Name: 听觉神经的光遗传学刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解利用光遗传学技术刺激小鼠听觉神经的创新方法，通过蓝光微LED或光纤激光实现精准神经调控。该技术可记录听觉脑干反应和局部场电位，为人工耳蜗改进及听觉神经科学研究提供新途径。

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本工作由德国联邦教育与研究部（Bernstein神经技术重点研究项目资助号01GQ0810，授予T. Moser，以及MED-EL德国公司）；德国研究基金会通过纳米级显微成像与脑分子生理学中心（FZT 103，T. Moser）以及SFB889项目（授予N. Strenzke和T. Moser）提供支持。

本研究中所进行的所有实验均遵循德国实验动物保护法所规定的伦理标准。哥廷根大学动物福利委员会及下萨克森州动物福利办公室已批准本实验。
1. µLED刺激器的制备
<ol>
	<li>对于µLED，首先准备µLED刺激器。使用具有200 × 200 μm有源表面的蓝色LED（µLED，参见材料表）。</li>
	<li>将导线焊接到µLED上，然后使用环氧胶对µLED及其连接部分进行封装。将器件放置过夜，使环氧树脂充分固化。</li>
	<li>为确保机械稳定性并实现电绝缘，将导线穿过一根细玻璃毛细管（使用外径1 mm的硼硅酸盐毛细管），并在连接处用环氧树脂密封（图1D），以便将毛细管安装在机械操纵器上。 
	注意：封装层厚度需权衡——应足够厚以实现良好的电绝缘（避免刺激伪迹），但又不能过厚，以免影响LED在鼓室内的自由移动以及在耳蜗造口处的准确定位。建议制备多个LED备用。</li>
	<li>为验证良好的电绝缘性，先准备一个含有0.9% NaCl溶液的培养皿，并将3&#160;根裸露铜线末端浸入液体中。该设置用于模拟带有ABR电极的动物。将导线连接至ABR放大器，再接入示波器。</li>
	<li>然后将LED连接至刺激器，并将其完全浸入溶液中。以允许的最大电流驱动LED脉冲（参见步骤3.1.1），持续时间超过20分钟，观察是否存在刺激伪迹。若出现伪迹，则弃用该LED，并尝试更换新的LED。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>使用4至10周龄的转基因小鼠，其在Thy1.2启动子驱动下表达ChR2（Wang的第9品系）&#160;等13）。为了操控动物并执行&#160;手术过程中，务必使用清洁且标识明确的外科器械。</li>
	<li>通过腹腔注射乌拉坦（1.32 mg/kg）、赛拉嗪（5 mg/kg）和丁丙诺啡（0.1 µg/g）的混合物（溶于0.9%无菌NaCl溶液）对动物进行麻醉，并将小鼠置于加热板上以维持体温在37 °C。此剂量通常可使麻醉状态持续整个实验过程。
	<ol>
		<li>在初次麻醉诱导后10分钟开始，通过 paw withdrawal reflex 检查觉醒迹象。&#160;若出现动物移动，应给予乌拉坦（.66 mg/kg）和丁丙诺啡（0.05 µg/g）的维持剂量，用0.9%无菌NaCl溶液稀释（不含赛拉嗪）。&#160;再次检查足爪回缩反射，只有在反射消失时才继续操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仔细剃除毛发&#160;准备在耳后区域进行切口。采用耳后入路到达鼓室（含气的中耳腔）。
	<ol>
		<li>使用微型镊子仔细解剖和/或去除部分颈部肌肉， 例如， 胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌和斜角肌。</li>
		<li>找到并暴露鼓室泡（bulla）图1A）。将鼓泡识别为一种具有特征性球形结构的骨性组织，其表面有一环形结构，提示为鼓膜的附着处。图1A）。用胰岛素针尖在该环下方打一个小孔。从此处开始，使用精细咬骨钳或显微镊小心去除覆盖鼓室的骨质，暴露耳蜗的鼓岬（图1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行耳蜗开窗术时，轻柔地刮除骨性囊壁，以打开一个小窗口（耳蜗开窗：约500–800 μm），注意保留膜迷路完整图1B在耳蜗的第二转进行耳蜗造口术，因为该位置距离镫骨动脉和耳蜗顶足够远。打开耳蜗顶可能导致耳蜗破裂，包括蜗轴骨折。</li>
	<li>对于将光纤或µLED植入物经圆窗插入鼓阶的操作，需使用锋利手术刀的刀尖（11号刀片是合适的选择）轻柔刮除骨性圆窗龛组织，以适当扩大圆窗龛。务必使用新的刀片或手术刀。操作时需格外小心，因为镫骨动脉走行位置紧邻圆窗图1B).</li>
</ol>
3. 采用两种方法的光刺激
<ol>
	<li>进行耳蜗跨膜刺激时，使用 µLED 或光纤耦合激光器。
	<ol>
		<li>将携带 µLED 的毛细管固定在机械操纵器上，并小心地将 µLED 置于耳蜗开窗处。通过电流源（通常为 2.7 V 下 5–40 mA）以 1–5 Hz 频率施加 3–10 毫秒长的刺激，诱发 oABR，以此优化 µLED 的位置和方向。</li>
		<li>对于激光刺激，使用 473 nm 连续波激光器和 250 µm 光纤（见材料部分）。将光纤耦合至蓝色激光源，理想情况下该光源应能快速进行模拟功率调控（否则使用声光调制器或快速快门来定义光刺激）。使用微操纵器将光纤尖端准确定位于耳蜗开窗处，并用牙科水泥将其固定（耳蜗跨膜刺激）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于耳蜗内刺激，将光纤经圆窗插入鼓阶。然后使用 1–5 Hz 频率、持续 3–10 毫秒、输出功率为 10–30 mW 的激光脉冲诱发 oABR。由于 oABR 幅值较大，实验者可在示波器上观察单次刺激诱发的 oABR，从而以 oABR 幅值为读出指标，优化发射器（µLED 或光纤）的位置和方向。</li>
	<li>一旦获得良好的 oABR 信号，即用氰基丙烯酸酯胶水或牙科水泥固定光纤，并等待胶水完全固化。 
	注意：观察到少量液体从耳蜗流出是正常现象。但为避免水泥聚合过程中出现问题，建议使用细棉条吸干该区域。</li>
</ol>
4. oABR 记录
<ol>
	<li>将针状电极插入耳廓下方、头顶以及靠近后肢的背部位置，并将其连接至放大器。</li>
	<li>放大头顶与乳突部位皮下针电极之间的电位差。以50 kHz的采样率进行采样，并使用1-10,000 Hz滤波。将电位差信号显示在示波器上，理想情况下示波器应靠近记录装置，以便优化光刺激器的位置。采用信号平均法（50-1,000次叠加），并将数据存储于计算机中以供离线分析。</li>
</ol>
5. 光学诱发局部场电位的记录
<ol>
	<li>将动物放入立体定位仪中。用镊子从中央牵拉覆盖颅骨的皮肤，并用剪刀进行中线切口，切口大致从两眼之间延伸至颈部肌肉附着于颅骨的部位。
	<ol>
		<li>将皮肤向两侧翻开。沿矢状缝纵向切开骨膜，并用棉签轻轻擦拭暴露的颅骨表面，将骨膜移除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将定制的金属板放置在暴露的颅骨上，使金属板尾端与人字缝之间保留约1 mm的间隙。使用直径为0.7 mm的钻头，小心地在顶骨上钻孔。</li>
	<li>用镊子夹住直径为0.85 mm的螺丝，缓慢旋入——该螺丝将作为记录下丘（IC）电位的参考电极——在螺丝尚未牢固固定前始终用镊子夹持。确保螺丝与硬脑膜接触良好，但不得穿透脑组织。使用氰基丙烯酸盐胶水将螺丝和金属板粘附于颅骨上。</li>
	<li>轻柔地将颈部肌肉从颅骨上松解。将颈部肌肉向尾侧牵拉约1–2 mm。辨认上矢状窦（SSS）与横窦（TS）的交汇点。如有必要，可通过生理盐水湿润骨面以增加颅骨透明度。
	<ol>
		<li>在小鼠中，下丘（IC）位于SSS与TS交汇点正后方。确定IC位置后，在显微镜下缓慢而谨慎地进行颅骨开窗，开窗范围大致从前（喙侧）距TS约0.5 mm处延伸至后（尾侧）1.5 mm处，横向约3 mm。</li>
		<li>务必避免损伤SSS和TS，否则将导致实验失败。此处可轻压开窗区域的骨片以测试其是否已松动。用镊子缓慢抬起并移除骨片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用合适的适配器将多通道电极阵列和前置放大器连接至显微操作仪。为防止插入IC过程中损坏多通道记录电极，在靠近骨缘处用弯曲的微型皮下注射针头小心去除硬脑膜。
	<ol>
		<li>将动物从立体定位仪中取出，将金属板固定于支架上以维持立体定位状态。将记录探针置于IC上方，并在显微镜控制下插入，使最上方的记录通道刚好可见于表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>放大记录电极各通道与顶骨参考螺丝之间的差分电位，以32 kHz采样率采集信号，经低通滤波（300 Hz）后存储于计算机中，供离线分析使用。</li>
	<li>所有动物应在麻醉恢复前，根据相关安乐死指南实施人道安乐死。合适的安乐死方法包括颈椎脱位或CO2吸入。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

所述实验展示了对螺旋神经节神经元（SGNs）的光遗传学刺激，原则上也可用于刺激内毛细胞和/或外毛细胞，前提是这些细胞表达了视蛋白。这些实验需要极大的耐心和细致操作。如前所述，最关键的步骤是良好的耳蜗开窗/圆窗插入，以及光源适当的位置和方向。
使用ChR2进行光遗传学刺激时存在一定的局限性。在我们的实验中，oABR振幅随光强和脉冲持续时间的增加而增大，但随着刺激频率的升高而减小15。反应潜伏期也依赖于光强，当刺激强度增加时，潜伏期缩短。我们认为这些反应特性是由ChR2的动力学特性以及螺旋神经节神经元（SGNs）中表达的通道数量所决定的。此外，ChR2在高频率放电时可能导致额外的峰电位、反应失败以及膜电位的累积27,40。目前已有持续的研究致力于克服这些局限性32,33。我们近期报道了通过病毒介导在SGNs中表达ChR2变体CatCh14，该方法降低了对光强的需求，并支持更高频率刺激下的神经元放电39。最近，Boyden实验室报道了一种名为Chronos的通道视紫红质，其具有更...

根据世界卫生组织的数据，全球有 3.6 亿人患有听力损失。在耳聋患者中，人工耳蜗通过直接对螺旋神经节神经元（SGNs）进行电刺激&#160;使其中大多数能够实现开放性言语理解1,2,4,5尽管人工耳蜗已在全球超过20万人中植入，成为最成功的感觉神经假体，但目前人工耳蜗驱动的声音编码仍存在局限性。人工耳蜗通过一定数量的电极进行电刺激，每个电极激活听觉神经的特定拓扑区域，从而绕过耳蜗内功能受损的柯蒂氏器。正常听力者能够分辨超过2,000种频率，而目前的人工耳蜗仅使用12至22个频率通道。4这是由于每个刺激电极产生的电流广泛流动所致7,9，激活大量代表不同声音频率的螺旋神经节神经元8,15这一局限性可通过多极刺激加以改善，但会以更高的功耗为代价。16,17其对声音强度的输出动态范围也有限，通常低于6-20 dB4,18因此，提高频率和强度分辨率是提升人工耳蜗性能的重要目标，以改善在噪声环境中的言语识别、语调理解以及音乐感知能力。
刺激听觉神经的另一种方法是光刺激。光可以方便地聚焦，以靶向少量螺旋神经节神经元（SGN），有望实现更好的空间限制，提高频率分辨能力，并扩大动态范围，从而改善强度分辨能力。事实上，在动物模型中，使用红外光进行耳蜗刺激已显示出优异的频率分辨能力10,11,19。这种刺激方式的一个缺点是，其所需的能量高于电刺激10,11。此外，有研究对这种方法直接刺激听觉神经元的能力提出了质疑12,20。
作为红外刺激的替代方法，我们采用光遗传学技术使螺旋神经节神经元（SGNs）对光敏感。光遗传学是一种结合遗传学与光学技术的新型方法，可非侵入性、特异性地以高时间精度调控细胞（综述21-23）。目前最常用的手段是利用微生物视蛋白通道视紫红质2（ChR2）基因的表达 莱茵衣藻 及其编码光控阳离子通道的变体24ChR2 是一种7次跨膜螺旋蛋白，当其被导入神经元并被蓝光激活时，可作为非选择性阳离子通道，从而使细胞去极化24-27ChR2 已得到充分表征24,28-31 并已开发出多种变体以改变其作用光谱、门控特性和通透性特征32,33我们的研究旨在建立耳蜗光遗传学技术，以激活听觉通路。我们注意到，利用光遗传学方法刺激听神经需要对螺旋神经节进行基因改造，使其表达光敏通道蛋白。在小鼠和大鼠中开展研究可利用现有的转基因动物模型。13,34,35，可在不同动物及耳蜗拓扑轴向上实现通道视紫红质表达的高度一致性36. 结合条件等位基因37 通过使用适当的Cre品系可实现细胞特异性表达。向其他动物的螺旋神经节进行基因转移时，需采用腺相关病毒等病毒载体，这是光遗传学中的标准方法。38 且我们在小鼠中已证明其效果良好36基因操作及外源蛋白编码转基因的表达可能带来不良影响的风险，例如免疫反应和/或细胞增殖、基因操作细胞的状态受损甚至死亡。本实验演示中，我们使用在Thy-1启动子驱动下于螺旋神经节神经元中表达ChR2的转基因小鼠。13 通过光遗传学手段刺激听觉通路。我们注意到，其他通道视紫红质变体也可用于相同目的，正如我们此前通过病毒介导的CatCh变体转导所证实的那样。14 进入SGNs39.
尽管耳蜗光遗传学需要进行基因操作，但它可实现分子水平的调控，从而优化螺旋神经节神经元（SGN）的刺激，并且与电刺激相比，有望提高频率和强度分辨能力。听觉通路的光遗传学刺激对听力研究具有重要意义。例如，该技术有望推动发育过程中依赖神经活动的拓扑频率精细化机制的研究，有助于分析声音定位中频谱整合的必要性，以及中枢听觉系统中频率特异性传入投射之间相互作用的程度。

<table><tbody><tr><td>乌拉坦</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U2500-100G</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>RXV</td><td></td><td>镇静与镇痛</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>用于夹持硬组织，例如骨组织或材料。切勿用于夹持柔软 delicate 组织&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 细型镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>仅用于夹持软组织</td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锐利</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>切开皮肤并辅助肌肉解剖</td></tr><tr><td>Lempert 咬骨钳&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16004-16</td><td>它们对于轻松去除鼓泡中的骨骼非常有用</td></tr><tr><td>473 nm 激光器&amp;nbsp;</td><td>长春新产业</td><td>MLL-III473</td><td>100 mW 固态 473 nm 激光器</td></tr><tr><td>激光驱动器&amp;nbsp;</td><td>长春新产业</td><td>DPSSL MLL 100 mW</td><td>TTL 操作的激光驱动器</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;m 光纤</td><td>任何商业产品；例如 Thorlabs</td><td>M42L05</td><td></td></tr><tr><td>声光调制器</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>PCAOM 可见光</td><td>控制从激光器耦合到光纤中的光量</td></tr><tr><td>声光调制器控制器</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>160T1-8SAR-24-0.8</td><td>控制声光调制器</td></tr><tr><td>Solo2 激光功率 &amp;和能量计</td><td>Gentec-EO</td><td></td><td>用于测量LED和光纤耦合激光器的光强</td></tr><tr><td>蓝色 &amp;micro;LED</td><td>克里</td><td>C470UT200</td><td>需要构建多个 &amp;mu;LED 设备因容易损坏或隔离效果不佳</td></tr><tr><td>TDT 系统&amp;nbsp;</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RZ6-A-P1</td><td>可使用任意系统进行刺激生成&amp;nbsp; 展示与数据采集</td></tr><tr><td>单束16通道硅探针</td><td>Neuronexus</td><td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&amp;nbsp;</td><td>这些是易损设备，必须小心操作，使用后需进行清洁。</td></tr><tr><td>Omnidrill</td><td>世界精密仪器公司</td><td>503598</td><td>进行开颅手术以记录颅内信号并植入参考电极螺钉</td></tr><tr><td>微型钻头钢制磨头</td><td>任何商业性； &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td></td></tr><tr><td>自攻骨螺钉</td><td>任何商业性； &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>参照螺钉</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>任何商业性； &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Luigs+Neumann InVivo Unit Junior 4轴</td><td></td><td>记录探针的定位</td></tr></tbody></table>

光遗传学刺激听觉神经

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

人工耳蜗（CIs）通过直接电刺激螺旋神经节神经元（SGNs），使大多数植入耳聋患者能够实现开放集言语理解1-6然而，由于当前人工耳蜗植入体（CIs）中每个电极接触点产生的电流扩散范围较广，会沿耳蜗的音调拓扑轴激活大量螺旋神经节神经元（SGNs），导致声音编码在频率和强度分辨率方面表现较差。7-9光学刺激被认为是一种可替代电刺激的方法，有望实现对螺旋神经节神经元（SGNs）更精确的空间局限性激活，从而提高编码的频率分辨率。近年来，对螺旋神经节神经元的直接红外照射&#160;耳蜗已被用于诱发听觉神经的反应10然而，它所需的能量高于电刺激。10,11 其潜在机制仍不明确12本文描述了一种基于光遗传学的方法，利用表达通道视紫红质2（ChR2）的转基因小鼠，通过低强度蓝光刺激螺旋神经节神经元（SGNs）。13 或通过病毒介导表达ChR2变体CatCh14我们采用微发光二极管（µLEDs）和光纤耦合激光器，通过人工创建的小型开孔（耳蜗造口）或圆窗刺激表达ChR2的螺旋神经节神经元（SGNs）。通过头皮记录光诱发的诱发电位（光遗传听觉脑干反应：oABR），或通过听觉通路的微电极记录来检测反应，并与声学刺激和电刺激的结果进行比较。

最佳的耳蜗开窗至关重要，可提高实验成功的概率。这意味着开窗应规则、尺寸小，且未损伤耳蜗内部结构。例如，出血提示血管纹已受损。图1B展示了理想情况的一个良好示例。
利用表达ChR2的转基因小鼠，ChR2在耳蜗内的螺旋神经节神经元（SGNs）中表达（图1C）。通过µLED或激光进行蓝光照射可引出较大的光诱发听觉脑干反应（oABR），其在波形和振幅上均不同于声诱发听觉脑干反应（aABR）。oABR（图1F）的振幅大于aABR（图1E），但与电诱发听觉脑干反应（eABR，图1G）相当。 这可以解释为：与声音诱发的aABR相比，oABR和eABR反映了更多的SGNs被募集和/或SGNs的激活更为同步。
为了引发电听觉脑干反应（eABR），将一种用于啮齿类动物的电子耳蜗（MED-EL）插入圆窗。我们采用双相电流脉...

人工耳蜗（CIs）通过直接电刺激听觉神经来实现听力功能。然而，较差的频率和强度分辨能力限制了人工耳蜗使用者的听力质量。本文介绍了一种在小鼠中对听觉神经进行光遗传学刺激的方法，作为听觉研究及未来人工耳蜗开发的替代策略。

通过人工耳蜗（cochlear implants, CIs）对螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons, SGNs）进行直接电刺激，可使大多数植入者实现开放集言语理解。

本实验的总体目标是利用光遗传学改造的螺旋神经节细胞，对动物的听觉神经进行光学刺激。首先需要准备一个蓝色微型LED刺激器，或连接至蓝色激光器的光纤。接下来的步骤是通过耳后显微外科入路评估耳蜗结构。第三步是定位光学刺激器，以记录光诱发的脑干反应。最后一步是进入下丘，记录光诱发的活动。最终结果可通过听觉脑干反应和局部场电位的记录，显示对听觉系统的有效刺激。在下丘脑中对听觉神经进行光遗传学刺激。作为一种替代电刺激的方法，耳蜗植入技术有望实现更优的频率和强度分辨能力。这一技术在听觉研究领域备受关注，同时也有望为耳聋患者的听力恢复提供更有效的解决方案。该方法有助于回答听觉研究中的关键问题，例如模式活动在听觉通路发育精细化过程中的作用、细胞定位中光谱整合的需求，以及频率特异性投射之间相互作用的程度。在中枢听觉系统中，实验操作的可视化演示至关重要，因为微米级LED或光纤的准确定位与方向较难掌握。微米级LED刺激器采用一个蓝色LED，其有源表面面积为200平方微米，首先需将导线焊接到微米级LED上。接下来，使用环氧树脂封装 LED 及其连接处，并静置过夜使其完全干燥。固化后，将导线穿过外径为一毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管。玻璃提供机械稳定性和电绝缘性。用更多环氧树脂密封毛细管与环氧涂层LED之间的连接处，并将毛细管定位，以便其可安装至操纵器上。现在检查电路连接。首先，准备三根铜丝。将每根铜丝的一端浸入0.9%氯化钠溶液中。然后将其另一端连接至ABR放大器。使用示波器监测信号。接着，将微型LED连接至自制的刺激器进行测试。将连接刺激器的微型LED浸入浴液中，并为LED供电至少20分钟。在刺激LED时，用示波器监测显示器上的伪迹。丢弃任何有故障的LED。麻醉一只4至10周龄的小鼠。该小鼠在股部1.2启动子下表达通道视紫红质2，时间为10分钟。注射麻醉剂后，检查动物的缩足反射以确认达到手术麻醉水平。随后将眼膏涂抹于眼睛，并开始手术。首先，仔细剃除耳后区域的毛发，以便接近鼓室（充满空气的中耳腔）。使用显微镊子将小鼠侧卧置于加热垫上进行手术操作。仔细分离颈部肌肉，即颈浅肌、胸锁乳突肌和斜角肌。现在暴露鼓室。它是一个球形的骨性结构，表面有一个环状结构，鼓膜即位于此处。使用胰岛素针头，从孔洞处沿环状结构下方刺一个小孔。去除覆盖耳泡的骨质。使用精细的咬骨钳和显微镊，在此过程中暴露耳蜗的前庭入口。接着，开始进行耳蜗造口术。首先去除骨性囊而不破坏膜迷路。现在于第二圈耳蜗处远离镫骨动脉及顶点开口的位置，打开一个500至800微米的小窗。顶点可能引起耳蜗破裂并损伤基底膜。准备测量光遗传学听觉脑干反应（OABR）。首先，将针状电极插入耳廓下方、头顶以及靠近后肢背部的位置，并将电极连接至放大器。放大头顶与乳突区皮下针电极之间的电位差。以 50 千赫兹采样，并将跨耳蜗刺激的响应信号在 1 至 10,000 赫兹范围内进行滤波。安装一个微 LED 或光纤，该微 LED 由机械操纵器夹持并耦合连接。小心地将其定位至指定位置。在示波器上观察差分电位。将示波器放置在记录装置附近，以便于优化光刺激器的位置。使用信号平均技术，并将数据存储在计算机中以供离线分析。现在通过施加持续时间为3到10毫秒、频率为1到5赫兹的电流脉冲，观察响应结果，以优化微发光二极管的位置和方向。另一种选择是使用连接至250微米光纤的473纳米连续波激光器进行激光刺激。该方法需要对激光功率进行快速模拟控制，或使用全光学装置。使用快速快门位置，通过显微操作器将光纤直接插入耳蜗开孔，并用牙科水泥固定，以进行耳蜗内刺激。将光纤经圆窗插入耳蜗的鼓阶（Scala.Tempe.）。通过施加1至5赫兹、持续3至10毫秒、功率为10至30毫瓦的脉冲刺激，诱发反应以优化光纤的位置和方向。刺激器的定位是该方案中最关键的步骤。应耐心地反复调整微电极或光纤的位置，直至出现明显的耳蜗前庭神经脑干反应（OABR）。一旦获得良好的光遗传学听觉脑干反应，即用氰基丙烯酸酯胶水或牙科水泥固定光纤。对于本方案，使用立体定位仪，并通过打开小鼠颅骨暴露下丘。在显微镜下，将记录探针定位至下丘上方，插入探针直至最上方的记录通道刚好可见于表面。随后，放大记录电极阵列各通道与参考螺钉及顶骨之间的差分电位。采用 32 千赫兹的采样率，300 赫兹的低通滤波器，并保存数据。一个理想的耳蜗开窗至关重要，可提高实验成功的概率。这意味着开窗应规则且较小，且不损伤耳蜗内部结构。例如，出血表明使用通道视紫红质2（Channel Rodin two）转基因小鼠时，耳蜗中的螺旋神经元受到了损伤。通道视紫红质2在耳蜗螺旋神经元中表达，通过微型LED或激光照射蓝光可引发较大的光遗传性ABR，其在振幅和波形上不同于声诱发ABR。光遗传性ABR的振幅大于声诱发ABR。因此，光遗传学耳蜗植入（BR）与电学耳蜗植入（BR）具有更高的可比性。两者均可能募集更多的螺旋神经节神经元，或引发螺旋神经节神经元更同步的激活。通过在中枢听觉系统中进行细胞外记录，验证了神经活动在听觉通路中的传导。例如，对耳蜗的光遗传学刺激可在听觉中脑引发神经活动。微LED刺激器的机械稳定性、安全的电隔离以及避免过量的碳流，均为成功应用耳蜗光遗传学的关键因素。在进行该操作时，重要的是要注意避免损伤埃博拉区域的耳蜗动脉。一旦掌握熟练，若操作得当，可在约三小时内完成下丘的记录。通过此操作，可进行下丘单细胞记录等方法。对听觉通路进行光遗传学刺激将为听觉神经科学研究开辟新的途径，使研究人员能够提出以往无法通过声学或电刺激手段解决的科学问题。我们还希望该技术能够转化为临床应用，用于听力障碍的康复治疗。

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科研

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Neuroscience

神经科学

听觉神经的光遗传学刺激

本文描述了一种在大鼠听觉假体研究中应用的经典恐惧条件反射行为范式。该范式通过心率作为评估指标，提供了一种识别动物对不同声学和电刺激进行检测及分辨的方法。...

利用经典条件反射与心率法测定听觉声学与电刺激信号对辨别行为的研究

来源：Kozin, E. D., 等．用于听觉通路光遗传学刺激的小鼠背侧耳蜗核直接可视化．J. Vis. Exp.

利用病毒介导的基因转移技术向小鼠背侧耳蜗核导入基因以实现光诱导听觉刺激

本视频演示了一种在小鼠脑片切片中刺激听觉神经根并记录内侧耳蜗橄榄核神经元突触后电流的实验方案。...

小鼠脑楔形切片中听神经根刺激与突触后电流记录

来源：Badran, B. W., 等. 经皮耳部迷走神经刺激（taVNS）的实验室操作：技术、靶向与注意事项。J. Vis. Exp.

人类耳部经皮迷走神经刺激

来源：Akil, O., et al., 通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法。J. Vis. Exp.

基于病毒载体的基因疗法在小鼠模型中恢复听力的研究

本实验方案的目的是概述一种手术方法，以在小鼠模型中直接进入背侧耳蜗核。...

直接可视化小鼠背侧耳蜗核以实现听觉通路的光遗传学刺激

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法...

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

我们介绍一种通过经鼓膜途径将药物局部递送至耳蜗的技术。通过该途径给药不会干扰顺铂等化疗药物的抗癌疗效。...

经鼓室药物递送治疗耳毒性

耳蜗植入物的动物模型有助于增进对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的认识。本研究介绍了一种在小鼠中进行急性致聋和耳蜗植入电极阵列的手术方案，以及通过听觉脑干反应进行功能评估的方法。...

C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

整合神经元对多种突触输入的响应，最佳方法是采用一种能够保留所有突触前核团、以维持自然时序和环路可塑性的实验体系；然而，脑片通常会切断大量连接。我们开发了一种改良的脑片制备方法，可在保持体外实验可行性的同时，模拟体内环路的活动状态。...

体外楔形脑片制备以模拟体内神经元环路连接

对于高频听力损失患者，使用更长电极的电声刺激（EAS）可提供更广泛的耳蜗覆盖范围及多种类型的编码图谱。结合微创手术、柔韧的侧壁电极以及类固醇给药，可实现更深度的电极插入，同时几乎不造成手术创伤，从而良好地保留残余听力。...

通过更长电极的电声刺激实现高频听力损失患者的耳蜗覆盖增强与听力保留

了解利用光遗传学技术刺激小鼠听觉神经的创新方法，通过蓝光微LED或光纤激光实现精准神经调控。该技术可记录听觉脑干反应和局部场电位，为人工耳蜗改进及听觉神经科学研究提供新途径。

光遗传学刺激听觉神经

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