利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

货物定位分析的总体目标是确定与囊泡运输载体结合并驱动其运动的分子马达蛋白的相对数量和类型，并将这些马达蛋白的组成与活体运输载体的运动方向性相关联。该目标的实现首先需要在微流控装置中培养原代小鼠海马神经元，使轴突相对笔直地生长，随后记录瞬时转染神经元轴突中荧光标记的货物蛋白的活体细胞内运动。第二步是在活体货物成像过程中固定神经元，然后使用针对分子马达蛋白（如驱动蛋白和动力蛋白）的抗体对轴突进行染色，继而通过免疫荧光显微成像进行观察。

接下来，将固定的货物和马达蛋白图像与货物随时间运动的轨迹图（也称为krafts）进行对齐，以将活细胞中货物的运动与免疫荧光染色所确定的附着马达蛋白相关联。最后一步是使用一种名为motor colocalization的自主开发MATLAB软件包，确定货物和马达蛋白的亚像素位置。该软件可提供每个货物和马达蛋白位置的精确XY坐标，以及与货物和马达蛋白相关的荧光强度相对值。

最终，在亚像素分辨率水平上对活体和固定后的货物分子及马达蛋白进行荧光显微成像的相关性分析，能够提供与特定货物相关联的马达蛋白类型信息，而这些货物的运动方向是已知的。因此，该方法可深入揭示外显子运输的机制。该技术还可应用于其他将活细胞显微成像与免疫荧光染色相结合的研究，例如在微管动态过程中蛋白质与微管的关联，或内吞过程中蛋白质的募集。

该方法的可视化演示将有助于完成成像固定及分析步骤，这些步骤原本可能难以掌握，因为它们需要专门的设备。本实验所用的小鼠海马区原代神经元按照方案文本所述方法制备，并重悬于神经基础培养基（neurobasal medium）中，用于在微流控装置中接种神经元。

从微流控储液池一和一_prime中移除培养基。向微流控储液池一中加入20 µL细胞，使其流过通道。将装置置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育20分钟。

在显微镜下观察，以确保细胞已贴附于盖玻片上。加入神经基础培养基（neuro basal），补满所有储液槽。将含有细胞的装置于第九天前放回培养箱。

在培养过程中，神经元通过微通道延伸轴突，并可用于转染以表达荧光蛋白。转染后的小鼠海马初级神经元的活细胞成像在倒置落射荧光显微镜上进行，该显微镜配备有37摄氏度培养箱和CO2控制腔室。开始此操作时，选择100倍油镜物镜。

将油滴加到物镜上，并将载有在微流控装置中培养的海马体神经元的盖玻片安装到显微镜载物台上。为避免神经元死亡，操作应迅速进行，使样品在显微镜下的停留时间不超过一小时。寻找转染细胞中穿过微流控室通道延伸的轴突。

记录转染轴突所在的通道编号。使用手动计数器对通道数量进行计数，以优化活体运动的记录及后续的共定位分析。选择在通道中相对平直生长的轴突，以便对大多数囊泡进行聚焦成像。

为了便于后续将固定后的图像与chm移植物上的运动轨迹对齐，在成像过程中需将微通道的右边缘与视野对齐。为了在活体成像过程中成功固定细胞，建议由两人协作完成该操作：一人负责添加固定剂，另一人同时调节焦距。

还必须确保所有试剂均已准备好并触手可及。使用一支1 mL的塑料移液管，从2号和2′号储液槽中移除大部分培养基，开始通过特定于被分析货物运输动力学的时间 lapse 参数对活体货物运动进行成像。

在收集到足够的活体运动数据后，由一人将预热的固定剂加入第二个和第二个引物储液池中。避免触碰微流控装置，以免干扰活体成像的焦点。另一人则在添加固定剂的同时调整焦距。

同样地，用固定剂填充储液池一和一撇，当观察到运动立即停止时，表明固定成功。随后，使用针对内源性运动蛋白的抗体对固定的神经元进行染色，并按照方案文本中所述进行成像。开始进行货物定位时，利用图像分析软件生成货物运动的轨迹图。

建议使用 Rich Dorf Insights 开发的 Image J 插件，通过市售的图形软件手动将货物的免疫荧光图像与货物运动的 CHM 图对齐，将货物点状信号叠加到 CHM 图轨迹位置的固定点上，使每个货物点状信号对应 CHM 图上的特定轨迹。为获得最佳对齐效果，请使用针对所映射货物聚焦最清晰的 Z 层切片。每个 Z 层堆栈图像可使用多个 Z 层切片。

使用已建立的算法确定每个荧光点的 XY 坐标和强度幅值，该算法通过将二维高斯函数拟合到代表三个通道中每个点光源的点扩散函数来实现。为了获得 XY 坐标，开发了一个名为 motor colocalization 的定制 MATLAB 软件包，该软件包整合了 Yakima DONA 及其同事开发的高斯拟合算法，用于拟合映射到移动或静止轨迹上的各个货物荧光点。在 Kog 图中，从 motor colocalization 程序的结果中选择 XY 坐标和强度幅值。

使用多张Zack图像来定位存在于不同焦平面中的更多货物。将定位到的货物各自的XY坐标与相应Z切片中各马达通道获得的坐标进行比较。对于位于同一焦平面内且有信号的货物与马达，确定并选取与货物距离在300纳米半径范围内的XY马达坐标。

使用运动蛋白共定位软件包确定位于 300 纳米半径范围内的荧光点。通过货物定位分析，关联携带正常朊蛋白（标记为黄色荧光蛋白或 Y-F-P-P-R-P-C）的囊泡在轴突中运输的情况与其相对含量的驱动蛋白和动力蛋白。该图显示了 F-P-P-R-P-C 囊泡的运动，其中虚线表示活体成像过程中固定样本的时间点。

固定表达Y-F-P-P-R-P-C的囊泡的荧光图像以及驱动蛋白轻链1和2的相应免疫荧光图像已与色谱图对齐。此放大图显示了三个通道各自的免疫荧光信号及其二维高斯函数拟合结果。该图展示了在野生型神经元以及缺失驱动蛋白重链的神经元中，Y-F-P-P-R-P-C囊泡与驱动蛋白轻链1和2之间共定位的定量分析结果。

通过高斯振幅获得与Y-F-P-P-R-P-C囊泡相关的驱动蛋白轻链1（Kinesin light chain one）和驱动蛋白轻链2（dine）的相对含量，并作图以仔细分析相对马达蛋白含量与运动方向性之间可能存在的相关性。该示例来自野生型神经元，表明正在运动或处于静止状态的Y-F-P-P-R-P-C囊泡均与驱动蛋白轻链1、驱动蛋白轻链2或两者同时结合。一旦掌握该技术，可在三天内完成实验。此外，在完成约10天的透射电镜成像前准备、微流控装置制备以及原代神经元培养后，您可在三天内完成活细胞成像、免疫荧光染色及数据分析。

观看本视频后，您应能够充分理解如何记录在微流控装置中培养的荧光标记货物分子和神经元的活体运动过程；掌握成像过程中如何固定C细胞，如何以亚像素分辨率分析共定位，以及如何将货物分子与分子马达蛋白的共定位情况与货物的运动行为相关联。