对于检查纤维蛋白凝块结构在正常和疾病状态的实验和成像技术

该程序的总体目标是检查糖尿病和镰状细胞贫血中出现的异常凝块结构的形态学差异，模拟糖尿病凝块的疾病状况。这是通过共聚焦显微镜对镰状细胞患者的血液样本进行糖化凝块结构成像来实现的。含有红细胞的纤维蛋白凝块进行实时共聚焦成像。

然后可以进行显微镜分析以评估正常和糖化凝块结构的纤维蛋白溶解率。最终，这种实时分析可用于评估异常凝块结构中发生的形态学差异，以响应它们出现的疾病状态。这种方法可以帮助回答血栓形成和止血领域的关键问题，例如糖尿病或镰状细胞病患者的纤维蛋白凝块结构有何不同。

为了通过共聚焦显微镜评估模拟的糖尿病凝块，首先在 37 摄氏度下解冻人纤维蛋白原和 10% 荧光标记的人纤维蛋白原偶联物，当加热的溶液混合到人纤维蛋白原和纤维蛋白原偶联物中时，在葡萄糖氯化钠溶液中，并将溶液避光孵育在 37 摄氏度的水浴中 48 小时。在孵育接近尾声时，使用非液体基粘合剂在玻璃显微镜载玻片的两侧贴上薄粘合剂以形成一个腔室，然后将纤维蛋白原溶液与室温因子 13 和凝血酶混合至最终体积为 50 微升，并立即将 30 微升纤维蛋白溶液转移到显微镜载玻片室中。现在将一个 22 x 22 毫米的玻璃盖玻片放在胶粘剂顶部，尖头为 15 毫米，并用透明胶粘剂密封腔室的开口侧面，注意胶粘剂不会与凝块相互作用。

让纤维蛋白凝块在 21 至 23 摄氏度下聚合 2 小时。然后使用 40 倍物镜和 488 纳米氩激光采集凝块的共聚焦显微镜图像，以评估镰状细胞患者的凝块。首先在无血清细胞培养基中以每毫升 100 万个细胞的浓度稀释红细胞样品，然后轻轻移液将细胞与 5 μL 适当的细胞标记溶液混合。

在 37 摄氏度下 20 分钟后，在 37 摄氏度的培养基中洗涤细胞 3 次，同时将细胞在离心机中混合新鲜制备的纤维蛋白原溶液因子 13 和凝血酶，如刚才所示。然后将 10 微升标记的红细胞转移到纤维蛋白溶液中，并立即将 30 微升细胞溶液分配到粘合室中。在玻璃显微镜载玻片上，让纤维蛋白在两小时后在 21 至 23 摄氏度下聚合，使用波长为 488 纳米和 633 纳米的激发激光获取凝块的共聚焦图像，以分别激发荧光标记的纤维蛋白和红细胞。

为了评估纤维蛋白溶解率和糖化凝块结构，首先准备糖化凝块，就像刚刚演示的那样。但是，将纤维蛋白凝块溶液分配到粘合室后，不要密封腔室的末端。相反，让凝块在 21 至 23 摄氏度的密封外壳中聚合，其中装有 250 毫升水，以防止脱水。

一个半小时后，如刚才所示，通过共聚焦显微镜获取凝块的图像。然后将 25 微升纤溶酶移液到腔室的开口端，让纤溶酶通过毛细管作用分散在整个凝块中。最后，打开共聚焦显微镜软件的时间序列功能，单击采集模式并选择时间序列。

然后选择循环数和记录时间间隔，以捕获纤溶酶诱导的凝块裂解的实时视频片段正常和糖化凝块的分析显示，糖化凝块比正常凝块更致密，孔隙更小，在凝块聚合过程中添加和不添加因子 13。事实上，在 UN 糖化凝块中，纤维蛋白浓度较低，这产生的结构密度低于在糖化凝块中观察到的结构，后者含有较高的纤维蛋白浓度。来自镰状细胞患者的纤维蛋白凝块含有红细胞，并且由于这些个体的纤维蛋白原浓度增加，因此表现出比健康纤维蛋白凝块更致密的结构。

此外，镰状细胞患者的红细胞自然倾向于形成聚集体和性别，即交织到纤维蛋白网络中的红细胞团块，导致形成异常的凝块结构，这些结构在形态上与在正常患者中观察到的明显不同。最后，对正常与糖化凝块的纤维蛋白溶解率的分析表明，在缺乏足够的纤溶酶的情况下，模拟糖尿病凝块溶解纤维蛋白的能力显着受损。这项研究将有助于为血栓形成和止血领域的研究人员铺平道路，特别是对于因镰状细胞病和糖尿病而出现合并症的患者。