利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术及自定义数据库表征独特洞穴环境（美国亚利桑那州卡钦纳洞穴）中的土著细菌

本实验的总体目标是开发、应用并演示一种基于文库的细菌鉴定详细流程，该流程采用基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱技术。首先使用MALDI质谱仪获取细菌的质谱图以实现该目标。在本研究中，收集了15种从强碱性环境中分离出的细菌的质谱数据，所得峰形成为所分析细菌的特征性图谱或“指纹”。

随后将这些质谱数据导入软件并构建模型数据库。接着，利用聚类分析、峰匹配和统计分析对模型数据库中的参考质谱进行处理和分析。最后，从这15种细菌中随机选取盲编码细菌，再次采集其质谱数据，并与模型数据库中的参考谱图进行比对，以获得鉴定结果。结果表明，细菌可根据相似性系数或潜在生物标志物及峰类别被准确鉴定。

开始此操作时，将一微升不含活细胞的蛋白质提取物沉积到不锈钢MALDI靶板上，并使其干燥。然后在干燥的蛋白质提取物上覆盖一微升基质溶液，再使其干燥。待其干燥后，再将一微升CBR标准品沉积到靶板上，随后在CBR上覆盖一微升基质溶液，并使其干燥。

最后，在靶板上点加两微升基质溶液作为阴性对照。使用配备氮气激光器并由 Bruker flex control 软件操作的质谱仪。以正离子线性模式采集每张质谱图，每次累积 500 次激光发射，分 100 次递增完成。

将离子源一电压设为 20 千伏，离子源二电压设为 18.15 千伏，透镜电压设为 9.05 千伏。这些参数因仪器而异，可能需要优化。将质荷比范围设为 2 至 20 千道尔顿每电荷，用于自动光谱分析。

然后将最小分辨率阈值设为100。选择OID峰检测算法。将信噪比阈值设为2，最小强度阈值设为100。

最后，将峰值累积设为 500 以进行数据库设计。使用生物数值 7.1 中的新数据库向导创建一个新数据库。然后，在实验类型面板中使用相应命令创建一个质谱实验类型，例如 maldi。

接下来，使用数据库设计面板创建层级，在数据库菜单中导航，并通过此处的“层级”→“添加新层级”命令添加新的层级。创建物种层级、生物学重复层级和技术重复层级。以导入原始质谱数据。

首先，通过打开文件菜单并点击“导出质谱”命令，使用 flex analysis 将原始质谱数据导出为文本文件。然后将原始质谱数据以技术重复的层级导入数据库。通过导入并采用二次拟合算法进行重采样，对原始质谱数据进行预处理。

然后使用大小为50个点的滚动圆盘进行基线扣除，并利用连续小波变换（CWT）计算噪声。使用Kaiser窗对光谱进行平滑处理，窗大小为20个点，β值为10个点。然后使用大小为200个点的滚动圆盘进行第二次基线扣除。

最后，在对每个质谱图的峰列表（包含峰大小、峰强度和信噪比）等安全特征模式进行预处理后，使用连续小波变换（CWT）检测峰，设定最小信噪比为10。接下来，在分析菜单中使用汇总命令，从预处理后的质谱图生成复合质谱图，并选择生物学重复作为目标层级。此处。

将同一菌落的10次技术重复的质谱数据合并，为该菌落生成一个组合质谱，从而在生物学重复水平上为该分离株获得三个组合质谱。最后，将这三个组合质谱汇总，生成该分离株在物种水平上的一个组合质谱。为进行基于相似性的聚类分析和多维尺度分析，创建带有颜色的分组。

首先，选择三个生物复合质谱图，然后在“组”菜单中点击“根据所选内容创建新组”命令，为相应的分离株创建一个组。接着，为这三个质谱图自动设计一种颜色。通过进入聚类分析菜单并点击“计算聚类分析”命令，执行聚类分析。

在比较设置的第一页，选择皮尔逊相关性，并将其他参数保留为默认值。在第二页，选择非加权配对平均法（UPGMA）。然后单击完成。

在统计菜单中使用多维尺度分析命令生成多维尺度分析图，以进行峰匹配。在实验面板中点击谱图类型 maldi，然后选择布局。

显示图像，展示光谱的各个单独峰。然后在光谱菜单中使用“进行峰匹配”命令进行峰匹配，以识别峰类别，并通过点击统计矩阵.挖掘进行双向聚类。匹配到峰类别的峰强度以热图形式表示，利用基于相似性系数的方法鉴定细菌。创建比较并基于技术重复水平的质谱生成分析方案，该过程与聚类分析中所执行的操作相同，保存该方案用于相似性比较。

选择一个未知的质谱图并点击分析。识别选定的条目。识别对话框将出现。

选择基于比较的分类器类型，然后单击下一步。在下一页中，选择已保存的图谱作为参考比较，然后单击下一步。选择基本相似性作为鉴定方法，再次单击下一步，选择最大相似性作为评分方法。

输入每个参数相应的阈值和最小差异值，然后点击下一步。计算完成后，结果面板中将出现鉴定窗口，列出与未知样本最匹配的数据库成员。

基于聚类分析的程序展示了数据库中各分离株之间的相似性。该数据集包含15种不同物种的质谱数据，每种物种有三个复合质谱。双向聚类分析有助于研究人员识别特定物种或种内菌株的潜在生物标志物。

此处，峰强度以颜色表示，绿色代表低强度，红色代表高强度。最后，基于这些分析，可将未知物的质谱图与标准图谱进行比对，并通过相似性系数实现鉴定。