Name: 培养哺乳动物细胞使用一次性使用气动生物反应器系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习使用一次性气动生物反应器培养哺乳动物细胞的方法。本方案演示传感器校准、反应器组装和无菌操作步骤，帮助研究人员实现大规模细胞培养并降低污染风险。

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本项目部分得到了约翰斯·霍普金斯大学教务长办公室的资助 Gateway科学计划

1. 登录
<ol>
	<li>启动生物反应器。单击任意位置以打开登录页面。选择用户名，输入密码，然后单击“Login”。</li>
</ol>
2. 校准
<ol>
	<li>校准 pH 传感器（在灭菌前进行两点校准）。</li>
	<li>检查 pH 传感器，确认传感器尖端已充满电解液。准备两个烧杯，分别装有 pH 4 和 pH 7 的 pH 校准液（电解液），并备好装有蒸馏水的洗瓶。</li>
	<li>将 pH 电缆连接至 pH 传感器。在 Hello 界面中进入“操作”选项卡，点击“校准”。在“校准溶液温度”字段中输入缓冲液温度。</li>
	<li>将 pH 传感器放入缓冲液 1（pH 4）中，并在“零点”字段中输入数值。等待曲线稳定后，点击“校准 1”按钮。用蒸馏水冲洗 pH 传感器。</li>
	<li>将传感器放入缓冲液 2（pH 7）中。在“量程”字段中输入缓冲液 2 的数值。等待曲线稳定后，点击“校准 2”按钮。</li>
	<li>点击“保存”，然后点击“关闭”。</li>
	<li>校准溶解氧（DO）传感器。</li>
	<li>确保 DO 传感器已通过连接系统数小时完成极化。在 Hello 界面中进入“操作”选项卡，点击“校准”，然后点击“DO A”按钮。</li>
	<li>断开 DO 传感器连接，并在“零点”字段中输入 0。等待曲线稳定后，点击“校准 1”按钮。</li>
	<li>重新连接 DO 传感器，并在“量程”字段中输入 100。等待曲线稳定后，点击“校准 2”按钮。</li>
	<li>点击“保存”，然后点击“关闭”。</li>
</ol>
3. 高压灭菌并安装传感器和试剂容器
<ol>
	<li>校准后，将传感器和测温套管放入灭菌袋中，在121 °C、15 psi条件下高压蒸汽灭菌30分钟。</li>
	<li>用70%异丙醇（IPA）对灭菌袋进行消毒，并将灭菌袋转移至生物安全柜（BSC）中。拆除容器的外层包装。</li>
	<li>用70%异丙醇对内层包装进行消毒，并将容器转移至生物安全柜（BSC）中。拆除内层包装，检查容器及管路在运输过程中是否受损。</li>
	<li>将pH和溶氧（DO）传感器安装至前方两个端口，将测温套管安装至左后方端口。打开传感器帽。</li>
	<li>将传感器从传感器端口穿入，并顺螺纹将传感器牢固旋紧至端口内。</li>
	<li>将容器移出生物安全柜。</li>
	<li>将溶氧（DO）和pH传感器的电缆线挂在容器套筒外侧，确认套筒内无异物。将容器脚部朝前滑入套筒中。</li>
	<li>小心地将温度传感器插入容器的测温套管中。确保容器底部紧贴加热器。</li>
	<li>从包装袋中取出管路组件，根据管路的颜色编码与生物反应器控制单元上对应的连接口和泵进行匹配。</li>
	<li>通过将连接头按入气体出口来安装主气体管路；通过顺时针旋转连接头将其拧入气体出口以安装微气体管路；安装排气滤膜管路：</li>
	<li>打开滤膜烘箱。将排气滤膜固定在U型槽上，使管路穿过两个挂钩连接至滤膜，并从烘箱中引出。</li>
	<li>将冷凝袋的管路安装至管路支架中，关闭箱门。</li>
	<li>将添加管线A和B、两条培养基管路以及收获管路沿溶氧（DO）传感器后方布线，并引至生物反应器控制单元旁的实验台面上。</li>
	<li>将电缆连接至溶氧（DO）和pH传感器。</li>
</ol>
4. 添加培养基和微载体
<ol>
	<li>进入计算机界面中的“actions”选项卡，点击“Control Pumps”。</li>
	<li>通过管路焊接或使用鲁尔接头，将未使用过的培养基添加管路（1个橙色环）与培养基瓶/袋来源连接，形成无菌连接。</li>
	<li>点击滑块启动培养基泵；加入所需量的培养基后，再次点击滑块关闭培养基泵。</li>
	<li>将微载体珠粒置于无 Ca2+、Mg2+ 的 PBS 中，室温孵育 3 小时。</li>
	<li>用无 Ca2+、Mg2+ 的 PBS 多次洗涤珠粒。</li>
	<li>在 115 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。 
	注意：本实验中加入 3 g/L&#160;（干重）。</li>
	<li>以与步骤 4.1 添加培养基相同的方式，将已水化、洗涤并灭菌的微载体泵入反应器中。</li>
</ol>
5. 平衡与单点溶解氧校准
<ol>
	<li>将控制器设置为自动模式，并输入所需设定值。此处使用搅拌速度设定值（SP）= 15 rpm，温度设定值（SP）= 37.0 °C，pH = 7.2，溶氧（DO）= 100%。等待参数达到平衡。</li>
	<li>确认传感器已完全极化，确认溶氧（DO）当前值已稳定。</li>
	<li>进入“操作”选项卡，点击“校准”，选择“DO A”，点击“单点校准”。</li>
	<li>在“量程”字段中输入“100”，点击“校准1”按钮，点击“保存”，然后点击“关闭”：</li>
</ol>
6. 开始运行
<ol>
	<li>进入“操作”选项卡，点击“批量”。使用屏幕键盘或外接键盘输入一个不超过16个字符的批处理名称。</li>
	<li>点击屏幕键盘上的“隐藏”按钮。在弹出窗口中点击“开始”，确认并启动批处理。</li>
</ol>
7. 接种细胞
<ol>
	<li>通过焊接管路或使用鲁尔接头，将未使用过的培养基添加管路（1个橙色环）与细胞瓶/袋来源建立无菌连接。</li>
	<li>将管路的硅胶部分安装到培养基泵中，使箭头指向泵与容器之间的管路方向。</li>
	<li>检查管路夹是否已打开，其分支管路夹是否已关闭。点击滑块启动培养基泵，在添加细胞后点击“关闭”。</li>
	<li>进入“操作”选项卡，点击“控制泵”。</li>
</ol>
8. 取样
<ol>
	<li>接种后，可根据需要随时取样以监测培养物，取样方法如下：</li>
	<li>进入“操作”选项卡，点击“取样”。将取样管路放入取样泵中，并根据屏幕上的指示操作取样旋塞阀。</li>
	<li>对这些样品至少每天进行一次显微镜观察和细胞计数。</li>
	<li>当细胞达到所需密度时（本例中为 1.2 × 106 个细胞/mL），通过加入病毒接种物感染细胞。</li>
	<li>无菌条件下将接种物加入一个 20 mL 注射器中，并将注射器连接至反应器上的备用加样口。通过推动注射器活塞将接种物注入反应器中。</li>
	<li>继续取样并分析培养物中的腺病毒细胞内颗粒浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
<li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+Biotechnol+News%22%5BJournal%5D)">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. <a target="_blank" href="http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors">http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors</a> (2012).</li>
<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

作者 D. Giroux 和 Y. Hashimura 是 PBS Biotech 的员工，该公司生产本文所用的试剂和仪器。

这种一次性生物反应器系统使用相对简单，可提供用于反应器监测和分析的实时分析数据。它非常适合哺乳动物和昆虫细胞培养，细胞密度可超过3000万个细胞/毫升。除了本报告中描述的A549细胞11外，我们还在此生物反应器中培养了SF-9昆虫细胞。由气动空气轮提供的温和混合可减少细胞损伤。在设置该反应器时，有几个步骤至关重要。首先，pH和溶解氧（DO）传感器的正确校准对于培养过程的优化监测以及为调节系统pH或氧气而添加试剂至关重要。其次，试剂瓶和接种瓶必须在无菌环境（如生物安全柜）中完成填充并连接鲁尔接头。一旦试剂瓶被移出无菌环境，必须小心地将其与生物反应器的进液管路连接，以避免微生物污染。
尽管该生物反应器系统适用于哺乳动物和昆虫细胞系，但并不适用于细菌培养。该系统无法为细菌细胞提供所需的快速混合和供氧条件。细菌生长最好在搅拌罐式生物反应器中进行。与其他用于哺乳动物或昆虫细胞培养的一次性生物反应器相比，该系统操作简便，可提供足够的数据用于运行分析，且细胞生长效果达到或优于我们评估过的其他一次性系统。
一次性气动生物反应器系统有望满足生物治疗、疫苗、干细胞和个性化医学等领域的众多研究和临床应用需求4。此外，该系统的灵活性使其适用于分批、补料分批、灌流以及基于转染的生物反应器应用5。最后，一次性使用的一次性生物反应器系统有望满足大规模工业生产的需求，并符合国家和国际监管机构的指南与建议6-10。

根据生长特性，哺乳动物细胞系可分为三类：悬浮生长的细胞、聚集体生长的细胞以及依赖贴壁生长的细胞。尽管本视频中展示的气动式生物反应器能够培养这三类细胞，但本视频将重点演示如何利用该反应器在微载体上培养贴壁依赖型细胞。贴壁依赖型哺乳动物细胞可用于扩增细胞数量——即细胞本身即为目的产物。例如，目前正培养来源于人骨髓的间充质干细胞，以收获细胞并将其注射至病变组织中。本视频所展示的气动式生物反应器已被证实适用于此类间充质干细胞的生产（Serra et al.，个人交流，2013年）。
贴壁依赖性哺乳动物细胞通常在二维培养容器（如细胞培养板、细胞培养瓶或转瓶）中进行小规模培养，细胞会附着在经过特殊处理的生长表面1。当需要更多细胞时，可通过使用更多或更大的容器来扩大培养规模。然而，为了更经济高效地大量培养贴壁依赖性细胞，可采用称为微载体的小型固体微珠以增加细胞附着的表面积。根据细胞的附着特性，市面上有多种类型的微载体可供选择，例如葡聚糖、多肽或胶原蛋白包被的微载体。微载体具有较大的表面积与体积比，可为细胞生长提供更大的附着面积；同时，微载体可通过搅拌保持悬浮状态，从而使细胞可在生物反应器系统中高密度培养2。目前，用于在微载体上培养贴壁细胞的生物反应器类型包括旋瓶和搅拌罐系统，这些系统采用轴向搅拌桨以维持包被细胞的微载体处于悬浮状态。
成功培养细胞涉及多个重要因素，包括氧张力、剪切应力、表面基质以及营养物质和代谢产物的浓度。使用生物反应器可实现对生长条件的实时监测，并有望显著降低生产成本1常见的生物反应器设计有多种 体外 细胞培养，包括搅拌式悬浮培养、旋转壁式反应器、中空纤维培养、摇床平台上的袋式生物反应器以及流化床系统3这些系统在细胞培养和扩增过程中常常带来独特的问题，例如成本高昂、营养物浓度梯度、流体动力学剪切力、细胞聚集，以及在取样、监测和控制细胞扩增方面的困难。
多种贴壁细胞系被用于病毒的生产，无论是用于病毒疫苗的制备，还是用于基因治疗应用中的病毒载体生产。在本视频中，我们使用一次性气动式（Air-Wheel）生物反应器系统，演示在微载体上培养人肺癌细胞（A549）以生产溶瘤腺病毒的过程。该气动式生物反应器的设计采用由通入反应器底部的气体所产生的浮力驱动的垂直搅拌轮。这种温和的搅拌方式可限制流体动力学剪切力，同时仍能确保培养基与细胞的充分混合4。与搅拌罐式反应器相比，即使在大体积的Air-Wheel生物反应器系统中，气动式反应器的壁面剪切应力也较低（图1）。与搅拌罐式生物反应器不同，这种一次性反应器的垂直搅拌桨由容器内气泡流驱动，从而实现温和且均匀的培养基混合（图2）。

<table><tbody><tr><td>PBS 3&amp;nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性组装件</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人肺癌细胞（A549）</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>高糖DMEM培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA，0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 微载体</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>消泡剂C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

使用一次性气动生物反应器系统培养哺乳动物细胞

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

哺乳动物细胞、昆虫细胞和干细胞培养及放大技术的最新进展，为开发新型治疗手段和个性化医疗创新带来了巨大机遇。然而，要将这些进展转化为治疗应用，需要依赖体外（in vitro）系统，以实现高效、灵活且成本可控的生物反应器体系。目前在科研和商业环境中已有多种生物反应器系统被使用，但其中许多系统在建立、扩增和监测不同类型细胞生长方面并不理想。这些系统中最难控制的培养参数包括：尽量降低流体动力剪切力、防止营养梯度形成、实现培养基均匀供氧、避免微生物污染，以及实时监测和调节培养条件。我们采用一种气动式一次性生物反应器系统，展示了该新型生物反应器在微载体上培养哺乳动物细胞时的组装与操作过程。该生物反应器系统通过降低流体动力剪切力和营养梯度的形成，并实现培养基的均匀供氧，克服了现有系统中的诸多挑战。此外，该生物反应器的软件支持对运行参数进行远程实时监测与调节。该系统在规模化扩增贴壁和悬浮生长的哺乳动物细胞方面也具有巨大潜力，可用于生产多种治疗性蛋白、单克隆抗体、干细胞、生物类似药以及疫苗。

在图3中，显示了生物反应器运行的启动参数。该图展示了在设定温度、溶解氧、pH值和搅拌速度参数之前的界面。参数设定后，系统将对运行参数进行持续监测，并可根据需要进行调整，以维持所需的培养条件。软件提供连续的数据输出，便于快速识别问题。在本实验中，使用含10%胎牛血清（FBS）、250 ppm SAFC消泡剂C、2 mm L-谷氨酰胺和3 g/L微载体的2.5 L DMEM培养基，系统稳定后，氧气百分比为50%，温度为37 °C，pH值为7.2。将A549细胞以7 × 104 个细胞/ml（或每个微载体10个细胞）的浓度接种至反应器中。本实验所选参数使大多数细胞在2小时内即贴附于微载体上（图4）。12小时后，细胞开始在微载体表面呈现扁平化和铺展的形态（图5）。至24小时，微载体上的细胞分布相对均匀，无无细胞的微载体，也未见细胞在微载体上形成大团块（图6）。A549细胞对微载体的定植率在24小时时达到75%，之后升至90%（图7）。细胞继续以指数方式生长，至48小时时细胞密度达到约100万个细胞/ml（图8）。在50小时时以溶瘤腺病毒（2 × 108 病毒颗粒/ml）感染后，细胞密度短暂上升至120万个细胞/ml，随后随着裂解性感染的进展而开始下降。病毒接种物实现了约10,000倍的扩增。
在之前的实验中，我们发现监测和调节气体流速对于最大化细胞生长至关重要（未发表数据）。生长迅速的细胞可能会耗尽系统中的氧气，导致溶氧（DO）水平降至零。尽管细胞仍能继续生长，但速度显著减慢。在对数生长期，监测并调节氧气流速以满足细胞需求至关重要。每次实验运行均可通过比较pH、溶氧（DO）和温度与每日细胞计数来分析其最佳生长状态。
<img alt="生物反应器壁面剪切应力图；显示PBS与搅拌罐反应器在不同体积下的帕斯卡（Pa）应力比较；应力与体积关系。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 不同反应器体积下，气动生物反应系统（PBS）与搅拌罐式生物反应器的流体动力学特性对比，以壁面剪切力为测量指标。
<img alt="实验室实验中用于样品整理和储存的离心管架。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 气动空气涡轮反应器搅拌桨。
<img alt="生物反应器监测显示界面；参数：搅拌、温度、溶解氧、pH曲线。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 启动生物反应器运行所需参数的气动空气轮软件界面截图。
<img alt="荧光显微镜图像，180 µm 微珠，细胞定位研究，绿色荧光分析。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. A549 细胞接种后 2 小时在微载体上的定植情况。（微载体平均直径约为 180 µm。）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用GFP标记物突出显示蛋白质表达的细胞培养荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 培养开始12小时后，A549细胞正在贴附、变平并铺展到微载体上。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示绿藻菌落细胞结构的荧光显微镜图像，通过光学发射突出显示。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 细胞在培养 24 小时后附着于微载体表面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的微载体定植图；y轴：定植百分比，x轴：天数；趋势分析。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. A549细胞接种后在微载体上的定植百分比。
<img alt="活细胞生长曲线图；培养物中细胞密度随时间变化；细胞增殖分析。" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 8"> 
图 8. 腺病毒感染前后培养物中活A549细胞数量。 注意病毒感染步骤发生在50小时。

利用气动生物反应器，我们展示了这种一次性生物反应器系统在哺乳动物细胞培养中的组装、操作及性能。

哺乳动物、昆虫和干细胞培养及扩增技术的最新进展为新型治疗手段和个性化医疗创造了巨大机遇……

本实验的总体目标是大量培养哺乳动物细胞。首先校准 pH 和溶解氧（do）探针，然后对 pH 探针、do 探针以及温度探针套管进行高压灭菌。第二步是将探针和套管插入反应容器中，将容器放置于生物反应器上，并连接排气管、过滤器、气体管路以及温度探针。下一步是连接溶氧（DO）和pH电极线缆，并无菌连接培养基和微载体，将其泵入生物反应器中。最后一步是启动控制器，以确保生物反应器达到设定的搅拌速度、温度和氧饱和度。最终，在接种并由计算机监控培养过程后，可对培养物进行处理，以提取和纯化目标产物。与现有的可重复使用搅拌罐式生物反应器等方法相比，这种技术的主要优势在于气动轮生物反应器操作简便，并能最大限度地减少微生物污染的风险。让我们开始吧。首先登录到 hello 界面以启动实验方案。接下来，检查pH传感器，确认传感器尖端已充满电解液。取一个装有pH 4溶液的烧杯，另一个装有pH 7溶液的烧杯，以及一个装有蒸馏水的洗瓶。然后将pH电缆连接到pH传感器上。转到 hello 界面的操作选项卡，选择校准。然后选择 PHA 选项卡和两点校准。将缓冲液温度输入至校准溶液温度字段中。将传感器放入 pH 4 溶液中进行校准，在零点字段中输入数值。待曲线稳定后，点击校准，然后用蒸馏水冲洗 pH 传感器。对 pH 7 重复校准步骤，并保存设置。在跨度字段中输入缓冲值，并等待移植物稳定。开始溶解氧或进行校准。确保已将DO传感器连接到系统数小时，并已在校准选项卡中完成极化，选择DOA和两点校准。断开溶解氧传感器的连接。在零点校准选项卡中输入 0，并等待曲线稳定。在选择“单点校准”之前，重新连接溶解氧传感器，并在量程字段中输入 100。当曲线图稳定后，单击“校准二”。然后保存设置并关闭程序。校准完成后，将传感器和温控槽放入灭菌袋中，在121摄氏度、15 PSI条件下高压灭菌30分钟。高压灭菌完成后，使用70%异丙醇对灭菌袋进行消毒，并将灭菌袋转移至生物安全柜（BSC）中。对试剂容器进行消毒后放入生物安全柜内。打开内层包装，检查容器和管路是否有损坏。接下来，将溶解氧（DO）传感器安装至试剂瓶的左前侧端口，将温度探头安装至左后侧端口。将pH传感器安装至右前侧端口。打开传感器帽，将传感器轻轻旋入瓶体顶部的端口内。然后将容器移出生物安全柜。确保pH和溶氧传感器的电缆位于容器套筒外部，且套筒内无任何物体。握住容器，使您面向其正面，将容器的底部先滑入套筒中。确保容器底部放置在加热器上。然后小心地将温度传感器插入容器的温控孔中。接下来，从包装袋中取出管路套装。将管路的颜色编码与生物反应器控制单元上对应的连接器和泵匹配。将培养基添加管路和取样管路沿着溶氧传感器和温度传感器后方布线，并将管路插入生物反应器左侧对应颜色编码的泵中。连接主气路和微气路。将主气路接头插入对应的气体出口，以安装主气路。然后顺时针旋转微气路接头，将其拧入对应的气体出口，以安装微气路。安装滤器烘箱管路时，打开滤器烘箱，将排气滤管固定到 uan 上。确保管路穿过两个挂钩，连接至滤器并伸出烘箱。将底部管路穿过滤器烘箱底部的挂钩，然后关闭箱门。然后将电缆连接到溶氧（DO）和pH传感器。安装完成后，使用鲁尔接头在未使用的培养基管路与培养基瓶袋之间建立无菌连接。在Hello界面上导航至“操作”选项卡。点击控制泵，选择培养基泵，然后点击滑块以开启培养基泵。接着加入 1.5 至 3.0 升培养基，再点击滑块关闭泵。此时系统已准备好将先前制备的微载体泵入反应器中。可使用加样管路进行添加。使用无菌鲁尔锁接头将 MICROCAR 瓶连接至相应的加样管路。在控制泵界面中启动加样泵。加入微载体后，使用滑块关闭泵，返回 hello 界面的主屏幕，选择操作，然后选择高级。选择相应的控制器以编辑设置。将控制器设为自动模式，并输入设定值。设置好控制器后，打开气泵。观察试剂容器内部，确保气动转轮正在旋转。确保溶氧传感器已完全极化，且溶氧值已稳定。然后校准溶解氧传感器，使用鲁尔接头将未使用的、带有一条橙色色带的培养基添加管与细胞瓶袋源进行无菌连接。接着，将管路的硅胶段安装到培养基泵中。确保管路夹处于打开状态，而分支管路的夹子处于关闭状态。进入控制泵选项卡，然后打开培养基泵。加入细胞后，关闭培养基泵。接种后，进入操作选项卡并选择取样。确保采样管已连接至采样泵，并根据屏幕上的指示操作采样三通阀。取下含有样品的注射器，用于细胞计数及其他后续应用，并进行细胞计数。最后，当细胞达到每毫升1.2×10⁶个细胞的所需密度时，以无菌操作将病毒接种物加入一个20 mL注射器中。将注射器连接至反应器上的备用加料口。通过控制泵界面启动加料泵，加入病毒接种物。大部分 A549 细胞在两小时内贴附于微载体上。12小时后，细胞在微载体表面表现出变扁和铺展的迹象。24小时时，微载体上的细胞分布均匀。微载体定植过程发生迅速，如本实验所示。在接种后24小时，A549细胞对微载体的黏附率达到了75%。该图显示了腺病毒感染前后培养体系中可存活的A549细胞数量。感染后，细胞持续呈指数生长，至48小时时达到每毫升100万个细胞。观看本视频后，您应能够充分理解如何组装和操作气动转轮生物反应器，以高密度培养哺乳动物细胞，用于细胞或蛋白的生产。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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本文介绍了一种基于符合GMP标准的可溶性微载体的全封闭系统，用于实现贴壁细胞的大规模生产。该方法已验证可用于人源间充质干细胞、HEK293T细胞和Vero细胞的培养，其产量和质量均满足细胞与基因治疗产业的要求。...

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使用一次性气动生物反应器系统培养哺乳动物细胞

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