Name: 软琼脂集落形成分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习软琼脂集落形成分析方法，用于定量检测细胞锚定非依赖性生长并评估转化细胞的致瘤潜能。该技术通过双层琼脂培养体系结合染色定量，为肿瘤生物学研究提供可靠的体外转化表型验证手段。

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本研究由美国退伍军人事务部的杰出贡献奖以及美国国立卫生研究院资助项目 R01CA1385282522717（资助对象：RW）提供支持。

1. 材料与试剂的准备
<ol>
	<li>为每个待研究的细胞系或实验条件，在组织培养处理过的6孔板上标记相应的孔。</li>
	<li>通过将1 g粉末培养基和0.2 g碳酸氢钠溶解于去离子水中，定容至50 ml，配制2倍浓度的细胞培养基。</li>
	<li>用0.2 μm滤膜过滤该培养基以实现灭菌。</li>
	<li>添加目标细胞系正常培养所需其他组分。例如，将CMT 167细胞系培养于RPMI 1640培养基中，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素溶液。使用前在37 °C水浴中预热培养基。</li>
	<li>按目标细胞系正常培养条件，单独配制1倍浓度的细胞培养基。</li>
	<li>将1 g琼脂糖加入100 ml去离子水中，配制1%琼脂糖溶液。 
	注意：仅靠振荡无法使琼脂糖完全溶解。</li>
	<li>将0.6 g琼脂糖加入100 ml去离子水中，配制0.6%琼脂糖溶液。两种琼脂糖溶液均可在带可密封盖的100 ml玻璃瓶中配制，以便长期储存。</li>
	<li>将琼脂糖混合物进行高压灭菌。这些混合物可提前配制，并在4 °C保存；但在实验时需再次加热，直至琼脂糖完全溶解。</li>
	<li>通过将硝基蓝四氮唑氯化物溶于1×PBS（8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶于H2O，定容至1,000 ml）中，配制1 mg/ml的储备液。该溶液将在实验结束时用于菌落染色。</li>
</ol>
2. 铺制琼脂底层
<ol>
	<li>松开1% noble agar瓶盖，放入微波炉加热约1-2分钟。在微波炉加热过程中需密切观察溶液，防止沸腾溢出。持续加热并间歇混匀，直至琼脂完全溶解且溶液澄清。 
	注意：加热后使用耐热手套操作烧瓶。未采取防护可能导致烫伤或严重伤害。</li>
	<li>将融化的琼脂溶液和预热的2倍培养基置于装有热水（42 °C）的冰桶中。同时将一支50 ml锥形管放入冰桶内的试管架中，并置于热水中。将冰桶转移至细胞培养操作台以进行后续步骤。</li>
	<li>对于6孔板每孔的底层琼脂，需使用1.5 ml琼脂与培养基的混合液。</li>
	<li>为确保混合液充足，每块6孔板需准备总量12 ml的混合液。</li>
	<li>首先向50 ml锥形管中加入6 ml培养基，再加入6 ml 1% noble agar溶液。</li>
	<li>反复倒置锥形管数次以充分混匀。操作应迅速，以防止软琼脂过早凝固。</li>
	<li>用5 ml移液管吸取约5.5 ml混合液。</li>
	<li>在将混合液加入各孔前，先让移液管内的气泡上升至液柱顶部，然后向每孔加入1.5 ml混合液。注意避免将气泡排入孔中。</li>
	<li>盖上培养板，于细胞培养操作台内室温静置30分钟，使琼脂混合液凝固。</li>
</ol>
3. 铺加含细胞的上层琼脂
<ol>
	<li>待下层琼脂凝固后，开始准备上层琼脂。</li>
	<li>首先通过胰蛋白酶消化法收集细胞，并按1:5比例将其稀释于培养基中（例如，每1 ml胰蛋白酶加入4 ml培养基），转移至15 ml锥形管中。</li>
	<li>计数细胞，并计算每孔所需细胞数量，以在此时制备最终的细胞悬液。该数值因细胞类型而异。可先以每孔5,000个细胞作为起始点，并根据需要进行调整。对于该细胞数量，应制备浓度为6,667个细胞/ml的细胞悬液（即，每孔将加入0.75 ml该悬液和0.75 ml琼脂，总体积为1.5 ml；细胞浓度将因此稀释1:2，最终细胞总数为5,000个）。</li>
	<li>每孔所需细胞悬液体积仍为1.5 ml。每块6孔板需额外准备总计12 ml的细胞悬液。</li>
	<li>如前所述，用微波炉熔化0.6%琼脂溶液，并将其连同装有50 ml锥形管的试管架以及第3.3步所得的最终细胞悬液一同放入盛有热水的冰桶中。</li>
	<li>将含有熔融0.6%琼脂的冰桶转移至细胞培养超净台，用于后续操作。</li>
	<li>按1:1比例混合0.6%琼脂与细胞悬液，每块6孔板共制备12 ml总体积。每孔需1.5 ml，但应如上所述额外多制备一些。</li>
	<li>用移液器将6 ml细胞悬液转移至50 ml锥形管中。</li>
	<li>然后向管中加入6 ml 0.6%琼脂。 
	注意：此混合液的温度必须保持在约42 °C，以防止过早凝固并最大限度提高细胞存活率。</li>
	<li>迅速操作，将此混合液轻柔吹打2–3次以混匀细胞，然后用5 ml血清移液器吸取5.5 ml混合液。</li>
	<li>在将1.5 ml混合液加入每孔之前，先让移液器内的气泡上升至液柱顶部，注意避免将气泡排入培养板孔中。</li>
	<li>将细胞/琼脂混合液置于细胞培养超净台中室温下静置30分钟，使其凝固，然后放入37 °C、加湿的细胞培养孵箱中。</li>
	<li>不同细胞系形成足够克隆所需时间各异，通常约为21天。</li>
	<li>应在上层琼脂上方维持一层生长培养基，以防止干燥。每周两次每次添加100 μl培养基即可满足此需求。</li>
</ol>
4. 染色培养皿并计数菌落
<ol>
	<li>通过向每个孔中加入 200 μl 氯化硝基蓝四唑溶液对细胞进行染色，并将培养板在 37 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>待菌落染色后，使用成像仪拍摄各孔的图像，并利用图像分析软件计数菌落。</li>
</ol>

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro%3B+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li>
<li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis%3A+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li>
<li>Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+stem+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in stem and cancer stem cells.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).</li>
<li>Reya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Wnt+signalling+in+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 423, 409-414 (2003).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Wnt+signaling%3A+can+we+safely+eradicate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells.</a> Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).</li>
<li>De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FCa2%2B+signaling+pathway%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).</li>
<li>Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+Wnt7a+is+modulated+by+DNMT1+and+cigarette+smoke+condensate+in+non-small+cell+lung+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer).</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Wnt-7a+expression+reverses+non-small+cell+lung+cancer+cellular+transformation+through+frizzled-9-mediated+growth+inhibition+and+promotion+of+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation.</a> J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+effect+of+Wnt+7a+and+Fzd+9+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+is+mediated+through+ERK-5-dependent+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).</li>
<li>Tennis, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty-4+inhibits+transformed+cell+growth%2C+migration+and+invasion%2C+and+epithelial-mesenchymal+transition%2C+and+is+regulated+by+Wnt7A+through+PPARgamma+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer.</a> Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).</li>
<li>Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+properties+of+high-+and+low-metastatic+cell+lines+selected+from+a+spontaneous+mouse+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma.</a> Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

体外验证信号蛋白的肿瘤抑制功能具有挑战性。目前可用于研究该特性的最严格的方法之一是软琼脂克隆形成实验。本文中，我们以稳定过表达 Wnt7a 和 Fzd9 的小鼠肺癌细胞系与亲本 CMT167 细胞系为模型，展示了软琼脂克隆形成实验的操作过程。
关于软琼脂实验，有几个重要的注意事项需要考虑。该实验中最关键的步骤是细胞铺板。细胞计数必须准确，且琼脂溶液的温度不能过高。如果未形成菌落，可能是细胞因热应激而受损。在这种情况下，应重复实验，并采取预防措施，使琼脂温度尽可能接近 42 °C。或者，也可以增加铺板的细胞数量。
软琼脂实验存在一些局限性。其一，该实验需要两到三周才能完成；其二，实验结束后无法回收细胞。对该技术的一些改进采用了特殊的琼脂溶液，使实验结束后能够收获细胞用于DNA或蛋白质分析。其他替代方法则利用荧光染料，以实现高通量检测。尽管如此，传统的软琼脂克隆形成实验仍然是验证细胞锚定非依赖性生长的最严格检测方法之一。

软琼脂集落形成实验是一种广泛用于评估细胞转化的常用技术 体外历史上，另一种由Puck描述的检测方法，即克隆形成实验 等 1956年用于评估细胞形成集落的能力1在此技术中，细胞被分散接种于培养板上，并在饲养细胞或条件培养基存在下培养，以提供必要的生长因子。该技术的局限性在于仅能提供有关集落形成的信息。正常细胞由于一种称为失巢凋亡的特定类型凋亡性死亡，无法进行锚定非依赖性生长。2然而，转化细胞具有无需贴附于基质即可生长和分裂的能力。基于这一特性，研究人员开发了软琼脂克隆形成实验。近年来，该实验已根据特定需求进行了多种改良。其中一种改良方法是加入荧光染料，以实现克隆的高通量计数；另一种改良方法则是使用特殊配方的琼脂溶液，以便在克隆形成后回收具有活性的细胞，用于后续蛋白质或DNA样本的提取。
在传统的软琼脂集落形成实验中，细胞被培养在一层含有细胞培养基的软琼脂中，该层软琼脂覆盖在另一层同样含有细胞培养基但琼脂浓度更高的软琼脂之上。这种结构可防止细胞贴附于培养皿表面，但允许转化细胞形成可见的集落。该技术的原理在于，正常细胞需要与细胞外基质接触才能生长和分裂，而转化细胞则能够在不受周围环境影响的情况下进行生长和分裂。因此，能够在无锚定依赖条件下形成集落的细胞被认为已发生转化并具有致癌性。该方法的总体目标是以半定量且严格的方式测定细胞的这种能力。
Wnt信号通路在胚胎发育过程中至关重要，并且在肿瘤发生中常常出现失调3-6。与Wnt信号相关的通路有多种。经典通路涉及Wnt信号通过其对转录共激活因子β-catenin的作用，调控下游基因的转录。Wnt还可通过若干非经典通路传递信号，例如平面细胞极性通路，该通路调控参与细胞骨架结构的组分7；以及Wnt-钙离子通路，该通路调控内质网中钙离子的释放8。Wnt配体通过与Frizzled受体结合而发挥其生物学活性。尽管已有研究表明多种Wnt在肺癌中表达上调，但Wnt7a在非小细胞肺癌中因启动子甲基化而表达下调9。Wnt7a与Fzd9结合，并通过非经典通路发挥肿瘤抑制作用。恢复Wnt7a和Fzd9的表达可抑制非小细胞肺癌细胞的生长10。Wnt7a/Fzd9的作用是通过激活ERK-5介导的，后者进一步激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）11,12。本文中，我们证明Wnt7a和Fzd9的过表达可抑制小鼠肺癌细胞系的锚定非依赖性生长。小鼠CMT167细胞系来源于C57BL/lcrf小鼠的肺部肿瘤13，并被稳定转染了Wnt7A和Fzd9。通过定量PCR（Q-PCR）证实了Wnt7A和Fzd9的过表达，并通过下游PPARγ的激活验证了Wnt7A和Fzd9过表达的功能活性。

<table><tbody><tr><td>感兴趣的癌细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 细胞</td></tr><tr><td>粉末状 RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>用于配制 2x 细胞培养基。</td></tr><tr><td>液体 RPMI 1650 培养基</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>称为 1x 细胞培养基。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>用于补充细胞培养基。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>用于细胞培养基中。</td></tr><tr><td>Difco Noble 琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>用于配制 1.0% 和 0.6% 琼脂。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>用于 2x 细胞培养基中。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>无菌瓶顶滤器</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>用于对 2x 培养基进行无菌过滤。</td></tr><tr><td>Lipofectamine 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>用于 PPAR-RE 荧光素酶检测。</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;#176;C/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc 成像仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>用于拍摄克隆集落图像。</td></tr><tr><td>Quantity One 软件</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>用于计数细胞克隆集落。</td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 三角烧瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（带盖玻片）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>耐热手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>保鲜膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

软琼脂集落形成实验

The Soft Agar Colony Formation Assay

非贴壁依赖性生长是转化细胞脱离固体表面而独立生长的能力，是癌变过程的典型特征。软琼脂克隆形成实验是表征该能力的成熟方法。 体外 被认为是检测细胞恶性转化的最严格方法之一，并允许对不同处理条件下细胞的这种能力进行半定量评估。在此，我们将利用小鼠肺癌细胞系CMT167演示软琼脂克隆形成实验，以展示Wnt信号通路中两个成员Wnt7A和Frizzled-9（Fzd-9）的肿瘤抑制作用。Wnt7a和Fzd-9的共过表达导致CMT167细胞克隆形成受到抑制。这表明，在小鼠肺癌模型中，Wnt7a配体及其Frizzled-9受体的表达足以抑制肿瘤生长。

Wnt7A 和 Fzd9 在 CMT167 细胞中的表达可通过软琼脂集落形成实验观察到具有肿瘤抑制作用。初步实验中，我们采用定量聚合酶链反应（Q-PCR）证实，CMT167 细胞中 Wnt7A 和 Fzd9 的 mRNA 表达水平较低。与 SV40 转化的鼠肺上皮细胞系 MLE-12 相比，CMT167 细胞内源性 Wnt7A 和 Fzd9 的表达水平较低图1随后，我们使用两种分别表达人源 Wnt7A（LNCX-Wnt7A）和 Fzd9（LPCX-Fzd9）的逆转录病毒过表达载体转染 CMT167 细胞，以建立稳定表达 Wnt7A 和 Fzd9 的细胞系（CMT LL Wnt7a/Fzd9）。通过 Q-PCR 在该细胞系中验证了 Wnt7A 和 Fzd9 的表达图2）。正如我们之前的研究所示，PPARγ 是 Wnt7A/Fzd9 信号通路的下游效应分子。Wnt 信号通路具有多样性，因此必须通过已知可被特定 Wnt/Fzd 配体-受体对激活的下游效应分子来评估特定 Wnt 及其 Fzd 受体的正确表达与激活情况。对于 Wnt7A 和 Fzd9，正是基于这一原因选择了 PP...

软琼脂集落形成实验是一种用于体外确认细胞锚定非依赖性生长的方法。in vitro。本实验方案的目标是展示一种严格的方法，用于检测转化细胞的致瘤潜能以及蛋白质对转化细胞的肿瘤抑制作用。

锚定非依赖性生长是指转化细胞能够在不依赖固体表面的条件下生长，是癌变过程的一个重要特征。软琼脂培养法……

本实验的总体目标是定量测定细胞的非贴壁依赖性生长能力。首先，在细胞培养板上铺一层琼脂并使其凝固，以实现这一目标。第二步是将细胞与琼脂的混合物铺在先前凝固的琼脂层之上。接下来，让细胞在数周时间内形成集落。最后一步是对集落进行染色，以便观察和定量分析。最终，软琼脂集落形成实验用于显示锚定非依赖性生长，作为细胞转化的一个指标。与克隆形成实验等其他方法相比，该技术的主要优势在于软琼脂克隆形成实验要求细胞以非贴壁依赖的方式形成克隆。开始实验前，应为每个待研究的细胞系或实验条件，正确标记组织培养处理过的六孔板的每个孔。接下来，通过将1克粉末培养基和0.2克碳酸氢钠溶解于去离子水中，定容至50毫升，配制两种Xcel培养基。使用0.2微米滤器过滤该培养基。添加目标细胞系正常培养所需的其他组分。例如，在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中培养CMT 1 67细胞系。使用前将培养基在热水浴中预热至37°C。现在配制一份Xcel培养基。然后，通过将1克营养琼脂加入100毫升去离子水中，制备1%营养琼脂。接着，通过将0.6克营养琼脂加入100毫升去离子水中，制备0.6%营养琼脂。随后对营养琼脂混合物进行高压灭菌。随后，用1×PBS配制一毫克每毫升的四唑蓝氯化物（nitro blue tetra oleum chloride）储备液，用于菌落染色。在此步骤中，将1% noble琼脂溶液瓶放入微波炉加热约一至两分钟。需密切观察溶液，防止沸腾溢出。然后继续间歇加热并搅拌，直至琼脂完全溶解且溶液变得澄清。随后，将融化的琼脂溶液和预热的两倍浓度培养基放入装有42摄氏度自来水的冰桶中。此外，将一个50毫升的锥形管放入冰桶中的试管架内，并加入热水。接着，将冰桶转移至细胞培养操作台。然后向该50毫升锥形管中加入6毫升培养基和6毫升1%的Noble琼脂溶液。反复吹打数次以混匀。操作需迅速，以防止软琼脂过早凝固。随后，用5毫升血清移液管吸取约5.5毫升混合液。让气泡上升至移液管柱的顶部。然后将1.5毫升混合物加入每个孔中，避免带入任何气泡。盖上培养板，在室温下的细胞培养操作台中静置30分钟，使琼脂混合物凝固。首先，用胰蛋白酶消化收获细胞，并将细胞以1:5的比例稀释至培养基中，转移至15毫升锥形管。计数细胞，并计算每孔所需的细胞数量，以在此时制备最终的细胞悬液。接下来，用微波炉熔化0.6%琼脂溶液。将其放入装有热水的冰桶中，并与一个50毫升锥形管（置于试管架上）以及最终的细胞悬液一同放置。然后将装有已融化的0.6%琼脂的冰桶转移至细胞培养超净台中，用于后续操作。为准备六孔板所需的总共12毫升细胞悬液，首先用移液器将6毫升细胞悬液转移至50毫升锥形管中。然后向试管中加入6毫升0.6%的琼脂。将混合物保持在42摄氏度，以防止过早凝固并最大限度地提高细胞存活率。随后，迅速用

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

软琼脂集落形成分析

克隆形成实验用于评估细胞增殖活力的适用性已有50多年的历史。本文中，我们演示了使用贴壁细胞进行克隆形成实验的一般操作步骤。...

克隆形成实验：贴壁细胞

在使用用于培养微生物的培养基和试剂时，必须采用无菌技术，以确保将污染降至最低。多种平板接种方法被常规用于分离、扩增或计数细菌和噬菌体，这些方法均包含维持实验材料无菌状态的操作步骤。...

无菌实验技术：平板接种方法

本视频介绍了一种软琼脂集落形成实验，用于检测PADI酶抑制剂和BB-Cl-amidine对乳腺癌致瘤性的体外作用。in...

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本视频介绍了集落形成实验，该实验有助于确定肺癌细胞无限增殖并形成独立集落的能力。通过分析所形成集落的数量和/或大小的变化，我们可以评估抗癌药物对集落形成细胞的影响。...

克隆形成实验：评估抗癌药物对克隆形成型肺癌细胞的抑制效果

来源：Cayron, J., and Lesterlin, C. 应激处理条件下细菌生长的多尺度分析。 J. Vis. Exp. (2019)本视频演示了在使用抑制细胞分裂的抗生素处理条件下，通过平板计数法测定活力以及流式细胞术分析细胞大小和DNA含量，来评估大肠杆菌（E.

评估抗生素诱导的丝状化现象 大肠杆菌 使用平板测定法和流式细胞术

来源：Temkin, M. I. 等．用于研究微生物相互作用的高通量共培养实验．J. Vis. Exp. (2019)本视频演示了一种 体外 研究微生物间相互作用的检测方法 Corynebacterium propinquum 和 金黄色葡萄球菌...

一种用于研究共培养中微生物相互作用的体外实验方法

蛋白质之间会相互作用，而这些相互作用在很大程度上决定了它们的功能。可通过基于二氢叶酸还原酶蛋白片段互补分析法（DHFR-PCA）的酵母适合度检测，在高通量条件下在活体（in...

活细胞中基于蛋白质片段互补分析法（PCA）的全基因组蛋白质-蛋白质相互作用筛选

本文记录了利用软琼脂集落形成实验检测肽基精氨酸脱亚氨酶（PADI）抑制剂BB-Cl-amidine对乳腺癌致瘤性影响的方法。 体外.

利用软琼脂集落形成实验鉴定乳腺癌细胞中肿瘤发生抑制剂

通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。...

高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

本文描述了一种利用单细胞荧光显微镜技术在共培养条件下观察和定量细菌竞争的方法。...

使用单细胞荧光成像定量细菌间竞争

本方法采用96孔板形式对菌落形成单位（CFUs）进行接种，通过定量微生物丰度应用于整个果蝇匀浆样品中的Drosophila...

96孔板格式下的快速菌落形成单位计数应用于 黑腹果蝇 微生物组

学习软琼脂集落形成分析方法，用于定量检测细胞锚定非依赖性生长并评估转化细胞的致瘤潜能。该技术通过双层琼脂培养体系结合染色定量，为肿瘤生物学研究提供可靠的体外转化表型验证手段。

软琼脂集落形成实验

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