正常与疾病状态下纤维蛋白凝块结构的实验与成像技术研究

本实验的总体目标是研究糖尿病和镰状细胞贫血症中异常凝块结构的形态学差异，这两种疾病状态可用于模拟糖尿病相关血凝块。通过共聚焦显微镜对镰状细胞病患者血液样本中的糖化凝块结构进行成像，从而实现这一目标。含有红细胞的纤维蛋白凝块采用实时共聚焦成像技术进行观察。

随后可进行显微镜分析，以评估正常和糖化凝块结构上的纤溶速率。最终，这种实时分析可用于评估异常凝块结构在相应疾病状态下所发生的形态学差异。该方法有助于回答血栓形成与止血领域中的关键问题，例如糖尿病或镰状细胞病患者的纤维蛋白凝块结构有何不同。

为了通过共聚焦显微镜评估模拟糖尿病血栓，首先在37摄氏度下解冻人纤维蛋白原和10%荧光标记的人纤维蛋白原偶联物，当溶液升温后，将其与葡萄糖三钠氯化物溶液中的纤维蛋白原和纤维蛋白原偶联物混合，并将混合液置于37摄氏度水浴中避光孵育48小时。接近孵育结束时，使用非液体类粘合剂在玻璃载玻片两侧固定一层薄粘合剂，以形成一个腔室；然后将纤维蛋白原溶液与室温下的XIII因子和凝血酶混合，终体积为50微升，并立即转移30微升纤维蛋白溶液至载玻片腔室内。随后，将一块尺寸为22×22毫米、厚度为0.15毫米的玻璃盖玻片置于粘合剂上方，并用透明粘合剂密封腔室的开放边缘，注意避免粘合剂与血凝块接触。

将纤维蛋白凝块在21至23摄氏度下静置聚合2小时。随后使用40倍物镜和488纳米氩离子激光器采集凝块的共聚焦显微镜图像，以评估镰状细胞病患者的凝块情况。首先将红细胞样本用无血清细胞培养基稀释至每毫升100万个细胞，并通过轻柔吹打将细胞与5微升相应的细胞标记溶液混合。

在37摄氏度孵育20分钟后，将细胞在离心机中用37摄氏度的培养基洗涤三次，同时新鲜配制纤维蛋白原溶液、凝血因子XIII和凝血酶，配制方法如前所述。随后，将10微升标记的红细胞转移至纤维蛋白溶液中，并立即取30微升细胞溶液加入粘附腔室。将玻璃显微镜载玻片置于21至23摄氏度环境中，使纤维蛋白聚合2小时后，使用激发波长分别为488纳米和633纳米的激光共聚焦显微镜对凝块成像，以分别激发荧光标记的纤维蛋白和红细胞。

为了评估纤溶速率和糖化凝块结构，首先按照刚刚演示的方法制备糖化凝块。然而，在将纤维蛋白凝块溶液加入粘附腔室后，不要封闭腔室的两端。相反，将凝块置于密封容器中，在21至23摄氏度下聚合，容器内放置250毫升水以防止脱水。

一个半小时后，按照刚刚演示的方法，通过共聚焦显微镜采集凝块的图像。然后将 25 微升纤溶酶通过加样器加入到腔室的开口端，使纤溶酶通过毛细作用在凝块中扩散。最后，打开共聚焦显微镜软件的时间序列功能，点击采集模式，并选择时间序列。

然后选择循环次数和记录时间间隔，以捕获纤溶酶诱导的正常凝块与糖化凝块溶解过程的实时视频。分析显示，无论在凝块聚合过程中是否添加因子XIII，糖化凝块均比正常凝块更致密，孔隙更小。事实上，在UN型糖化凝块中，纤维蛋白浓度较低，形成的结构致密度低于含有较高纤维蛋白浓度的糖化凝块。镰状细胞病患者的纤维蛋白凝块中含有红细胞，由于这些个体中纤维蛋白原浓度升高，其结构比健康人的纤维蛋白凝块更为致密。

此外，镰状细胞病患者的红细胞具有自然聚集的倾向，形成红细胞团块，这些团块交织进入纤维蛋白网络，导致形成在形态上明显不同于正常患者血凝块的异常凝块结构。最后，对正常凝块与糖化凝块的纤维蛋白溶解速率分析表明，在缺乏足够纤溶酶的情况下，模拟糖尿病凝块的纤溶能力显著受损。这项研究将有助于推动血栓形成与止血领域的研究人员进一步探索，特别是针对因镰状细胞病和糖尿病而产生合并病理的患者。