Name: 表征分子马达的组成对运动轴突货物用“货物映射”分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 探索分子马达蛋白与轴突囊泡运输方向性的关联机制。本研究利用微流控装置培养小鼠海马神经元，结合活细胞成像与免疫荧光技术，通过自定义MATLAB软件实现亚像素级共定位分析，揭示驱动蛋白与动力蛋白在轴突运输中的动态组成规律。

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我们感谢 Ge Yang、Gaudenz Danuser、Khuloud Jaqaman 和 Daniel Whisler 在适应和开发用于定量货物定位分析的软件方面提供的帮助，感谢 Emily Niederst 在制作微流控装置方面的协助。本工作部分由美国国立卫生研究院衰老研究所（NIH-NIA）资助项目 AG032180（资助对象 L.S.B.G.）以及霍华德·休斯医学研究所支持。L.S. 的研究部分得到了美国国立卫生研究院生物信息学培训基金 T32 GM008806 的支持；S.E.E. 受到了达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会博士后奖学金、美国国立卫生研究院神经可塑性培训基金 AG000216 以及艾略特医学基金会“衰老研究新学者奖”资助项目的支持；G.E.C. 受到了美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心（NIH/NCATS）&#160;1 TL1 奖项 TR001114 和大学科学家成就奖励基金会的支持。

所有实验均按照批准的方案进行，并遵循机构关于实验动物人道护理的指南。新生小鼠通过断头法处死。
1. 细胞培养用微流控装置的制备
<ol>
	<li>按照 Harris 及同事所述方法制备用于培养海马神经元的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置17-19。以下为针对货物定位实验方案所做的部分修改。 
	注意：微流控装置也可从商业途径获得（材料清单），因此无需具备加工设备。</li>
	<li>使用丙酮清洗 1½ 号盖玻片（24 × 40 mm）三次，接着用 100% 乙醇清洗三次，再用水清洗三次。将盖玻片储存于 4 °C 水中待用。这些处理步骤有助于确保盖玻片无可能干扰细胞接种、造成污染或影响细胞存活的碎屑残留。 
	注意：丙酮和乙醇具有可燃性，若接触皮肤（刺激物）、眼睛（刺激物）、摄入或吸入时具有危害性。应根据官方规定进行处置。</li>
	<li>使用前，将每片盖玻片放入 60 mm 细胞培养皿中，每个培养皿对应一个微流控装置，并在生物安全柜中敞口晾干 45 分钟，以避免污染。</li>
	<li>当装置从模具上切割下来，并打孔形成储液池后（图 1A, B），将其微流控通道面朝上置于配备紫外灯的生物安全柜中，进行 45 分钟的灭菌处理。 
	注意：若紫外照射时间超过 2 小时，可能会影响 PDMS 的完整性。</li>
	<li>将每个装置放置于 60 mm 塑料细胞培养皿内的盖玻片上，使微流控通道面朝下，完成装置组装。轻轻按压装置顶部（避免触碰微通道），使装置与盖玻片之间形成非永久性密封。用盖子盖好每个 60 mm 细胞培养皿。</li>
	<li>使用移液器，通过向顶部两个微流控储液池（图 1A 中的 1 和 2）加入细胞培养级水进行装置水化，使水流动通过通道。随后用移液器吸除水，并向微流控储液池 1（200 µl）和 2（100 µl）中加入 1 mg/ml 的多聚-L-赖氨酸。体积差将促使多聚-L-赖氨酸流经微通道（图 1A, B）。</li>
	<li>为防止 60 mm 细胞培养皿内的装置在 37 °C 培养箱中倾倒，将三个含装置的 60 mm 细胞培养皿放入一个 150 mm 塑料细胞培养皿中，并用盖子盖好。在 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。通常每个装置中超过 90% 的通道可用，且无气泡或物理堵塞。</li>
	<li>次日，用水替换多聚-L-赖氨酸，并将装置在培养箱中至少静置 1 小时。重复此洗涤步骤三次。吸除水后，向每个装置中加入 Neurobasal-A 生长培养基（含 2% B-27 补充剂和 500 µM GlutaMAX）。在 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。</li>
	<li>次日，按以下方法接种海马神经元。</li>
</ol>
2. 在微流控装置中接种小鼠海马原代神经元
注意：新生大鼠海马神经元的培养制备方法此前已在 JoVE 中发表25。以下是一些针对在微流控装置中培养小鼠海马神经元并优化转染效果所采用的改进步骤。
<ol>
	<li>在小鼠脑组织解剖前，将含10%胎牛血清（FBS；不含抗生素）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、混合液A（500 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中含125 mg DL-半胱氨酸、125 mg牛血清白蛋白（BSA）和3.125 g D-葡萄糖；经0.22 µm滤膜过滤除菌）以及脱氧核糖核酸酶I溶液（DNase I：100 ml汉克平衡盐溶液（HBSS）中含50 mg DNase I和0.5 ml 1.2 M MgSO4溶液，经0.22 µm滤膜过滤除菌）置于37 °C水浴中预热。
	<ol>
		<li>将Neurobasal-A生长培养基置于37 °C、5% CO2的培养箱中预热，以平衡pH值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照既定方案26分离1至3日龄新生小鼠的海马组织。将海马组织置于含有10 ml解剖缓冲液（HBSS含10 mM HEPES pH 7.4、50 mM葡萄糖、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）的15 ml锥形管中，并置于冰上。每支15 ml锥形管中最多放入4个海马组织。</li>
	<li>后续操作均需在生物安全柜内无菌条件下进行。</li>
	<li>将45单位木瓜蛋白酶溶于5 ml混合液A中，涡旋混匀，于37 °C孵育5分钟至木瓜蛋白酶粉末完全溶解。加入1 ml DNase I溶液。用0.22 µm注射器滤器过滤该混合液。</li>
	<li>小心吸除含有海马组织的15 ml锥形管中的HBSS。向海马组织中加入10 ml冷（4 °C）HBSS，并静置使组织沉降至管底。小心吸除15 ml锥形管中的HBSS。</li>
	<li>向最多4个海马组织中加入1 ml木瓜蛋白酶/DNase I混合液，于37 °C孵育20–30分钟。每隔5分钟倾斜锥形管一次，使海马组织充分接触混合液。也可将海马组织置于37 °C水浴摇床中，轻柔振荡（约100 rpm）。</li>
	<li>吸除木瓜蛋白酶/DNase I混合液，用预热至37 °C、含10% FBS的DMEM洗涤海马组织两次。</li>
	<li>第二次洗涤后，向海马组织中加入2 ml预热的含10% FBS的DMEM，使用1 ml移液枪头反复吹打约10–12次，手动进行机械解离以分散神经元。</li>
	<li>静置约1分钟，使未完全解离的组织块沉降至锥形管底部。将含有解离神经元的上清液转移至新的15 ml锥形管中，避免转移已沉降的较大组织块。</li>
	<li>以1,000 x g离心2分钟，小心吸除上清液，勿扰动细胞沉淀。用80 μl Neurobasal-A生长培养基轻轻吹打重悬细胞。</li>
	<li>移除微流控装置储液池1和1’中的培养基。向储液池1中加入20 µl细胞悬液（约275,000个细胞），使其自然流入通道。将装置置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育20分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察，确认细胞已贴附于盖玻片表面。向所有储液池中补充Neurobasal-A生长培养基至满。将装置连同细胞放回37 °C、5% CO2培养箱中继续培养。</li>
	<li>每隔约2–3天检查装置，并用含2% B-27补充剂（不含GlutaMAX）的Neurobasal-A培养基补充各储液池，防止蒸发。神经元通常在接种后约2–3天开始通过微流控通道延伸轴突。一般在接种后7–10天对神经元进行转染处理。</li>
</ol>
3. 微流控装置中培养的海马神经元的转染
<ol>
	<li>每个装置中，将 1.2 µl Lipofectamine 2000 与 30 µl Neurobasal-A 混合，同时将 0.5 µg 荧光标记的货物融合质粒与 30 µl Neurobasal-A 混合，室温孵育 5 分钟。将 Lipofectamine 混合液加入 DNA 混合液中，室温孵育 20 分钟。向 DNA/Lipofectamine 混合液中加入 60 µl 含 4% B-27 添加剂的 Neurobasal-A，并通过轻弹管壁混匀。</li>
	<li>移除微流控装置 2 和 2’ 中的所有培养基，并小心地用含 2% B-27 添加剂的 Neurobasal-A 填充孔，避免液体溢出至其他区域。</li>
	<li>移除微流控装置 1 和 1’ 中的培养基，向微流控装置 1 中加入 120 µl DNA/Lipofectamine 混合液，并使其流动。将装置放回 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育 3–4 小时。</li>
	<li>移除微流控装置 1 和 1’ 中的所有培养基，更换为含 2% B-27 添加剂的 Neurobasal-A，继续培养 24 小时（或直至准备成像）。通常在这些条件下，约有 5–7 根穿过微通道的轴突被成功转染，转染效率约为 1–3%，与已发表的海马神经元培养细胞的转染效率一致26。</li>
</ol>
4. “货物定位”分析
<ol>
	<li>货物运动的活体成像
	<ol>
		<li>在配备有37 °C培养箱和CO2控制腔室的倒置落射荧光显微镜上进行成像。</li>
		<li>将生长有海马神经元的盖玻片（置于微流控装置中）安装到显微镜载物台上。为避免神经元死亡，操作应迅速，使样品在显微镜下的停留时间不超过1小时。</li>
		<li>使用高分辨率物镜（100倍），找到穿过微流控腔室通道的转染细胞的轴突，并记录转染轴突所在的通道编号。使用手动计数器统计通道数量。
		<ol>
			<li>为了最佳记录活体运动并进行后续共定位分析，应选择在通道中相对平坦生长的轴突，以便大多数囊泡的成像均处于焦平面内。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用1 ml塑料移液管从储液池2和2’中移除大部分培养基。为便于后续将固定图像与运动轨迹在明场图（kymograph）上对齐，在成像时将微通道的右边缘与视野对齐（图1B, C）。</li>
		<li>为便于在成像过程中固定样品，建议由两人协作完成活体成像。或者，若由单人操作，则应使用配备漂移校正系统的显微镜。</li>
		<li>根据所分析货物的运输动力学特性，设置特定的时间序列参数，开始活体货物运动的成像（用于成像YFP-PrPC的显微镜参数和设置详见图2图注及材料清单）。</li>
		<li>在收集到足够的活体运动数据后，由一人向储液池2和2’中加入预热的含0.04 g/ml蔗糖的4%多聚甲醛PBS溶液以固定细胞。操作时避免触碰微流控装置，以免影响活体成像的焦距。另一人应在添加固定液的同时调整焦距。当观察到运动立即停止时，表明固定成功。随后向储液池1和1’中添加固定液。 
		注意：货物荧光可能出现暂时性光漂白，但在完成运动蛋白的免疫荧光染色（下一步）后，荧光仍会保留。 
		注意：多聚甲醛经吸入、皮肤接触或吞咽有害，对眼睛、呼吸系统和皮肤具有刺激性。应按照官方规定进行处置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于共定位分析的运动蛋白免疫荧光染色 
	注意：为定量分析与单个运动货物相关联的运动蛋白的相对水平（通过抗体染色确定），需验证并滴定抗体，以确保抗体-抗原结合达到饱和。可通过在目标蛋白被敲除或敲低的神经元中验证抗体特异性，并通过逐步增加抗体浓度进行免疫荧光分析来实现。阴性对照组神经元仅使用二抗染色，不加一抗。有关抗体验证的更详细描述，参见Encalada 等16 和 Szpankowski 等20。
	<ol>
		<li>将生长有海马神经元的盖玻片（置于微流控装置中）从显微镜载物台上取下。切勿将微流控装置从盖玻片上剥离，因为微通道必须保持完整，以便将活体图像与固定图像叠加。以下步骤均在湿盒中进行。</li>
		<li>为确保溶液能流入微通道，在后续所有步骤中，维持储液池1、1’与2、2’之间的缓冲液体积差至少为30 µl。例如，向微流控储液池2、2’中加入100 µl培养基，向储液池1、1’中加入70 µl培养基。</li>
		<li>从微流控装置的腔室中移除固定液，并用PBS洗涤细胞三次，每次间隔10分钟。</li>
		<li>向所有储液池中加入用PBS稀释的0.1% Triton X-100，孵育5分钟，以通透细胞。</li>
		<li>移除所有储液池中的溶液，并用PBS洗涤。重复洗涤三次，每次间隔10分钟。</li>
		<li>移除所有储液池中的溶液，加入封闭液（含10%正常驴血清和3%无蛋白酶、无免疫球蛋白G（IgG）的BSA的PBS），室温孵育至少30分钟。</li>
		<li>将一抗原液在20,000 × g下离心5分钟，以去除沉淀物。将抗体用封闭液稀释至适当浓度。用抗体溶液替换微流控装置中的封闭液。室温孵育2小时，或4 °C过夜。</li>
		<li>移除所有储液池中的溶液，并用PBS洗涤三次，每次间隔10分钟。</li>
		<li>将二抗原液在20,000 × g下离心5分钟，以去除沉淀物。将抗体用封闭液稀释至适当浓度。用二抗溶液替换PBS。室温孵育1小时。</li>
		<li>移除所有储液池中的溶液，并用PBS洗涤三次，每次间隔10分钟。</li>
		<li>用移液器直接将约10–20 µl封片剂滴加至连接储液池的通道开口处，替换PBS。让封片剂在室温下干燥约20分钟至1小时。</li>
		<li>将样品置于4 °C避光保存，以防止光漂白，并在染色后两天内（最长不超过一周）完成轴突成像。</li>
		<li>染色完成后，将生长有海马神经元的盖玻片（置于微流控装置中）重新安装到显微镜载物台上。定位步骤4.1.1–4.1.7中成像的转染轴突区域。</li>
		<li>使用高分辨率物镜（例如，高数值孔径油镜或水镜），对三个通道（货物、运动蛋白1、运动蛋白2）分别采集Z轴层扫图像（步长300 nm）。 
		注意：采集Z轴层扫图像非常重要，因为轴突在微通道中通常并非完全平坦生长，因此并非所有荧光斑点均处于同一焦平面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>货物定位映射
	<ol>
		<li>使用图像分析软件生成货物运动的明场图（kymograph）。推荐使用Rietdorf和Seitz（EMBL）开发的ImageJ插件生成明场图（下载信息见 材料清单）。 
		注意：ImageJ是由美国国立卫生研究院开发的基于Java的公共领域图像处理程序27,28（下载信息见材料清单）。</li>
		<li>使用商业绘图软件（材料清单），通过将固定后的荧光货物图像（步骤4.2.14生成）手动叠加至明场图中固定时刻的轨迹位置，实现图像对齐（图2A, B）。手动对齐时，首先将固定货物图像叠加到明场图上，然后手动选择与明场图中特定轨迹相对应的货物荧光斑点。为获得最佳对齐效果，应选择货物定位最清晰的Z层图像，可使用多个Z层图像。</li>
		<li>对于Z轴层扫图像中的每一幅（货物、运动蛋白1和运动蛋白2；步骤4.2.14生成），使用已建立的算法确定每个荧光斑点的X-Y坐标和强度幅值，该算法通过二维高斯拟合来拟合代表三个通道中每个点光源的点扩散函数16,20,21（图2D）。 
		注意：为获取X-Y坐标，开发了一套名为“Motor Colocalization”的定制MATLAB软件包16,20，其中集成了Jaqaman、Danuser及其同事开发的高斯拟合算法21–23。该软件包及详细使用说明可应要求提供。</li>
		<li>对于已映射到明场图中移动或静止轨迹上的各个货物斑点，从“Motor Colocalization”程序的结果中提取其X-Y坐标和强度幅值（这些货物在图2B中被单独标记）。使用步骤4.2.14中采集的多个Z轴层扫图像，以映射位于不同焦平面的更多货物。</li>
		<li>将已映射货物的各个X-Y坐标与相应Z层中各运动蛋白通道的坐标进行比较（图2D）。确定并选择距离货物300 nm半径范围内的运动蛋白X-Y坐标。对于在同一焦平面内具有信号的货物和运动蛋白，使用“Motor Colocalization”软件包确定位于300 nm半径范围内的斑点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案可实现运动方向性与 个体 基于荧光标记微管的运动货物颗粒及其相关马达蛋白的类型和相对含量 活体 神经元。此前，轴突囊泡运输货物的完整运动成分是在生化纯化的囊泡和细胞器的异质群体上进行检测的9,15然而，对运动成分进行表征对于一项 单个 细胞内货物类型的研究一直具有挑战性，原因是难以纯化出均一的囊泡群体。此外，尽管对马达蛋白失速力的测量可提供活跃马达分子数量的估算， 果蝇 胚胎中，尚不清楚运动方向性是否与马达蛋白稳定结合于货物有关，还是与活性马达蛋白快速结合/脱离货物相关12因此，本文所述的“货物定位”方案旨在进一步研究活神经元中单个移动货物所关联的马达蛋白类型及其相对数量之间的关系。
要成功获取“货物定位”数据，关键在于：1）以高时间和空间分辨率对货物运动及固定后的免疫荧光信号进行成像；2）在成像过程中立即对样品进行固定；3）对活细胞和固定后的图像中感兴趣区域进行对齐，并将固定后的货物与马达蛋白定位映射到同一图像的运动轨迹图（kymograph）上；4）精确定位...

细胞内运输在所有细胞类型中都至关重要，可将蛋白质、膜结构、细胞器和信号分子递送至细胞的不同区域1。神经元是具有长而极性突起的高度特化细胞，其轴突远端不同微区所需关键货物的长距离运输严重依赖细胞内运输。这一过程由驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins）介导——这两类分子马达蛋白大家族分别沿极性微管向顺向和逆向方向运输货物。虽然逆向运输主要由动力蛋白介导，但顺向运输则由功能多样、成员众多的驱动蛋白马达家族完成。因此，轴突货物的顺向运输可能由驱动蛋白超家族中的多个成员共同介导1-5。尽管部分货物在运输过程中持续朝单一方向移动，但大多数货物呈双向移动，并在其到达最终目的地的过程中频繁改变方向1,5-13。此外，已有研究表明，具有相反运动方向的马达蛋白可同时结合于同一货物上，这引发了一个问题：相反极性的马达如何协调调控货物的定向运动5-7。综上所述，轴突货物的运输是一个协同过程，受马达蛋白的组成及其特定生化活性的调控，而这些活性又依赖于多种适配蛋白和调控性结合伴侣14。
为了准确描述特定货物在轴突运输中的作用机制并揭示其运输过程的调控基础，至关重要的是确定在货物活体运输过程中与其相关联的马达蛋白及其调控性结合伴侣的组成。其他方法，例如生物化学方法，仅能提供对纯化后异质性囊泡群体中马达蛋白组成的平均估算，但无法揭示与单个运动囊泡相关联的马达蛋白类型或数量。此外，沿预先组装微管重建囊泡运输 体外 实现了在单个囊泡水平上测量一种类型分子马达的数量15然而，这些实验并未将马达蛋白的数量与囊泡的运输特性直接关联，并且在缺乏细胞调控因子的情况下测量了运输过程。
本文介绍了一种实验方案，该方案通过免疫荧光（IF）技术检测内源性表达的马达蛋白，确定单个运动囊泡的马达蛋白组成（马达类型及相对含量），并将这些参数与同一囊泡在神经元中的活体运输过程相关联16。该方法的关键在于实现免疫荧光数据与活体囊泡运动数据的精确定位对应（“映射”）。实验采用已建立的方案17-19，在微流控装置中培养小鼠海马神经元。这些装置可在固定样本和活体光学显微成像模式下，实现轴突及单个运动囊泡的识别与关联（“映射”）（图1）。培养的神经元被转染表达荧光标记的囊泡蛋白，并在高时空分辨率下成像其运输过程，获得详细的运动信息并绘制为动态图谱（kymograph）。在成像过程中，神经元经多聚甲醛固定后，使用针对内源性马达蛋白的抗体进行染色。将固定的囊泡与马达蛋白图像叠加至活体运动的动态图谱上，以“映射”（共定位）其与活体囊泡运动轨迹的对应关系16。为将囊泡的活体运动与其关联的马达蛋白进行关联分析，采用一种名为“Motor Colocalization”的自定义MATLAB软件包进行共定位分析16,20。荧光标记的囊泡与马达蛋白产生的信号为衍射极限下的点状结构，可能部分重叠。为解析重叠点状信号的精确位置，该软件首先自动对每个点扩散函数拟合高斯函数，以确定各个独立荧光点的精确X-Y亚像素坐标位置及其强度幅值21-23。随后比较马达蛋白与囊泡的位置，判断其共定位情况16,20。因此，与其它方法相比，该方法能更精确地判定荧光点状信号之间的共定位关系24。
该方法的优势在于能够评估固定细胞中马达蛋白与单个货物之间的共定位，其中已记录了活细胞中的运动轨迹（例如，固定时它们的运动方向）。利用该方法，发现驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins）可同时与携带正常朊蛋白（PrPC-cellular）的囊泡相关联，这是一种在轴突中双向移动或保持静止的神经元富集性货物16。该分析促使提出了一个关于PrPC囊泡运动调控的工作模型，在该模型中，顺向运输（驱动蛋白）和逆向运输（动力蛋白）的马达通过协调其活性，实现囊泡在任一方向上的移动或在与货物结合时保持静止。该方法的另一优势在于其具有广泛适用的潜力，可用于表征几乎所有细胞类型中多种荧光标记货物与任何其他目的蛋白之间的共定位/结合关系。因此，活细胞与固定细胞的关联分析可能有助于检测瞬时的蛋白质-货物相互作用，因为可在所需时间段内分析大量荧光标记的运动颗粒。鉴于该方法的广泛适用性及其所能解答的问题类型，本实验方案将引起广大细胞生物学家的兴趣，包括研究神经元或其他细胞类型中物质运输与转运的研究人员。

<table><tbody><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基），高糖，含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠（1x）</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基（1x）</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I 添加剂（100x）</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（1x）（Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液）</td><td>Life Technologies</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液，不含镁、不含钙）（1x）</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100x）</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro 细胞培养用水&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-半胱氨酸盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶 I，II 型</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;11668027</td><td></td></tr><tr><td>16% 电镜级甲醛溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>50980487</td><td>注意：吸入、皮肤接触或吞咽有害。对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。应按照官方规定进行处置。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>无脂肪酸和IgG的BSA</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 1 1/2，24 × 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Axis 微流控装置，450 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ 相机&amp;nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 细胞培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>所用抗体：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗驱动蛋白轻链抗体，V-17</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>sc-13362</td><td>使用 KLC1-/- 神经元验证特异性（参考文献 16），推荐稀释比例为 1:100。</td></tr><tr><td>抗动力蛋白重链 1 抗体，R-325</td><td>Santa Cruz&amp;nbsp;</td><td>sc-9115</td><td>使用针对 DYN1HC1 的 shRNA 验证特异性（参考文献 16），推荐稀释比例为 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗兔 IgG 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&amp;nbsp;推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG（H+L）抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&amp;nbsp;推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗山羊 IgG（H+L）抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A11057</td><td>&amp;nbsp;推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG（H+L）抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&amp;nbsp;推荐稀释比例为 1:200。</td></tr><tr><td colspan="4">插件与宏</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://imagej.nih.gov/ij/index.html&quot;&gt;&amp;nbsp;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ImageJ 轨迹图插件</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

要理解分子马达如何协调其活动以在神经元内运输囊泡货物，需要在单个囊泡水平上对马达与货物的关联进行定量分析。本实验方案的目标是利用定量荧光显微镜技术，将活细胞中货物的运动位置和方向性与其所结合的马达蛋白的组成及相对含量进行关联（“映射”）。这种“货物映射”包括：在微流控装置上培养的轴突中，对荧光标记的货物进行活体成像；在记录活体运动过程中进行化学固定；随后使用针对马达蛋白的抗体，对完全相同的轴突区域进行免疫荧光（IF）染色。通过拟合高斯函数至代表单个荧光点源的衍射受限点扩散函数，并为马达和货物通道分配亚像素级的位置坐标，从而评估货物与其相关马达之间的共定位。将固定的货物和马达图像叠加到货物运动轨迹图上，以将其“映射”至已追踪的运动路径。该方案的优势在于结合了活细胞成像与免疫荧光数据，既能记录囊泡货物在活细胞中的运输过程，又能确定与这些完全相同的囊泡所结合的马达蛋白。该技术克服了以往使用生化方法分析纯化的异质性大量囊泡群体平均马达组成的局限性，因为这些方法无法揭示单个运动中货物上的马达组成。此外，本方案还可适用于其他细胞类型中其他运输和/或 trafficking 通路的分析，以关联个别细胞内结构的运动与其蛋白质组成。该方案的局限性在于转染培养的原代神经元效率较低，导致通量相对较低，以及高分辨率成像可用的视野有限。未来的发展方向可能包括提高表达荧光标记货物的神经元数量的方法。

图1展示了用于培养海马神经元的微流控装置的概览（图1A，B）。神经元被接种于储液池1中。微通道的尺寸可阻止细胞体（胞体）扩散至轴突区，而通道的长度则可防止树突突起完全延伸至轴突区。培养约2-3天后，神经元开始通过微通道将轴突延伸至轴突区（图1B，C）。通过荧光显微镜可识别转染后表达黄色荧光蛋白标记的正常朊蛋白的轴突（YFP-PrPC）（图1C）。使用质粒转染表达荧光标记蛋白时，应验证其正确的亚细胞定位和功能，因为过表达可能因蛋白构象改变而引入实验假象。因此，共定位实验应同时辅以生化共沉淀研究以及内源性表达蛋白的免疫荧光染色（IF）。本研究中所用YFP-PrPC的行为此前已有验证16。在瞬时转染的神经母细胞瘤细胞（N2a）中，YFP-PrPC的表达水平较低，提示瞬时转染不会导致YFP-PrPC的高水平过表达16。此外，使用抗PrPC抗体对转染YFP-Pr...

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。

理解分子马达如何协调其活动以在神经元内运输囊泡 cargo 所需的定量分析

货物定位分析的总体目标是确定与囊泡运输载体结合并驱动其运动的分子马达蛋白的相对数量和类型，并将这些马达蛋白的组成与活体运输载体的运动方向性相关联。该目标的实现首先需要在微流控装置中培养原代小鼠海马神经元，使轴突相对笔直地生长，随后记录瞬时转染神经元轴突中荧光标记的货物蛋白的活体细胞内运动。第二步是在活体货物成像过程中固定神经元，然后使用针对分子马达蛋白（如驱动蛋白和动力蛋白）的抗体对轴突进行染色，继而通过免疫荧光显微成像进行观察。接下来，将固定的货物和马达蛋白图像与货物随时间运动的轨迹图（也称为krafts）进行对齐，以将活细胞中货物的运动与免疫荧光染色所确定的附着马达蛋白相关联。最后一步是使用一种名为motor colocalization的自主开发MATLAB软件包，确定货物和马达蛋白的亚像素位置。该软件可提供每个货物和马达蛋白位置的精确XY坐标，以及与货物和马达蛋白相关的荧光强度相对值。最终，在亚像素分辨率水平上对活体和固定后的货物分子及马达蛋白进行荧光显微成像的相关性分析，能够提供与特定货物相关联的马达蛋白类型信息，而这些货物的运动方向是已知的。因此，该方法可深入揭示外显子运输的机制。该技术还可应用于其他将活细胞显微成像与免疫荧光染色相结合的研究，例如在微管动态过程中蛋白质与微管的关联，或内吞过程中蛋白质的募集。该方法的可视化演示将有助于完成成像固定及分析步骤，这些步骤原本可能难以掌握，因为它们需要专门的设备。本实验所用的小鼠海马区原代神经元按照方案文本所述方法制备，并重悬于神经基础培养基（neurobasal medium）中，用于在微流控装置中接种神经元。从微流控储液池一和一_prime中移除培养基。向微流控储液池一中加入20 µL细胞，使其流过通道。将装置置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育20分钟。在显微镜下观察，以确保细胞已贴附于盖玻片上。加入神经基础培养基（neuro basal），补满所有储液槽。将含有细胞的装置于第九天前放回培养箱。在培养过程中，神经元通过微通道延伸轴突，并可用于转染以表达荧光蛋白。转染后的小鼠海马初级神经元的活细胞成像在倒置落射荧光显微镜上进行，该显微镜配备有37摄氏度培养箱和CO2控制腔室。开始此操作时，选择100倍油镜物镜。将油滴加到物镜上，并将载有在微流控装置中培养的海马体神经元的盖玻片安装到显微镜载物台上。为避免神经元死亡，操作应迅速进行，使样品在显微镜下的停留时间不超过一小时。寻找转染细胞中穿过微流控室通道延伸的轴突。记录转染轴突所在的通道编号。使用手动计数器对通道数量进行计数，以优化活体运动的记录及后续的共定位分析。选择在通道中相对平直生长的轴突，以便对大多数囊泡进行聚焦成像。为了便于后续将固定后的图像与chm移植物上的运动轨迹对齐，在成像过程中需将微通道的右边缘与视野对齐。为了在活体成像过程中成功固定细胞，建议由两人协作完成该操作：一人负责添加固定剂，另一人同时调节焦距。还必须确保所有试剂均已准备好并触手可及。使用一支1 mL的塑料移液管，从2号和2′号储液槽中移除大部分培养基，开始通过特定于被分析货物运输动力学的时间 lapse 参数对活体货物运动进行成像。在收集到足够的活体运动数据后，由一人将预热的固定剂加入第二个和第二个引物储液池中。避免触碰微流控装置，以免干扰活体成像的焦点。另一人则在添加固定剂的同时调整焦距。同样地，用固定剂填充储液池一和一撇，当观察到运动立即停止时，表明固定成功。随后，使用针对内源性运动蛋白的抗体对固定的神经元进行染色，并按照方案文本中所述进行成像。开始进行货物定位时，利用图像分析软件生成货物运动的轨迹图。建议使用 Rich Dorf Insights 开发的 Image J 插件，通过市售的图形软件手动将货物的免疫荧光图像与货物运动的 CHM 图对齐，将货物点状信号叠加到 CHM 图轨迹位置的固定点上，使每个货物点状信号对应 CHM 图上的特定轨迹。为获得最佳对齐效果，请使用针对所映射货物聚焦最清晰的 Z 层切片。每个 Z 层堆栈图像可使用多个 Z 层切片。使用已建立的算法确定每个荧光点的 XY 坐标和强度幅值，该算法通过将二维高斯函数拟合到代表三个通道中每个点光源的点扩散函数来实现。为了获得 XY 坐标，开发了一个名为 motor colocalization 的定制 MATLAB 软件包，该软件包整合了 Yakima DONA 及其同事开发的高斯拟合算法，用于拟合映射到移动或静止轨迹上的各个货物荧光点。在 Kog 图中，从 motor colocalization 程序的结果中选择 XY 坐标和强度幅值。使用多张Zack图像来定位存在于不同焦平面中的更多货物。将定位到的货物各自的XY坐标与相应Z切片中各马达通道获得的坐标进行比较。对于位于同一焦平面内且有信号的货物与马达，确定并选取与货物距离在300纳米半径范围内的XY马达坐标。使用运动蛋白共定位软件包确定位于 300 纳米半径范围内的荧光点。通过货物定位分析，关联携带正常朊蛋白（标记为黄色荧光蛋白或 Y-F-P-P-R-P-C）的囊泡在轴突中运输的情况与其相对含量的驱动蛋白和动力蛋白。该图显示了 F-P-P-R-P-C 囊泡的运动，其中虚线表示活体成像过程中固定样本的时间点。固定表达Y-F-P-P-R-P-C的囊泡的荧光图像以及驱动蛋白轻链1和2的相应免疫荧光图像已与色谱图对齐。此放大图显示了三个通道各自的免疫荧光信号及其二维高斯函数拟合结果。该图展示了在野生型神经元以及缺失驱动蛋白重链的神经元中，Y-F-P-P-R-P-C囊泡与驱动蛋白轻链1和2之间共定位的定量分析结果。通过高斯振幅获得与Y-F-P-P-R-P-C囊泡相关的驱动蛋白轻链1（Kinesin light chain one）和驱动蛋白轻链2（dine）的相对含量，并作图以仔细分析相对马达蛋白含量与运动方向性之间可能存在的相关性。该示例来自野生型神经元，表明正在运动或处于静止状态的Y-F-P-P-R-P-C囊泡均与驱动蛋白轻链1、驱动蛋白轻链2或两者同时结合。一旦掌握该技术，可在三天内完成实验。此外，在完成约10天的透射电镜成像前准备、微流控装置制备以及原代神经元培养后，您可在三天内完成活细胞成像、免疫荧光染色及数据分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何记录在微流控装置中培养的荧光标记货物分子和神经元的活体运动过程；掌握成像过程中如何固定C细胞，如何以亚像素分辨率分析共定位，以及如何将货物分子与分子马达蛋白的共定位情况与货物的运动行为相关联。

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

表征分子马达的组成对运动轴突货物用“货物映射”分析

由功能化微管在表面附着的驱动蛋白马达上滑行所构成的分子穿梭系统，可作为一种纳米级运输系统。本文描述了一种典型穿梭系统的组装方法。...

驱动蛋白动力分子穿梭车的货物装载

本文介绍了一种鉴定驱动蛋白-1（Kinesin-1）货物分子的实验方案。驱动蛋白-1重链（KIF5B）的一种无马达功能突变体会在细胞质中形成聚集体，并诱导其货物分子共同聚集。通过荧光显微镜可同时检测到这两类聚集体。该策略同样可用于鉴定其他马达蛋白的货物分子。...

利用荧光显微镜鉴定驱动蛋白-1的货物分子

本文介绍了一种体外活体成像方法，用于可视化小鼠星形胶质细胞中细胞器的细胞内运输以及质膜蛋白的转运过程。该方案还提供了一种图像分析方法，用于确定货物运输的路径和动力学特征。...

可视化与分析星形胶质细胞内细胞器及其他货物的胞内运输

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

在DNA折纸纳米结构上构建动力蛋白与驱动蛋白马达复合体用于单分子观测

线粒体运输和形态异常与多种神经退行性疾病相关。本方案利用诱导性多能干细胞分化的前脑神经元，评估遗传性痉挛性截瘫中的线粒体运输和形态。该方案可实现对轴突中线粒体运输的表征及其形态学分析，有助于推动神经退行性疾病的机制研究。...

分析遗传性痉挛性截瘫患者来源的人诱导多能干细胞衍生神经元中的线粒体运输与形态

我们描述了荧光光激活方法，用于分析来自表达光激活神经丝蛋白的转基因小鼠的外周神经有髓轴突中单根轴突内神经丝的轴突运输。...

离体小鼠胫神经中神经丝运输的成像与分析

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8...

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

利用转基因荧光小鼠，本文详细描述了在活体动物中评估完整坐骨神经内运动和感觉轴突中信号内体和线粒体的体内轴突运输的实验方案。...

拓展工具包 在体 内 轴突运输成像

本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性...

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

本文描述了优化荧光显微镜成像参数的方法，以在活体线虫中以单神经元分辨率观察内源性标记货物的轴突运输过程。...

在活体Caenorhabditis elegans中通过荧光显微镜优化内源性货物轴突运输的可视化

探索分子马达蛋白与轴突囊泡运输方向性的关联机制。本研究利用微流控装置培养小鼠海马神经元，结合活细胞成像与免疫荧光技术，通过自定义MATLAB软件实现亚像素级共定位分析，揭示驱动蛋白与动力蛋白在轴突运输中的动态组成规律。

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

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