土壤采样及昆虫病原线虫（Steinernematidae, Heterorhabditidae）的分离

本实验的目的是演示常用于土壤采样及肠杆菌致病性线虫分离的方法与技术。首先采用样线法或如本实验所示的随机采样法收集土壤样品，随后利用昆虫作为宿主，从土壤样品中选择性地回收肠杆菌致病性线虫。

最后一步是使用改良的白色陷阱从感染的昆虫中收集线虫。最终，这些技术代表了在实验室中成功建立肠道致病性线虫培养的关键步骤，并为后续的生物测定奠定了基础。土壤取样技术的优点在于，我们可以前往野外并采集致病性线虫的成熟阶段。

我们更倾向于采用随机取样策略，而非针对感染此类线虫的昆虫进行取样，因为这类昆虫很少遇到。我们所采用的随机取样策略常用于评估大范围地理区域中寄生性线虫的多样性。该技术最早由 Betting 在 1975 年的 Accur 中提出。

该方法是一种选择性操作，其原理在于自由生活的阶段会趋向于昆虫宿主并寄生于其上。实验操作将由本实验室的研究生 Rue Orozco 和研究技术员 Ming Mingle 演示。采样地点应至少有两平方米的面积，条件允许时应大于四平方米。

对于每个土壤样品，在DM a C样品区域内至少采集三个较小的子样品。如果符合研究目标，可将这些子样品合并。采集土壤样品的深度为0至15厘米。

每个样品应为250克至1千克。使用土壤CORAs铲子、手铲或类似工具，在每个选定的采样区域内至少从五个随机位置进行采集。每个样品应双层封装，并使用防水标记笔进行标识。

标签应包含采集地点、位置、海拔、日期以及环境变量信息，例如生境描述、相关植被和现场温度。记录当地的昆虫及其他无脊椎动物物种。对于无法立即鉴定的物种，应采集后带回实验室进行后续鉴定。在不同采集点之间，需彻底用水清洗采集工具，然后使用70%乙醇或0.5%次氯酸钠进行消毒。

将土壤样品置于8至15摄氏度的冷藏箱中运输。从每份样品中分出一部分用于分析土壤的宏观特性，如其组成、质地、导电性等。从每份土壤样品中去除可能引起外源微生物污染的杂质。

然后用水润湿土壤，使其中的线虫能够自由移动。取200至250克湿润的土壤放入带盖的塑料容器中。然后加入昆虫诱饵。

五到十只昆虫即可。盖上盖子，将容器倒置并置于黑暗环境中。每隔两到三天在室温下取出死亡的昆虫，并根据需要补充健康的昆虫以继续称重。

如果昆虫尸体呈棕色或赭色，表明为斯氏线虫和异小杆线虫寄生；而若尸体呈砖红色至深紫色，则提示为异小杆线虫。使用改良的白色陷阱收集已寄生昆虫诱饵的线虫。

首先，将一个50或60毫米培养皿的皿盖放入100毫米培养皿的底部。然后在较小的培养皿中放入一张圆形沃特曼一号滤纸。

用无菌水冲洗昆虫尸体，然后将其转移至滤纸上。摊开放置，确保彼此不接触。仅在较大的培养皿中加入约 20 毫升蒸馏水，并用较大的培养皿盖盖住整个装置。

用线虫名称、昆虫诱捕日期和日期标记培养皿。陷阱已设置完毕。将陷阱置于室温下，并监测是否有感染性幼虫（IJs）从昆虫尸体中逸出。

此过程可能需要10至25天，具体时间取决于诱捕器所处环境的温度和湿度。如果诱捕器中的水位已蒸发，请务必在含有感染性幼虫（IJs）的培养皿中重新加水。从较大的培养皿中收集含有线虫的水。

让线虫沉降几分钟，然后缓慢倒去上清液。待线虫保留在少量水中后，通过重新加入水并小心倾倒的方式再冲洗数次。随后进行连续稀释，以估算线虫种群数量。

在250毫升的培养瓶中，将线虫浓度调整至每毫升1到3000条线虫。将此悬浮液保存在10至20摄氏度之间。通常在自然界中，发现被肠杆菌科线虫寄生的昆虫的概率非常低。

因此，采用G型黑色素瘤幼虫作为诱饵的上述方案被用于更高效地分离此类线虫。五天后，昆虫被感染并呈现红色。改良的白色陷阱显示出线虫的活动痕迹。

从这些诱捕器经过15天后，收集在水中的线虫外观干净，且无昆虫组织残留。使用锥实螺幼虫进行一次提取循环，可能不足以回收土壤样本中全部的Oma致病性线虫。因此，我们建议多次重复此操作。

此外，我们建议用户考虑使用其他昆虫而非蜡螟（Galleria），这也将提高回收率。利用昆虫与土壤样品共培养是一种可用于分离其他昆虫病原体（如细菌或真菌）的技术。