使用一次性气动生物反应器系统培养哺乳动物细胞

本实验的总体目标是大量培养哺乳动物细胞。首先校准 pH 和溶解氧（do）探针，然后对 pH 探针、do 探针以及温度探针套管进行高压灭菌。第二步是将探针和套管插入反应容器中，将容器放置于生物反应器上，并连接排气管、过滤器、气体管路以及温度探针。

下一步是连接溶氧（DO）和pH电极线缆，并无菌连接培养基和微载体，将其泵入生物反应器中。最后一步是启动控制器，以确保生物反应器达到设定的搅拌速度、温度和氧饱和度。最终，在接种并由计算机监控培养过程后，可对培养物进行处理，以提取和纯化目标产物。

与现有的可重复使用搅拌罐式生物反应器等方法相比，这种技术的主要优势在于气动轮生物反应器操作简便，并能最大限度地减少微生物污染的风险。让我们开始吧。首先登录到 hello 界面以启动实验方案。

接下来，检查pH传感器，确认传感器尖端已充满电解液。取一个装有pH 4溶液的烧杯，另一个装有pH 7溶液的烧杯，以及一个装有蒸馏水的洗瓶。然后将pH电缆连接到pH传感器上。

转到 hello 界面的操作选项卡，选择校准。然后选择 PHA 选项卡和两点校准。将缓冲液温度输入至校准溶液温度字段中。

将传感器放入 pH 4 溶液中进行校准，在零点字段中输入数值。待曲线稳定后，点击校准，然后用蒸馏水冲洗 pH 传感器。对 pH 7 重复校准步骤，并保存设置。

在跨度字段中输入缓冲值，并等待移植物稳定。开始溶解氧或进行校准。确保已将DO传感器连接到系统数小时，并已在校准选项卡中完成极化，选择DOA和两点校准。

断开溶解氧传感器的连接。在零点校准选项卡中输入 0，并等待曲线稳定。在选择“单点校准”之前，重新连接溶解氧传感器，并在量程字段中输入 100。

当曲线图稳定后，单击“校准二”。然后保存设置并关闭程序。校准完成后，将传感器和温控槽放入灭菌袋中，在121摄氏度、15 PSI条件下高压灭菌30分钟。

高压灭菌完成后，使用70%异丙醇对灭菌袋进行消毒，并将灭菌袋转移至生物安全柜（BSC）中。对试剂容器进行消毒后放入生物安全柜内。打开内层包装，检查容器和管路是否有损坏。

接下来，将溶解氧（DO）传感器安装至试剂瓶的左前侧端口，将温度探头安装至左后侧端口。将pH传感器安装至右前侧端口。打开传感器帽，将传感器轻轻旋入瓶体顶部的端口内。

然后将容器移出生物安全柜。确保pH和溶氧传感器的电缆位于容器套筒外部，且套筒内无任何物体。握住容器，使您面向其正面，将容器的底部先滑入套筒中。

确保容器底部放置在加热器上。然后小心地将温度传感器插入容器的温控孔中。接下来，从包装袋中取出管路套装。

将管路的颜色编码与生物反应器控制单元上对应的连接器和泵匹配。将培养基添加管路和取样管路沿着溶氧传感器和温度传感器后方布线，并将管路插入生物反应器左侧对应颜色编码的泵中。

连接主气路和微气路。将主气路接头插入对应的气体出口，以安装主气路。然后顺时针旋转微气路接头，将其拧入对应的气体出口，以安装微气路。

安装滤器烘箱管路时，打开滤器烘箱，将排气滤管固定到 uan 上。确保管路穿过两个挂钩，连接至滤器并伸出烘箱。将底部管路穿过滤器烘箱底部的挂钩，然后关闭箱门。

然后将电缆连接到溶氧（DO）和pH传感器。安装完成后，使用鲁尔接头在未使用的培养基管路与培养基瓶袋之间建立无菌连接。在Hello界面上导航至“操作”选项卡。

点击控制泵，选择培养基泵，然后点击滑块以开启培养基泵。接着加入 1.5 至 3.0 升培养基，再点击滑块关闭泵。此时系统已准备好将先前制备的微载体泵入反应器中。

可使用加样管路进行添加。使用无菌鲁尔锁接头将 MICROCAR 瓶连接至相应的加样管路。在控制泵界面中启动加样泵。

加入微载体后，使用滑块关闭泵，返回 hello 界面的主屏幕，选择操作，然后选择高级。选择相应的控制器以编辑设置。将控制器设为自动模式，并输入设定值。

设置好控制器后，打开气泵。观察试剂容器内部，确保气动转轮正在旋转。确保溶氧传感器已完全极化，且溶氧值已稳定。

然后校准溶解氧传感器，使用鲁尔接头将未使用的、带有一条橙色色带的培养基添加管与细胞瓶袋源进行无菌连接。接着，将管路的硅胶段安装到培养基泵中。确保管路夹处于打开状态，而分支管路的夹子处于关闭状态。

进入控制泵选项卡，然后打开培养基泵。加入细胞后，关闭培养基泵。接种后，进入操作选项卡并选择取样。

确保采样管已连接至采样泵，并根据屏幕上的指示操作采样三通阀。取下含有样品的注射器，用于细胞计数及其他后续应用，并进行细胞计数。最后，当细胞达到每毫升1.2×10⁶个细胞的所需密度时，以无菌操作将病毒接种物加入一个20 mL注射器中。

将注射器连接至反应器上的备用加料口。通过控制泵界面启动加料泵，加入病毒接种物。大部分 A549 细胞在两小时内贴附于微载体上。

12小时后，细胞在微载体表面表现出变扁和铺展的迹象。24小时时，微载体上的细胞分布均匀。微载体定植过程发生迅速，如本实验所示。

在接种后24小时，A549细胞对微载体的黏附率达到了75%。该图显示了腺病毒感染前后培养体系中可存活的A549细胞数量。感染后，细胞持续呈指数生长，至48小时时达到每毫升100万个细胞。

观看本视频后，您应能够充分理解如何组装和操作气动转轮生物反应器，以高密度培养哺乳动物细胞，用于细胞或蛋白的生产。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。