Name: 土壤采样及昆虫病原线虫的分离（Steinernematidae，异小） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学习从土壤样本中分离昆虫病原线虫的标准方法，包括随机采样、昆虫诱饵法和改良怀特陷阱技术。这些方法为实验室建立线虫培养物及后续生物测定奠定基础。

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作者感谢Stock实验室的前成员Sam-Kyu Kim、Kathryn Plichta和Victoria Miranda-Thompson为改进这些实验方案所做出的贡献。我们感谢美国国家科学基金会对S. P. Stock的资助（项目编号IOS-0840932和IOS-0724978）。

1. 土壤样品采集
<ol>
	<li>每个采样点的采样面积应至少覆盖 2 - 4 m2。</li>
	<li>采集深度至少为 15 cm 的土壤样品（图 4）。</li>
	<li>在该区域内至少随机采集 5 个样品。</li>
	<li>每个样品采集 3 个子样品。根据研究目的，可将子样品混合或分别保存。</li>
	<li>将每个样品放入塑料袋中。建议使用双层袋以防止样品泄漏（图 4）。</li>
	<li>使用防水记号笔标记样品。每个采样点应标注以下信息：采样地点信息（包括地理位置/区域/地点名称及 GPS 坐标）、日期、生境、相关植被、温度、海拔等。 
	注意：如适用，应收集和/或记录随样品一同采集到的昆虫或其他无脊椎动物，并进行后续鉴定，它们可能是潜在的 EPN 天然宿主。</li>
	<li>在样品之间清洁采样工具，需用清水彻底冲洗和/或使用 70% 乙醇或 0.5% 次氯酸钠溶液进行消毒。</li>
	<li>运输过程中将样品保存在冷藏箱中（8 - 15 °C）。</li>
	<li>取部分土壤样品用于分析，以获取土壤组成、质地、湿度、电导率或其他所需土壤参数的信息。</li>
</ol>
2. 从土壤样品中分离线虫：昆虫诱集法
<ol>
	<li>去除任何碎屑（即岩石、木块或树皮、树叶 等等.) 在采集样本时需采取措施，避免与腐生微生物发生污染。</li>
	<li>加水湿润土壤，以促进线虫的移动。 
	注意：使用喷雾瓶缓慢增加土壤的湿度。</li>
	<li>将约200至250毫升湿润土壤放入带盖的洁净塑料容器中。</li>
	<li>添加昆虫诱饵。在每个样品的土壤表面放置5至10只昆虫（图5).</li>
	<li>用盖子盖好容器，并将容器倒置。</li>
	<li>将容器避光保存于室温（通常为 22 - 25 °C）。</li>
	<li>每2至3天检查一次容器，并移除死亡的昆虫。 
	注意：向每个容器中添加更多健康的昆虫，以进一步诱集土壤样品中的生物。</li>
	<li>从容器中移除死亡的昆虫。注意：呈棕色或赭色的虫尸通常被斯氏线虫属（steinernematids）寄生，而呈砖红色至深紫色的虫尸通常被异小杆线虫属（heterorhabditids）寄生。</li>
	<li>用无菌水冲洗尸体。</li>
	<li>将尸体放入改良的White陷阱中以回收线虫子代（见下文操作步骤）。</li>
</ol>
3. 从感染尸体中回收线虫：改良的怀特陷阱法
<ol>
	<li>将一个直径为50（或60）mm的培养皿上部放入一个较大的培养皿（100 mm）中。</li>
	<li>在较小的培养皿内放入一张圆形滤纸（Whatman #1）。</li>
	<li>将昆虫尸体放置在较小培养皿的滤纸上，确保尸体彼此不接触，以避免交叉污染。</li>
	<li>在外部较大的培养皿中加入约20 ml无菌蒸馏水。切勿向放置尸体的较小培养皿中加水。</li>
	<li>用盖子盖住大培养皿及其内容物（图6）。</li>
	<li>对培养皿进行相应标记，标注以下信息：线虫名称（种/分离株）、感染日期（建立感染的日期）和设 trap 日期（即设置诱捕装置的日期）。</li>
	<li>将诱捕装置置于室温下，直至感染期幼虫（IJs）出现。该过程所需时间因线虫种类或菌株不同，通常为10至25天。</li>
	<li>通过移去诱捕装置中外层的大培养皿，将含有感染期幼虫的水倒入烧杯中以收集线虫。</li>
	<li>静置烧杯，使线虫自然沉降到烧杯底部。此过程可能需要几分钟。</li>
	<li>小心倾倒上清液，确保线虫保留在烧杯底部。</li>
	<li>通过加入更多水并让线虫再次沉降，对线虫进行清洗。此步骤可重复2–3次，直至上清液清澈。</li>
	<li>将线虫悬浮液转移至组织培养瓶（250 ml）中，悬浮液浓度控制在每毫升1,000–3,000条线虫。</li>
	<li>将含有线虫悬浮液的培养瓶置于冷室或培养箱中，温度保持在10–20 °C。 
	注意：需定期检查储存的培养瓶，因为昆虫病原线虫的保存寿命存在差异。通常，斯氏线虫可在无需继代培养的情况下保存6–12个月，而异小杆线虫可能需要更频繁的检查。</li>
</ol>

<ol><li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.+In+The+Prokaryotes%22">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).</li>
<li>Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematode+s+in+Biological+Control%22">Entomopathogenic Nematode s in Biological Control</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).</li>
<li>Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+entomopathogenic+nematodes+%28Rhabditida%3A+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biodiversit.%2C+%26+Conservation%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey.</a> Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Techniques+in+insect+nematology.+In+Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology</a>. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLacey%2C+LA+%22Manual+of+techniques+in+invertebrate+pathology%22">Manual of techniques in invertebrate pathology</a>. , Academic Press. London. (2012).</li>
<li>McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+other+natural+enemies+as+mortality+factors+for+larvae+of+Diaprepes+abbreviatus+%28Coleoptera%3A+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae).</a> Biological Control. 19, 182-190 (2000).</li>
<li>Meyling, N. V., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+ecosystem.%2C+%26+environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoinar%2C+GO+%22Taxonomy+and+biology+of+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae.+In%3A+Entomopathogenic+Nemtaodes+in+Biological%22">Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological</a>. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).</li>
<li>Stock, S. P., Gress, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+phylogenetic+relationships+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29+from+the+Sky+Islands+of+southern+Arizona%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona.</a> Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Nematodes+as+biological+control+agents.+CAB+International+Publishing%22">Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing</a>. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Stuart, R. J., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patchiness+in+populations+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本演示是介绍研究侵染性线虫（EPN）及其共生细菌常用技术的两个展示中的第一个。这些技术代表了在实验室中成功建立EPN培养的关键步骤，同时也构成了以EPN作为模式生物进行研究的其他生物测定方法的基础。
多种针对昆虫病原线虫（EPN）的土壤调查表明，其丰度和分布随季节、生境和地理区域的不同而变化4, 5,9,15。土壤质地、含水量、温度以及寄主的可获得性等因素可能在其分布中起关键作用。因此，开展调查前获取初步数据至关重要。样品采集后，应尽快进行处理。若无法立即处理，应将其储存在冷藏室或其他具备温度控制的适当设备中。根据样品来源地的不同，昆虫诱捕容器的储存温度也应有所差异。通常，温带地区的样品采用较低温度（例如，15 °C）储存，而热带地区的样品则考虑使用较高温度（例如，30 °C）储存。
昆虫诱集法是从土壤样品中回收昆虫病原线虫（EPN）最常用的方法。该方法是一种便捷的策略，可在实验室中实现EPN的回收。大蜡螟的末龄幼虫被用于此过程。 Galleria mellon...

许多线虫与昆虫相关，它们与宿主的相互作用从有益到有害不等。本文重点关注一类以昆虫为宿主的病原性线虫，也称为昆虫病原线虫（或EPN）。这类线虫包括两个科：斯氏线虫科（Steinernematidae）和异小杆线虫科（Heterorhabditidae）11,13。其致病性实际上源于它们与兼性厌氧肠道细菌的共生关系（斯氏线虫与Xenorhabdus细菌共生，异小杆线虫与Photorhabdus细菌共生）2。这些细菌由唯一自由生活的线虫阶段——第三阶段感染性幼虫（又称dauer幼虫、感染性幼虫或IJ）携带，并在土壤中将细菌从一个昆虫宿主传播至另一个宿主。一旦进入昆虫体内，线虫便将细菌释放到昆虫的血淋巴中，引发严重的败血症，从而杀死昆虫宿主。细菌同时降解昆虫的组织，成为线虫的食物来源，使其得以成熟并大量繁殖。通常，昆虫尸体内部会完成一代或两代成虫的发育。最后一世代的子代线虫会以比此前营养关系更为特异的方式重新与少量细菌细胞结合，并在从昆虫尸体移出至土壤的过程中，将这些细菌保留在其肠道内加以培育，以等待下一个可寄生的昆虫宿主6,11,14 （图1）。
自1927年被发现以来，EPN一直被视为化学杀虫剂的重要替代品，因其能够寄生多种农业害虫昆虫3,4,5。然而，在过去二十年中，这些线虫及其共生细菌已被认为是研究宿主-微生物相互作用的生物学、生态学和进化特征的一种可塑性模型系统14。
本演示的目的是展示土壤采样及昆虫病原线虫（EPN）分离最常用的方法与技术。可用于采集土壤样品的工具多种多样，包括：土壤取样器、刮铲、挖坑器、螺旋钻、采样管、手铲等（图2）。
根据研究目的，可采用两种取样策略：a）分层取样，b）随机取样（图3）。分层取样通常用于在特定或划定区域内进行的高强度研究，时间跨度固定。一般做法是划定一条样线，并在该样线上按预定间隔、在一段时间内采集土壤样品（图3A）15。当研究范围较广时，通常采用随机取样策略。该取样方法已被用于研究大范围地理区域中昆虫病原线虫（EPN）的多样性（图3B）12。根据研究重点的不同，可考虑多种影响因素，包括不同海拔、土壤质地和生境类型（例如：农田、森林、牧场、公园、海岸、河岸地带等）。
我们展示了昆虫诱集技术，该方法最初由Bedding和Akhurst1描述，是一种从土壤样品中回收昆虫病原线虫（EPN）的简单且具有选择性的替代方法。该方法基于一个前提，即线虫的感染期幼虫（IJ阶段）会被昆虫宿主吸引并寄生其体内。该技术也可用于分离其他昆虫病原体，如真菌和细菌8,10。
我们还展示了改良的White陷阱法，该方法用于从被感染的昆虫宿主中回收线虫后代7,14。这是一种简便的方法，能够有效回收“洁净”的线虫后代，避免昆虫尸体降解产生的碎片污染。
最后，本文所描述和展示的技术对应于我们实验室构思和/或实施的方法，以及由多位同事和合作者所描述的技术。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt;</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>用于昆虫诱捕技术</td></tr><tr><td>滤纸，55 mm，1号纤维素</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>感染室和White诱捕器组装</td></tr><tr><td>60 × 15 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>感染室和White诱捕器组装</td></tr><tr><td>100 × 15 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>感染室和White诱捕器组装</td></tr><tr><td>ZIPloc塑料袋</td><td>Ace Hardware或当地五金店</td><td></td><td>土壤取样</td></tr><tr><td>机械移液器 P1000、P200 μl</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&amp;nbsp;</td><td>感染室和White诱捕器组装</td></tr><tr><td>移液器吸头 1000 μl、200 μl</td><td>VWR</td><td>16466-004 ; 53510</td><td>感染室和White诱捕器组装</td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Ace Hardware或当地五金店</td><td></td><td>土壤取样，消毒</td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Ace Hardware或当地五金店</td><td></td><td>土壤取样，消毒</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>AAPER</td><td>17212945</td><td>土壤取样，消毒</td></tr><tr><td>铲子</td><td>Ace Hardware或当地五金店</td><td>N/A</td><td>土壤取样</td></tr><tr><td>管状土壤取样器</td><td>Accuproducts</td><td></td><td>土壤取样</td></tr><tr><td>土壤探针，长柄</td><td>Nupla&amp;nbsp;</td><td>PRB4T 69401 Classic</td><td>土壤取样</td></tr><tr><td>卷尺</td><td>Ace Hardware或当地五金店</td><td></td><td>土壤取样</td></tr><tr><td>标志带，多种颜色</td><td>Ace Hardware或当地五金店</td><td></td><td>土壤取样</td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>VWR</td><td>Falcon, 29185-304&amp;nbsp;</td><td>White诱捕器，EPN收集</td></tr><tr><td>洗瓶，聚乙烯材质，广口</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>White诱捕器，EPN收集</td></tr></tbody></table>

土壤采样及昆虫病原线虫（steinernematidae, heterorhabditidae）的分离

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

昆虫病原线虫（又称EPN）是一类栖息于土壤中的线虫，可寄生多种昆虫。这些线虫属于两个科：斯氏线虫科（Steinernematidae）和异小杆线虫科（Heterorhabditidae）。迄今为止，斯氏线虫科已描述超过70个物种，异小杆线虫科约有20个物种。这类线虫与肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌形成互利共生关系，二者共同构成一种高效的杀虫复合体，能够杀死多种昆虫物种。
本文重点介绍从土壤中采集昆虫病原线虫（EPN）时最常用的几种技术。本演示文稿的第二部分着重介绍昆虫诱集法，这是一种广泛用于从土壤样品中分离EPN的方法，以及改良的White诱集法，用于从感染的昆虫中回收这些线虫。这些方法和技术是成功在实验室建立EPN培养体系的关键步骤，同时也为将这些线虫作为模式生物用于其他生物学领域研究的各类生物测定实验奠定了基础。本演示文稿中展示的技术对应于S. P. Stock实验室成员所执行和/或设计的方法，以及由不同作者所描述的技术。

土壤样品采集
昆虫病原线虫的第三阶段感染性幼虫是其生活史中唯一的自由生活阶段，存在于土壤中（图1）。因此，采集土壤样品是回收这些线虫的一种非常有效的方法。图4展示了一个土壤剖面，指示了应采样的深度。保持样品湿度是线虫存活的关键因素。因此，在运输至实验室的过程中，必须将土壤样品保存在塑料袋中，并维持低温条件（图4）。
线虫回收
在自然界中，昆虫被昆虫病原线虫（EPN）自然寄生的概率通常低于3%，除非处于流行暴发期，才可能发现较多被EPN侵染的昆虫样本。因此，利用昆虫诱捕土壤样本是提高从自然环境中回收EPN的有效方法。图5展示了土壤诱捕技术。本实验中使用了一个250 ml带螺口盖的塑料容器，将约250 g土壤放入容器中，并在土壤表面放置5至10只G. mellonella幼虫（图5右侧）。5...

昆虫病原线虫是一类栖息于土壤中的线形蠕虫，可寄生多种昆虫。本文展示了利用两种技术从土壤中分离这些线虫的采样方法：昆虫诱捕法用于从土壤样品中回收线虫，改良White诱捕器法则用于从受感染的昆虫尸体中回收线虫。

土壤采样及昆虫病原线虫（Steinernematidae, Heterorhabditidae）的分离

昆虫病原线虫（又称EPN）是一类栖息于土壤中的线虫，可寄生多种昆虫。这些线虫属于……

本实验的目的是演示常用于土壤采样及肠杆菌致病性线虫分离的方法与技术。首先采用样线法或如本实验所示的随机采样法收集土壤样品，随后利用昆虫作为宿主，从土壤样品中选择性地回收肠杆菌致病性线虫。最后一步是使用改良的白色陷阱从感染的昆虫中收集线虫。最终，这些技术代表了在实验室中成功建立肠道致病性线虫培养的关键步骤，并为后续的生物测定奠定了基础。土壤取样技术的优点在于，我们可以前往野外并采集致病性线虫的成熟阶段。我们更倾向于采用随机取样策略，而非针对感染此类线虫的昆虫进行取样，因为这类昆虫很少遇到。我们所采用的随机取样策略常用于评估大范围地理区域中寄生性线虫的多样性。该技术最早由 Betting 在 1975 年的 Accur 中提出。该方法是一种选择性操作，其原理在于自由生活的阶段会趋向于昆虫宿主并寄生于其上。实验操作将由本实验室的研究生 Rue Orozco 和研究技术员 Ming Mingle 演示。采样地点应至少有两平方米的面积，条件允许时应大于四平方米。对于每个土壤样品，在DM a C样品区域内至少采集三个较小的子样品。如果符合研究目标，可将这些子样品合并。采集土壤样品的深度为0至15厘米。每个样品应为250克至1千克。使用土壤CORAs铲子、手铲或类似工具，在每个选定的采样区域内至少从五个随机位置进行采集。每个样品应双层封装，并使用防水标记笔进行标识。标签应包含采集地点、位置、海拔、日期以及环境变量信息，例如生境描述、相关植被和现场温度。记录当地的昆虫及其他无脊椎动物物种。对于无法立即鉴定的物种，应采集后带回实验室进行后续鉴定。在不同采集点之间，需彻底用水清洗采集工具，然后使用70%乙醇或0.5%次氯酸钠进行消毒。将土壤样品置于8至15摄氏度的冷藏箱中运输。从每份样品中分出一部分用于分析土壤的宏观特性，如其组成、质地、导电性等。从每份土壤样品中去除可能引起外源微生物污染的杂质。然后用水润湿土壤，使其中的线虫能够自由移动。取200至250克湿润的土壤放入带盖的塑料容器中。然后加入昆虫诱饵。五到十只昆虫即可。盖上盖子，将容器倒置并置于黑暗环境中。每隔两到三天在室温下取出死亡的昆虫，并根据需要补充健康的昆虫以继续称重。如果昆虫尸体呈棕色或赭色，表明为斯氏线虫和异小杆线虫寄生；而若尸体呈砖红色至深紫色，则提示为异小杆线虫。使用改良的白色陷阱收集已寄生昆虫诱饵的线虫。首先，将一个50或60毫米培养皿的皿盖放入100毫米培养皿的底部。然后在较小的培养皿中放入一张圆形沃特曼一号滤纸。用无菌水冲洗昆虫尸体，然后将其转移至滤纸上。摊开放置，确保彼此不接触。仅在较大的培养皿中加入约 20 毫升蒸馏水，并用较大的培养皿盖盖住整个装置。用线虫名称、昆虫诱捕日期和日期标记培养皿。陷阱已设置完毕。将陷阱置于室温下，并监测是否有感染性幼虫（IJs）从昆虫尸体中逸出。此过程可能需要10至25天，具体时间取决于诱捕器所处环境的温度和湿度。如果诱捕器中的水位已蒸发，请务必在含有感染性幼虫（IJs）的培养皿中重新加水。从较大的培养皿中收集含有线虫的水。让线虫沉降几分钟，然后缓慢倒去上清液。待线虫保留在少量水中后，通过重新加入水并小心倾倒的方式再冲洗数次。随后进行连续稀释，以估算线虫种群数量。在250毫升的培养瓶中，将线虫浓度调整至每毫升1到3000条线虫。将此悬浮液保存在10至20摄氏度之间。通常在自然界中，发现被肠杆菌科线虫寄生的昆虫的概率非常低。因此，采用G型黑色素瘤幼虫作为诱饵的上述方案被用于更高效地分离此类线虫。五天后，昆虫被感染并呈现红色。改良的白色陷阱显示出线虫的活动痕迹。从这些诱捕器经过15天后，收集在水中的线虫外观干净，且无昆虫组织残留。使用锥实螺幼虫进行一次提取循环，可能不足以回收土壤样本中全部的Oma致病性线虫。因此，我们建议多次重复此操作。此外，我们建议用户考虑使用其他昆虫而非蜡螟（Galleria），这也将提高回收率。利用昆虫与土壤样品共培养是一种可用于分离其他昆虫病原体（如细菌或真菌）的技术。

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Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

土壤采样及昆虫病原线虫的分离（Steine​​rnematidae，异小）

本演示的目的是展示 体内 和 体外 昆虫病原线虫的饲养技术 在体 方法考虑了利用昆虫宿主饲养这些线虫，而 体外...

体内与体外培养昆虫病原线虫（Steinernematidae和Heterorhabditidae）

本文介绍了一种基于 黄粉虫（Tenebrio...

从土壤样品中分离与筛选昆虫病原真菌及其对害虫的致病力评估

本方案概述了一种从野外自然基质中高效提取活体线虫的方法。...

快速分离野生线虫的贝尔曼漏斗法

从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC...

土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

本方案可用于对自交型Caenorhabditis线虫进行大规模生态学调查。该方法的主要优势在于能够高效地整理和分析从自然界采集的线虫所关联的生态学与分子数据。...

一种可高度扩展的自交型 Caenorhabditis 线虫生态调查方法

昆虫病原线虫与细菌共生，二者共同作用，通过破坏昆虫的先天免疫系统成功感染宿主。为了促进对线虫感染遗传基础的研究，本文描述了昆虫病原线虫的保种及遗传操作方法。...

培养与遗传操作昆虫病原线虫

Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式物种之一，然而几乎所有研究都是在缺乏其天然共生微生物的情况下进行的。本文所述方法将有助于增进我们对这些共生微生物多样性的理解，为未来开展功能性的 C. elegans...

模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

我们向农民介绍两种大规模繁殖昆虫病原线虫作为生物杀虫剂的方法。第一种方法采用聚丙烯酰胺凝胶作为线虫培养基质，第二种方法则使用聚合物包被的脱脂棉作为培养基质。两种方法均依赖于 体内...

基于种植者的 在体 内 昆虫病原线虫的繁殖

本方法介绍了如何构建和操作一个连续的13C和15N同位素标记室，用于植物组织的均一或差异标记。文中讨论了对柳枝稷（Andropogon...

用于植物同位素均匀或差异性代谢与结构标记的连续13C和15N标记室的设计与操作

原位溶质渗漏法和孔隙水采样可使研究人员评估施用于土壤及已建立植被的化学物质的归趋。本实验方案的目的是演示如何在整合的原位溶质渗漏法与孔隙水采样实验中安装所需仪器并采集用于化学分析的样品。...

综合田间溶出法与孔隙水采样法评估土壤及定植植被中化学物质的迁移性

学习从土壤样本中分离昆虫病原线虫的标准方法，包括随机采样、昆虫诱饵法和改良怀特陷阱技术。这些方法为实验室建立线虫培养物及后续生物测定奠定基础。

土壤采样及昆虫病原线虫（Steinernematidae, Heterorhabditidae）的分离

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