大规模的斑马鱼胚胎的心脏解剖的转录分析
2015年1月12日
到斑马鱼心脏发育过程中分析的心脏基因表达分布，总RNA已被提取从离体心脏。在这里，我们提出了一个协议，用于收集功能/跳动的心迅速人工清扫，从斑马鱼胚胎获得心脏特异性mRNA。
该程序的总体目标是通过快速手动解剖活斑马鱼胚胎来收集心脏，以获得心脏特异性的 Mr.NA.这是通过首先移液完成的，许多麻醉的胚胎通过狭窄的移液器吸头上下移动，以同时从胚胎体中释放心脏。接下来，通过两个快速过滤步骤将解剖的心脏与胚胎碎片分离。然后，从剩余的碎片中手动分拣荧光标记的心脏。
最后，从收集的心脏中提取心脏特异性 RNA。最终，心脏解剖方案用于收集足够量的胚胎心脏以进行转录组分析。这种方法将有助于提出蠹虫心脏发育领域的关键问题，例如在不同发育阶段的心脏内表达了哪些转录本，还可以比较野生和突变的心脏表达为了获得用于心脏提取的斑马鱼胚胎，在立体显微镜下杂交表达荧光蛋白的成年转基因鱼，例如转基因英里七 EGFP。
监测胚胎的发育。验证心脏确实有荧光标记，并在胚胎达到所需阶段时手动对胚胎进行涂层。将大约 100 个胚胎转移到 1.5 毫升离心管中，并在 E 三种培养基中每毫升加入 16 毫克 trica 以麻醉它们。
将管子放在冰上。取出 trica 溶液，使用一毫升冰冷的 L 15 10%FBS 培养基清洗胚胎，将它们放在冰上。去除此洗涤液后，加入 1 毫升 L 15 FBS，并使用圆形凝胶加载头上下移液胚胎 5 到 8 次，以完全破坏蛋黄，将胚胎逐滴移到溶液表面，这样液滴就会爆裂，胚胎就会被轻轻破坏。
对于在立体显微镜下解剖的第一批胚胎，评估它们的完整性和解剖心脏的比例，并相应地调整移液方式。对于后续批次，将 100 微米过滤器放在 50 毫升离心管上，然后涂抹胚胎样品。然后用 1 毫升 L 15 FBS 冲洗离心管，并将溶液涂抹在过滤器上，以冲洗掉残留在过滤器中的心形。
使用 L 15 FBS 洗涤两次。接下来，将 30 微米过滤器放在 15 毫升离心管上，并施加包含心脏的流过。使用 L 15 FBS 冲洗该过滤器，该过滤器可保留心脏并洗掉较小的碎屑。
然后将 30 微米过滤器倒置在涂有 agris 的培养皿上，并应用 3 次 1 毫升的 L 15 FBS 培养基洗涤，以将心脏从过滤器中冲洗出来在荧光显微镜下，使用一对镊子手动将 GFP 阳性心脏与非荧光组织分离，将它们集中在培养皿的中心。心脏的生理机能看起来正常，因为它们在解剖后仍在跳动。程序。为了从心脏中分离 mRNA，将它们收集在尽可能小体积的培养基中，并将它们移液到含有 0.75 毫升 RNA 的冰上的 1.5 毫升试管中。
后来在荧光显微镜下。查看移液器吸头，确认没有心形粘在移液器吸头上。稍后将几轮分离的心脏拉入 RNA 管中后，根据文本方案，将样品在 15、700 Gs 和 4 摄氏度下离心 20 分钟。
接下来，在荧光显微镜下，小心地收集尽可能多的物质，并转移到含有 3 毫升 L 15 10%FBS 培养基的 1% agris 涂层培养皿中。接下来，在化学罩下，向含有沉淀心脏的试管中加入 0.5 毫升三醇并保持冰在荧光显微镜下，将残留在上清液中的心脏转移到含有 L 15 10%FBS 的新鲜 1%agros 涂层培养皿中，以稀释 RNA，这是非常粘稠的。然后收集小体积的心脏，并将它们转移到三醇沉淀的心脏管中以破坏心脏，涡旋管并在室温下孵育 5 分钟。
然后在化学罩下，彻底加入 100 微升氯仿混合物，将溶液转移到 1.5 毫升 PrepU、PLG 管中 在室温下孵育 3 分钟，将样品在 15、700 Gs 和 4 摄氏度下离心 15 分钟，然后将水相转移到新的 1.5 mL 管中。然后加入 5 至 10 微克糖原和 250 微升预冷的异丙醇。充分混合，第二天在零下 20 摄氏度下孵育过夜。
将样品在 15、700 Gs 和 4 摄氏度下离心 30 分钟，然后丢弃 snat。加入 1 毫升 75% 乙醇清洗调色板离心机并丢弃 snat。让剩余的乙醇在室温下从沉淀中蒸发，直到沉淀变成白色。
向沉淀中加入 20 μL 不含 RNA 的双蒸水，并在 55 度下孵育 10 至 15 分钟以溶解 RNA。然后将试管放在冰上。使用分光光度计确定 RNA 浓度和纯度，并在 1%agros 凝胶上运行样品，以评估心脏样品的 RNAA 完整性，在受精后 56 小时与受精后 36 小时从胚胎碎片中分选之前，此处显示了。
受精后 56 小时的胚胎比受精后 36 小时产生的胚胎碎片多，过滤后确定 56 HPF 心脏样本的纯度，通过 R-T-Q-P-C-R 比较心脏转录物与额外心脏转录物的表达水平。该凝胶显示从分离的心脏和没有心脏的破碎胚胎中提取的 RNA。吸光度测量显示，300 个心脏产生约 660 ng RNA。
即 33 纳克/微升，最终体积为 20 微升。通过 R-T-Q-P-C-R 实验计算此处所示标记物的相对基因表达水平。正如预期的那样，与没有心脏样本的胚胎相比，第 7 英里在心脏样本中高度富集，如图所示。
内皮细胞标志物 KDRL 在心脏中适度富集。红细胞标志物血红蛋白 β 胚胎 1.1 在心脏样本中代表性过高，即使解剖后心脏仍在跳动，这应该会从心脏中排出红细胞。相比之下，心脏样本中晶状体标志物 α A 晶体和 CNS 标志物 GFAP 的水平显著降低。
这些结果表明，心脏解剖方案从整个斑马鱼胚胎中产生高质量的心脏特异性 RNA。对于本实验，重要的是要监测样品以避免在解剖过程中失去心脏。
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概述
本文介绍了一种通过快速手动解剖从活体斑马鱼胚胎中收集功能性心脏的协议。该方法允许提取心脏特异性mRNA，便于分析心脏发育过程中的基因表达谱。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏发育
- 斑马鱼模型
- 基因表达分析
背景
- 斑马鱼是研究脊椎动物心脏发育的宝贵模型。
- 了解心脏基因表达对于发育生物学的洞见至关重要。
- 转基因斑马鱼可用于可视化特定心脏组织。
- 从分离的心脏中提取RNA对于转录组分析至关重要。
研究目的
- 开发一种从斑马鱼胚胎中分离跳动心脏的可靠方法。
- 使提取心脏特异性RNA以供进一步分析成为可能。
- 调查各个发育阶段的基因表达。
使用的方法
- 为解剖麻醉斑马鱼胚胎。
- 通过移液提取胚胎以释放心脏。
- 过滤步骤以将心脏与碎片分开。
- 手动分类荧光标记的心脏。
主要结果
- 成功从胚胎中收集功能性心脏。
- 提取足量的心脏特异性RNA。
- 促进转录组分析以研究基因表达。
- 洞察野生型和突变型心脏之间基因表达的差异。
结论
- 开发的协议对心脏RNA提取有效。
- 该方法可以推进心脏发育和遗传学研究。
- 未来的研究可以利用这种方法探索斑马鱼的心脏功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating cardiac-specific transcriptomes from zebrafish embryos enables precise interrogation of developmental gene expression, reducing noise from non-cardiac tissues. This approach supports target validation in cardiovascular discovery by providing high-purity RNA for mechanistic studies. The method accelerates preclinical de-risking by linking genetic perturbations to functional heart phenotypes in a scalable vertebrate model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac-specific transcriptional profiles to validate therapeutic targets in heart development pathways.
- Operational Value: Provides a rapid dissection workflow to collect sufficient hearts for reproducible RNA extraction and downstream qPCR analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative cardiac RNA readouts that enable comparison of wild-type and mutant gene expression profiles.
- Operational Value: Uses fluorescent labeling and filtration to standardize heart isolation, reducing variability in sample preparation for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports phenotypic screening of cardiac mutants by isolating beating hearts for transcriptome analysis, facilitating genotype-to-phenotype mapping.
- Operational Value: Yields high-integrity RNA suitable for RT-qPCR, enabling detection of stage-specific expression changes in developmental time courses.
Pipeline & Workflow Integration
The protocol fits within early discovery workflows where cardiac-specific molecular readouts are needed to de-risk targets before lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating hearts to measure cardiac-enriched transcripts like myl7 and kdrl, clarifying pathway activity.
- Screening: Enables standardized preparation of transgenic hearts for quantitative analysis, improving reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Produces RNA suitable for RT-qPCR, delivering quantitative dependent variable measurements that allow comparison of gene expression under different genetic or experimental conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to cardiac transcriptome outcomes, supporting preclinical validation of disease-relevant mechanisms in zebrafish.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and RNA extraction pipeline for cardiac studies, reducing redevelopment costs across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by minimizing transcriptome contamination and enriching cardiac-specific signals.
- Operational Value: Standardizes heart collection through filtration and fluorescent sorting, improving scalability and reproducibility.
- Strategic Value: Reduces biological noise in target validation, leading to more reliable go/no-go decisions in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on cardiac-specific expression evidence from a physiologically relevant model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, fluorescent microscopy, and manual dissection under stereo visualization.
- Dependent on access to transgenic zebrafish lines expressing cardiac fluorescent markers and standard dissection tools (filtration units, forceps, coated dishes).
- Necessitates standardized RNA extraction reagents and equipment (TRIzol, chloroform, isopropanol, centrifuge, spectrophotometer) for consistent downstream processing.
- Adaptation to non-fluorescent or non-cardiac tissues would require alternative isolation strategies, as the method relies on heart-specific labeling and differential adhesion.
- Practical limitations include the need for rapid processing to maintain sample homogeneity due to fast zebrafish heart development and potential RNA degradation during manual steps.
