖玻片
<ol>
	<li>将冻存的无菌层粘连蛋白-1 分装样品置于冰上解冻。</li>
	<li>在无菌条件下，向 50 μl 层粘连蛋白-1 分装样品中加入 1 ml 无菌 1×&#160;PBS。</li>
	<li>使用分光光度计测定层粘连蛋白-1 在 280 nm 处的吸光度值。将该值代入以下公式以确定层粘连蛋白-1 的浓度。</li>
</ol>
ABS 280 = （浓度 mg/ml）×（蛋白质的消光系数） 
层粘连蛋白-1 的消光系数为 0.86。
<ol start="4">
	<li>在无菌条件下，用 1X PBS 将层粘连蛋白-1 稀释至 1 mg/ml 和 20 mg/ml 的浓度。使用这两种层粘连蛋白-1 的添加浓度，经孵育后可在盖玻片上实现十倍差异的层粘连蛋白-1 结合量（分别为 30 ng/cm2 和 300 ng/cm2）7,8,10。</li>
	<li>在超净工作台中，使用精细镊子将一片经酸洗并烘烤处理的盖玻片放入一个 35 mm 培养皿底部。根据需要重复操作，以获得所需数量的培养皿。</li>
	<li>将盖玻片暴露于紫外光下照射 20–30 分钟&#160;，以进一步确保灭菌效果。此步骤期间保持培养皿盖打开。</li>
	<li>向每片玻璃盖玻片上加入 400 μl 已配制的层粘连蛋白-1 溶液。使用移液器吸头将层粘连蛋白-1 溶液铺匀，确保盖玻片表面完全覆盖。由于表面张力作用，层粘连蛋白-1 将保留在盖玻片上而不会扩散至培养皿底部，此特性为必需。</li>
	<li>盖上培养皿盖，于室温下孵育 2–3 小时&#160;（最佳孵育时间为 3 小时&#160;）。</li>
	<li>层粘连蛋白-1 孵育结束后，在超净工作台中采用无菌操作技术用无菌 PBS 清洗盖玻片。吸除盖玻片上的溶液，加入 400 μl PBS，静置 5–10 分钟。共重复清洗 3 次&#160;。</li>
	<li>最后一次清洗后，保留 PBS 覆盖于盖玻片上。清洗过程中不得破坏表面张力，也不得使盖玻片干燥。盖上皿盖，直至准备将解离的神经元接种到盖玻片上为止。</li>
</ol>
5. 背根神经节神经元的解离、富集与培养——第二部分
<ol>
	<li>孵育后，使用一支10 ml无菌移液管轻轻冲洗含有解离DRG细胞的100 mm培养皿底部。将培养皿保持约45°倾斜，用移液器辅助装置吸取约7 ml F12HS10，然后轻轻将7 ml液体排至培养皿约1/3区域。重复5次，轻柔地使神经元脱离。</li>
	<li>旋转培养皿，在另外1/3区域重复冲洗操作，再进行六次冲洗。对剩余的1/3区域再次重复该操作。通过这种方式，用F12HS10轻柔冲洗整个培养皿底部，以去除神经元。</li>
	<li>使用同一支移液管，将含有神经元的F12HS10从100 mm培养皿转移至15 ml锥形管中。在200 g条件下离心5–10 min&#160;，以沉淀细胞。</li>
	<li>去除F12HS10，保持沉淀物不受扰动。用2 ml预热的F12H + 添加剂重悬沉淀物。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞密度。</li>
	<li>根据需要，用F12H + 添加剂稀释细胞，以获得所需的铺板浓度（对于涂有1 μg/ml层粘连蛋白-1的盖玻片，浓度为120,000个细胞/ml；对于涂有20 μg/ml层粘连蛋白-1的盖玻片，浓度为40,000个细胞/ml8,16）。</li>
	<li>从涂有层粘连蛋白的盖玻片上移除PBS，并立即在盖玻片上加入400 μl细胞悬液。小心地将培养皿转移至湿润、37 °C的细胞培养箱中。孵育至少1 hr，最长可达3 hr&#160;，以使神经元充分黏附于层粘连蛋白-1上。</li>
	<li>在无菌条件下，用1.6 ml F12H + 添加剂轻轻充满含有神经元的35 mm培养皿。 
	注意：此时可打破盖玻片表面的表面张力。神经元已在盖玻片上充分黏附于层粘连蛋白-1。</li>
	<li>将细胞放回培养箱中过夜孵育。次日可进行免疫细胞化学等实验。</li>
</ol>
6. 免疫细胞化学
<ol>
	<li>免疫细胞化学染色前，将固定液（4% 多聚甲醛、30% 蔗糖、2× PBS）置于 37 °C 水浴中预热。 
	注意：在固定细胞前，可先用不同试剂处理细胞，例如 netrin-1、Mn2+、sonic hedgehog、semaphorin 和 ephrin16,29-31。</li>
	<li>从培养皿的 2 ml F12H + 添加剂中缓慢移除 1 ml，然后轻柔加入 1 ml 预热的固定液。室温孵育 10–15 分钟。</li>
	<li>小心移除固定液，加入 2 ml PBS。将溶液沿培养皿边缘加入，避免因直接冲加 PBS 导致固定后的细胞脱落。室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>重复 PBS 洗涤，共洗涤 5 次。免疫细胞化学染色过程中任何步骤均不得让细胞干燥。</li>
	<li>移除 PBS，加入 1 ml 封闭液（0.1% Triton-X、1× PBS、5% 正常山羊血清）。室温孵育 1 小时。或者，若需标记细胞表面分子，则封闭液中不应添加 Triton-X8。</li>
	<li>根据厂家推荐浓度，用封闭液稀释一抗。抗 NCAM 和活化型 β1 整联蛋白抗体的稀释比例为 1:50016。移除封闭液，加入 1 ml 一抗溶液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>移除一抗溶液，加入 2 ml 1× PBS，室温孵育 5–10 分钟&#160;。重复洗涤，共进行 4 次 PBS 洗涤。如有需要，可延长洗涤时间。</li>
	<li>用封闭液按 1:1,000 比例稀释二抗。移除 PBS，加入 1 ml 二抗溶液，室温孵育 1 小时。 
	注意：二抗对光敏感。自此步骤起，应尽可能将溶液和样品避光保存。</li>
	<li>移除二抗溶液，按前述方法用 1× PBS 洗涤 5 次&#160;，每次&#160;使用 1× PBS。</li>
	<li>在载玻片上滴加约 60–80 μl Fluoromount G 封片剂。用精细镊子轻轻将盖玻片从培养皿中取出，并缓慢将其放入载玻片上的 Fluoromount G 中，避免产生气泡。</li>
	<li>将载玻片水平置于 4 °C 避光保存。12–24 小时后，Fluoromount G 将完成聚合，盖玻片将牢固附着于载玻片上。待聚合完成后即可进行细胞成像。</li>
</ol>

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<li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li>
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<li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li>
<li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li>
<li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li>
<li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li>
<li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了从鸡胚中分离和培养离体感觉神经元的详细方案。该方法可在体外获得大量生长旺盛的神经元群体in vitro7,8,10,16。多种细胞和分子技术均可应用于这些培养的神经元，包括本文所述的免疫细胞化学技术。该方案最近被用于定量评估感觉神经元生长锥中免疫标记的活化整合素的强度8,16。在先前的研究中，使用一款软件程序精确绘制出生长锥远端20微米部分的轮廓，该轮廓基于NCAM染色结果生成。由于NCAM在神经元中广泛表达，该软件能够识别整个生长锥，而非仅识别其局部区域。随后，该生长锥轮廓被定义为感兴趣区域，软件进一步评估该区域内整合素染色的强度。通过这种方法，可轻松测量培养的感觉神经元中特定区域内目标蛋白的表达强度。
为了获得可靠的结果，提供以下建议。首先，在步骤 1.4–1.6 中经 HCl 孵育后，务必用清水充分清洗盖玻片，否则如层粘连蛋白-1（laminin-1）等分子在盖玻片上无法均匀分散。其次，在胰蛋白酶消化后（步骤 3.5），需确认背根神经节（DRG）细胞已充分解离，否则将形成细胞团块，从而降低神经元纯度。第三...

神经元是复杂的细胞，负责传递对多种功能至关重要的信息，包括感觉、视觉、运动、学习和记忆。与其他类型的细胞不同，神经元会延伸出类似手臂的突起，称为轴突，形成用于信息传递的关键神经通路。在发育过程中，生长中轴突顶端存在一种特殊结构，称为生长锥，它通过响应一系列细胞外信号引导轴突到达正确的靶位。目前，人们对生长锥导向行为背后的复杂分子机制尚未完全理解。为了更深入地研究这些机制，研究人员已采用细胞培养模型，在明确且简化的体外（in vitro）环境中研究神经元。对培养神经元的研究1极大地推动了我们对神经元细胞生物学的理解，包括：神经元分化2、细胞骨架动力学、内吞作用与运输&#160;、树突调控3,4&#160;、轴突再生5，以及神经病变等临床状况6。此外，培养的神经元非常适合多种研究技术，包括免疫细胞化学、细胞表面共免疫沉淀、蛋白质印迹（Western blot）、转染、RNA干扰（RNAi）以及活细胞成像，例如对生长锥运动进行延时分析。因此，原代神经元培养是一种强有力的手段，可用于阐明神经元细胞生物学的诸多方面。
细胞培养模型使研究者能够精确控制环境条件和变量。例如，可轻松调控神经元接种（并生长）所用的基质。本文提供了两种不同基质的详细制备方法：一种含有低浓度层粘连蛋白-1，另一种则含有饱和浓度的层粘连蛋白-1。令人意外的是，同一种分子的不同浓度可对神经元的内部状态及其细胞表面组成产生显著影响。例如，在这两种基质上接种的神经元，其细胞内cAMP水平和细胞表面整联蛋白水平均存在显著差异7,8。其他研究还表明，包括纤连蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖在内的其他分子也会影响细胞表面分子的表达及神经元的运动能力7-11。此外，神经营养因子和神经趋向性分子等可溶性分子同样会影响细胞膜组成和神经元运动能力12-16，并且在细胞培养模型中可被方便而精确地调控。
本文介绍了从鸡胚中分离和培养离解感觉神经元的方法。该方法已被用于神经生物学领域的重大突破研究，包括轴突生长5,7,8,10,11,16-21 并根据设计用于分离神经节细胞的方案进行了修改22该方法具有多项优势。首先，鸡背根神经节（DRG）发育的许多特征已被充分表征，包括神经元生成、轴突延伸以及蛋白质表达谱的时间进程2,23-28，从而为构建富有信息量的内容提供了有益的基础 体外 实验。其次，与使用完整的背根神经节外植体（包含神经元和非神经元细胞）和/或含有解离神经元及非神经元细胞的混合培养方法相比，解离的神经元培养可使研究者更直接地研究神经元。第三，本文所述方法操作简便、成本低廉，适合本科生参与。因此，该技术既可用于科研，也可用于教学。此外，对本方案进行轻微修改后，应能快速高效地从除背根神经节以外的其他来源纯化神经元。例如，可对本方法进行调整，以获得来自其他组织（如胚胎前脑或脊髓）的神经元富集培养物。
针对这些解离的神经元培养物，免疫细胞化学实验方案已得到优化，并在此详细描述。文中提供了针对神经细胞黏附分子（NCAM）和β1整合素的双重免疫细胞化学实验步骤。通过这些免疫细胞化学方法获得的数据已被用于研究培养神经元中多种分子的空间分布模式及表达强度8,16。

<table><tbody><tr><td>无菌小培养皿（35 mm）</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>无菌大培养皿（100 mm）</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>无菌大平皿（100 mm）</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>玻璃平皿（100 mm）</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>标准镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（22 × 22 mm）</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>厚度0.13–0.17 mm最适用于显微镜观察</td></tr><tr><td>瓷制盖玻片架</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>每500 ml Ham's F12培养基中加入50 ml分装</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>使用浓度为2 M，弃置前可使用两次</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>用于制备层粘连蛋白-1储备液的5 M NaCl溶液</td></tr><tr><td>层粘连蛋白-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>加入72 &amp;micro;l无菌5 M NaCl溶液，分装为50 &amp;micro;l每份</td></tr><tr><td>15 ml锥形管</td><td>cell treat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>使用时稀释至1x，用无菌Millipore过滤水稀释</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>使用时稀释至1x，用无菌Millipore过滤水稀释</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>在F12HS20中使用浓度为10%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>用蒸馏水配制无菌1 M溶液，在F12培养基中稀释至终浓度为10 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>在500 ml F12培养基中加入5 ml</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>加入1 ml无菌Millipore水，无菌条件下分装，-20 &amp;deg;C保存，在F12H培养基中使用终浓度为10 ng/ml，存放于-20 &amp;deg;C非除霜冰箱中</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD Systems</td><td>256-GF</td><td>加入1 ml含0.1% BSA的无菌1x PBS，无菌条件下分装，-20 &amp;deg;C保存，在F12H培养基中使用终浓度为10 ng/ml</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>无菌条件下分装，-20 &amp;deg;C保存，在F12H培养基中使用终浓度为200 mM</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>无菌条件下分装，-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">其他所需物品：常规解剖器械，包括玻璃巴斯德移液管、受精白来航鸡卵、检卵孵育箱（加湿，37 &amp;deg;C）、细胞培养箱（加湿，37 &amp;deg;C）、层流罩、双目光学解剖显微镜</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;免疫细胞化学试剂表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>用于固定液（4%多聚甲醛，30%蔗糖，2x PBS）</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用于固定液（4%多聚甲醛，30%蔗糖，2x PBS）</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Life Technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;一抗表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗NCAM抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>多克隆</td></tr><tr><td>抗活化&amp;beta;1整合素抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>单克隆</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;二抗表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG Alexa 548</td><td>Life Technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

从鸡胚中分离和培养离解的感觉神经元

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

神经元是具有多种功能的细胞，负责传递对感觉、运动、学习和记忆等多种生理功能至关重要的信息。由于神经元结构复杂、所处环境多样且动态变化，以及技术上的限制，在活体（in vivo）条件下研究神经元具有较大挑战性。因此，体外（in vitro）研究神经元有助于揭示其复杂的生物学特性。细胞培养模型具有明确可控的特性，可对环境条件和实验变量进行精确调控。本文描述了如何从鸡胚中分离、解离并培养原代神经元。该方法快速、经济，并能获得生长状态良好的感觉神经元。该流程可稳定获得神经元高度富集的培养物，非神经元细胞极少（少于5%）。原代神经元在未经处理的玻璃或组织培养塑料表面贴附性差，因此本文详细介绍了两种含层粘连蛋白（laminin）的明确培养基底的制备方法，用于神经元接种。培养的神经元适用于多种细胞与分子生物学技术，包括共免疫沉淀、活细胞成像、RNA干扰（RNAi）和免疫细胞化学。本文还优化并描述了在这些培养神经元上进行双重免疫细胞化学染色的实验步骤。

本方案可使研究人员培养出富含解离胚胎感觉神经元的细胞群体，其中非神经元细胞极少（例如，<5%）7,8,10,16。可从腰骶部、胸部和颈部区域获取大量背根神经节（DRG）。根据研究人员的需求，可轻松分离这些不同解剖区域的DRG。例如，图1展示了鸡胚在不同解剖阶段的图像，其中腰段DRG在图1C和图1D中被标出，胸段DRG则在图1E和图1F中显示。
通过免疫细胞化学方法可轻松标记培养的细胞。此处，培养的细胞经针对 β1 整合素和 NCAM 的抗体进行免疫染色（图2）。令人惊讶的是，如果将载玻片水平放置于 4 °C 并避光保存，我们能够在完成这些免疫细胞化学实验后长达一年内仍观察到荧光染色信号。然而，免疫细胞化学染色的持久性需由使用者根据具体抗体进行确定。
根据神经元的密度，也可以观察到延伸的神...

细胞培养模型能够对环境条件进行精确控制，因此为阐明神经元细胞生物学的诸多方面提供了一个强大的平台。我们描述了一种快速、经济且可靠的方法，用于从鸡胚中分离、解离和培养感觉神经元。本文还提供了基质制备和免疫细胞化学的详细步骤。

神经元是具有多种功能的细胞，负责传递对感觉、运动、学习和记忆等多种功能至关重要的信息。

本实验的总体目标是从鸡胚中培养出富集的分离原代感觉神经元群体。首先，从胚胎发育第7至10天的鸡胚中完整采集背根神经节，收集至锥形管中，随后将其解离成单细胞悬液。第二步，将分离的DRG细胞接种于培养皿中进行孵育。随后，轻轻冲洗培养皿，以优先分离神经元。最后一步是将解离的感觉神经元接种到明确的基质上，例如经酸洗和烘烤并预先包被高浓度或低浓度层粘连蛋白的盖玻片。通过免疫细胞化学方法显示，在解离培养的鸡胚感觉神经元的细胞体、神经突和生长锥中存在 NCA 及活化的 β1 整合素。该方法是一种强大的工具，可用于阐明神经生物学的多个方面，包括轴突导向机制、生长锥、细胞骨架动态，以及细胞表面组成与调控等。该技术使研究人员能够快速获得富含分离感觉神经元的培养物，其中几乎不含胶质细胞。这与包含神经元和非神经元细胞的完整背根神经节培养物有明显区别。此外，对该方案进行微小调整后，还可从除背根神经节以外的其他来源（包括胚胎前脑）获得高产量的神经元培养物。在超净工作台中敲开一枚已发育至特定阶段的白来航鸡受精卵，将其内容物转移至一个100毫米的培养皿中，随后将胚胎转移至另一个100毫米的培养皿中。加入预热的1倍浓度XPBS至培养皿中，以保持组织湿润。将胚胎去头，躯体转移至另一干净的培养皿中。向组织中加入预热的F12含10%胎牛血清的培养基。将含有胚胎组织的培养皿置于超净台内的解剖显微镜下。随后，用镊子夹住发育中的皮肤，从尾部向颈部做一条垂直的正中切口，以暴露心脏、肺及其他器官。用精细镊子轻轻夹住颈部以及心脏上方的主动脉或其他组织，向尾部方向牵拉，以去除内脏。接下来，将温热的 F 12 HS 10 液体施加于组织，以进一步清洁样本并保持组织湿润，并在解剖过程中根据需要重复使用 F 12 HS 10。随后，去除残留的心血管、呼吸或消化器官，以暴露发育中的肋骨、脊柱及背根神经节（DRGs），沿腰段脊柱两侧、肋骨下方收集 DRGs，并从胚胎中取出 DRGs。操作方法为：夹住并切断从 DRG 延伸至脊髓的神经根，然后从 DRG 向外周方向或反向抓取正在发育的神经。 随后，将完整的背根神经节（DRG）置于一个盛有温热F12 HS 10的35毫米培养皿中。去除可能附着在DRG上的多余组织，例如背根或腹根。为了获取腰段以上区域的DRG，需切除胸段和颈段脊柱的腹侧半部分。通过在腰椎上段区域沿脊髓轴垂直于发育中的脊柱进行横切，并在颈椎上段区域做另一横切，然后沿脊柱左右两侧进行切割。这些切口共同作用可将脊柱的腹侧半部分从胚胎上分离，随后移除脊柱部分，以便易于接触背根神经节（DRGs）。用精细镊子夹住脊髓，取出胸段和颈段脊髓。接着，按照之前的方法收集完整的胸段和颈段背根神经节（DRGs），并将其放入含10%马血清的温F12培养基中，与其他DRGs一同保存。去除可能附着在DRGs上的多余组织。然后用 F12 HS 10 冲洗一支新的玻璃巴氏德吸管内部，以帮助防止背根神经节（DRG）黏附在吸管壁上。使用该冲洗过的吸管将所有 DRG 和 F12 HS 10 从小培养皿转移至一个 15 毫升无菌锥形管中；在本操作中可额外解剖更多胚胎以增加 DRG 的数量。将含有完整 DRG 的锥形管放入离心机，以 200 ×g 轻柔离心 2 至 3 分钟。确认 DRG 已沉降至管底。然后小心移除 F12 HS 10，避免扰动 DRG 沉淀。接着加入 2 毫升 1×C-M-F-P-B-S，以悬浮 DRG 沉淀。再次离心，保留背根神经节（DRGs），去除C-M-F-P-B-S。重复此洗涤步骤，共洗涤三次。洗涤完成后，去除C-M-F-P-B-S，向15毫升离心管中加入2毫升预热的胰蛋白酶，轻轻吹打使背根神经节（DRGs）脱落。然后将试管置于37摄氏度水浴中10至15分钟，以消化背根神经节（DRGs）并使其解离为单个细胞。轻轻振荡胰蛋白酶溶液中的背根神经节，并肉眼观察是否存在完整的背根神经节。继续振荡直至肉眼不可见完整背根神经节，或在37摄氏度水浴中延长胰蛋白酶孵育时间，直至完整背根神经节完全解离。接下来将解离的背根神经节（DRGs）和胰蛋白酶在200 × g条件下离心3至5分钟，以形成沉淀。若需要，可延长离心时间，直至沉淀形成。然后小心吸除胰蛋白酶，避免扰动沉淀。向沉淀中加入2毫升F 12 hs 10，轻轻吹打以重悬背根神经节（DRGs）。随后将锥形管中的全部内容物转移至100毫米培养皿中。用8毫升F 12 HS 10冲洗管子，每次转移2毫升，分次加入培养皿，共转移10毫升。此后，将培养皿置于湿润的37摄氏度培养箱中孵育三小时。现在向每个经酸洗并烘烤的玻璃盖玻片上加入400微升已配制好的层粘连蛋白溶液，并用移液器吸头将其铺匀，以确保完全覆盖。由于表面张力的作用，层粘连蛋白将保留在盖玻片上，而不会扩散至培养皿底部。将盖子盖在培养皿上，使Laminin在室温下孵育2至3小时。随后，在超净工作台中用无菌PBS冲洗经Laminin包被的盖玻片3次。最后一次冲洗后，将PBS保留在盖玻片上。在清洗步骤中不要破坏表面张力。孵育后，使用10毫升无菌移液管轻轻冲洗含有解离DRG细胞的培养皿底部。将培养皿保持在45度角。吸取约七毫升 F12 HS 10，然后轻轻将其滴加到培养皿的三分之一区域，以使神经元脱落。重复此操作五次。接着，将培养皿旋转约120度，并重复冲洗步骤，再进行六次冲洗。然后对培养皿剩余的三分之一区域再次重复上述操作。现在，使用同一支移液枪将含有神经元的F12 HS10培养基从培养皿转移至锥形管中。以200 ×g离心5到10分钟，使细胞沉淀。随后去除F 12 HS 10，保留沉淀不受扰动。然后用2毫升预热的F 12 H补充培养基重悬沉淀。随后，使用血细胞计数板测定细胞密度，并根据需要使用F12H完全培养基补充液稀释细胞，以获得所需的接种浓度。然后立即从经层粘连蛋白包被的盖玻片上移除PBS，加入400微升细胞悬液。将培养皿小心转移至37摄氏度的细胞培养箱中，在无菌条件下孵育两到三小时。轻柔地向含有神经元的35毫米培养皿中加入1.6毫升F12H完全培养基（含补充物）。随后将细胞放回培养箱中，过夜孵育。该图显示了经NCA和活化型β1整合素免疫标记的培养分离初级感觉神经元。这些来自鸡胚的神经元在高浓度层粘连蛋白1上神经元胞体处生长旺盛。神经突和生长锥对NCA及活化型β1整合素呈免疫阳性。两种染色结果的合并图像显示，大多数细胞对N-CAM和活化的β1整合素均呈阳性。正如预期的那样，对于胚胎鸡感觉神经元，通过该技术收获的细胞中非神经元细胞少于5%。在此图像中，存在一个具有胶质细胞样形态的细胞，其N-CAM阴性而β1整合素阳性。与非神经元细胞一致。培养的感觉神经元在高倍镜下可清晰看到从胞体延伸出的神经突，插图显示了神经突末端生长锥的更高倍数放大图像。在进行该操作时，需注意务必仔细且充分地解离完整的背根神经节，并将神经元以适当的密度接种于特定的基质上，例如经酸洗并烘烤的盖玻片，其表面已用已知浓度的层粘连蛋白1进行包被，此步骤应在完成培养操作后进行。可以采用活体成像方法，例如延时显微镜，来评估生长锥的形态、运动性、POAL 动力学以及其他生长锥行为，这些行为可在定义的基质上，以及在培养基中添加特定分子后的条件下进行观察。观看本视频后，您应能充分掌握如何建立一个生长旺盛的培养体系，其中富含从鸡胚胎背根神经节分离得到的原代解离神经元。

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