软琼脂集落形成实验

本实验的总体目标是定量测定细胞的非贴壁依赖性生长能力。首先，在细胞培养板上铺一层琼脂并使其凝固，以实现这一目标。第二步是将细胞与琼脂的混合物铺在先前凝固的琼脂层之上。

接下来，让细胞在数周时间内形成集落。最后一步是对集落进行染色，以便观察和定量分析。最终，软琼脂集落形成实验用于显示锚定非依赖性生长，作为细胞转化的一个指标。

与克隆形成实验等其他方法相比，该技术的主要优势在于软琼脂克隆形成实验要求细胞以非贴壁依赖的方式形成克隆。开始实验前，应为每个待研究的细胞系或实验条件，正确标记组织培养处理过的六孔板的每个孔。

接下来，通过将1克粉末培养基和0.2克碳酸氢钠溶解于去离子水中，定容至50毫升，配制两种Xcel培养基。使用0.2微米滤器过滤该培养基。添加目标细胞系正常培养所需的其他组分。

例如，在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中培养CMT 1 67细胞系。使用前将培养基在热水浴中预热至37°C。现在配制一份Xcel培养基。

然后，通过将1克营养琼脂加入100毫升去离子水中，制备1%营养琼脂。接着，通过将0.6克营养琼脂加入100毫升去离子水中，制备0.6%营养琼脂。随后对营养琼脂混合物进行高压灭菌。

随后，用1×PBS配制一毫克每毫升的四唑蓝氯化物（nitro blue tetra oleum chloride）储备液，用于菌落染色。在此步骤中，将1% noble琼脂溶液瓶放入微波炉加热约一至两分钟。需密切观察溶液，防止沸腾溢出。

然后继续间歇加热并搅拌，直至琼脂完全溶解且溶液变得澄清。随后，将融化的琼脂溶液和预热的两倍浓度培养基放入装有42摄氏度自来水的冰桶中。

此外，将一个50毫升的锥形管放入冰桶中的试管架内，并加入热水。接着，将冰桶转移至细胞培养操作台。然后向该50毫升锥形管中加入6毫升培养基和6毫升1%的Noble琼脂溶液。

反复吹打数次以混匀。操作需迅速，以防止软琼脂过早凝固。随后，用5毫升血清移液管吸取约5.5毫升混合液。

让气泡上升至移液管柱的顶部。然后将1.5毫升混合物加入每个孔中，避免带入任何气泡。盖上培养板，在室温下的细胞培养操作台中静置30分钟，使琼脂混合物凝固。

首先，用胰蛋白酶消化收获细胞，并将细胞以1:5的比例稀释至培养基中，转移至15毫升锥形管。计数细胞，并计算每孔所需的细胞数量，以在此时制备最终的细胞悬液。接下来，用微波炉熔化0.6%琼脂溶液。

将其放入装有热水的冰桶中，并与一个50毫升锥形管（置于试管架上）以及最终的细胞悬液一同放置。然后将装有已融化的0.6%琼脂的冰桶转移至细胞培养超净台中，用于后续操作。为准备六孔板所需的总共12毫升细胞悬液，首先用移液器将6毫升细胞悬液转移至50毫升锥形管中。

然后向试管中加入6毫升0.6%的琼脂。将混合物保持在42摄氏度，以防止过早凝固并最大限度地提高细胞存活率。随后，迅速用移液器吹打混合物2至3次，以均匀分散细胞。

用一支5毫升的血清移液管吸取5.5毫升混合液，并让移液管柱顶部的任何气泡上升至顶端。然后将1.5毫升混合液分别加入每个孔中。在细胞培养超净台中室温下静置30分钟，使细胞琼脂混合液凝固，之后将其放入37摄氏度的加湿细胞培养孵箱中。

每周两次在琼脂上层加入 100 微升培养基，以防止干燥，并培养约 21 天，使菌落充分形成。对细胞染色时，向每个孔中加入 200 微升氯化硝基蓝四唑溶液，将培养板在 37 摄氏度下孵育过夜。菌落染色完成后，使用成像仪拍摄各孔的照片，并利用图像分析软件计数菌落。

图中显示的是表达空载体的 CMT167 LNCX LPCX 细胞与 CMT167 LL-Wnt7a/Frizzled-9 过表达细胞的软琼脂集落形成实验结果。将表达空载体的 CMT167 LNCX LPCX 细胞以及 CMT167 LL-Wnt7a/Frizzled-9 过表达细胞接种于软琼脂集落形成实验中。CMT167 LL-Wnt7a/Frizzled-9 细胞在培养后显示出集落形成能力显著降低。

该技术为癌症研究领域的研究人员探索细胞在体外的转化提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估细胞的锚定非依赖性生长能力。