利用肽阵列鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点

本实验的总体目标是绘制两种蛋白质或蛋白质结构域之间的相互作用图谱。在此案例中，研究的是与癌症相关的蛋白质结构域Still和CHFR。本实验的总体目标是绘制两种蛋白质或蛋白质结构域之间的相互作用图谱。

在此研究中，仍以癌症相关蛋白结构域 still 和 CHFR 为研究对象。第二步是将 CHFR 肽段微阵列与其结合伴侣 still 蛋白共同孵育。随后，将微阵列进行洗涤，并与辣根过氧化物酶标记的抗体孵育。

然后通过化学发光检测来检测结合情况。最后一步是分析结果，确定蛋白质之间的结合位点。该研究为设计针对CHFR结合的合理抑制剂铺平了道路，而CHFR不受控的相互作用可能导致癌症的发生。

该方法有助于回答蛋白质相互作用研究中的关键问题，例如介导两个蛋白质之间相互作用的具体区域是什么。将目标蛋白质的序列分割为10至20个氨基酸残基的肽段，这些肽段部分重叠。重叠程度可以调整，但原则上，重叠越长效果越好。

设计肽段时，应考虑蛋白质中已知的可介导相互作用的二级结构元件。设计好的肽阵列可通过商业供应商订购。本实验中，来自CHFR结构域第424至662位氨基酸的肽段通过其C端共价结合到阵列上。

收到设计好的阵列后，首先进行封闭处理以防止非特异性结合，为实验做准备。配制含有0.05% Tween 20的Tris缓冲液（即TBST），并加入脱脂奶粉，制成2.5%（重量/体积）的封闭溶液，用于阻断非特异性结合位点。

将芯片浸入5 mL封闭液中，在摇床中室温孵育2至4小时，或在4°C下孵育过夜。先用5 mL封闭液洗涤芯片30秒。

然后在室温下，于摇床上用五毫升 TBST 溶液洗涤芯片两次，每次五分钟。接着，将洗涤后的芯片与五毫升含 2.5%（质量/体积）脱脂奶粉的聚组氨酸标签蛋白溶液共同孵育，以防止非特异性结合。

此处使用浓度为 4.5 µM、残基范围为 500 至 650 的静蛋白溶液。然后将芯片在蛋白溶液中于室温孵育 3 至 8 小时，或于 4 °C 过夜孵育。蛋白溶液孵育结束后。

在室温下，将芯片置于摇床上，用 5 毫升 TBST 洗涤 30 秒，随后再进行两次每次 5 分钟的洗涤。接着将洗涤后的芯片与 5 毫升稀释的辣根过氧化物酶标记抗体在孵育缓冲液中孵育 1 小时，该孵育缓冲液所含成分及其浓度与封闭液相同，置于摇床上室温孵育。该抗体可结合目标蛋白或标签。通过在另一张未预先与蛋白孵育的芯片上重复相同实验步骤，检测抗体与芯片上多肽的相互作用，以进行对照实验。孵育结束后，用 5 毫升 TBST 按前述方法再次洗涤芯片。

使用增强型化学发光 Western 印迹底物试剂盒进行化学发光显影。采用如富士胶片 LAS 3000 成像系统等化学发光图像分析仪进行检测。分析结果时，需确保阵列上的两个重复样本显示出相同的信号，以保证结果的可靠性。

如果已知蛋白质互作伙伴的结构，可在其结构中搜索结合肽段并寻找结合位点。需要注意的是，在序列上相距较远的肽段可能在三级结构中彼此靠近，从而形成一个结合位点。在我们的示例中，still 是一种极为重要的中心体蛋白，可调控正常的细胞分裂和细胞增殖，其通过内在无序区域与多种蛋白质相互作用。

利用设计的肽阵列，揭示了肿瘤抑制因子CHFR中仍存在的结合位点。阵列中的每个黑点代表与仍结合的A-C-H-F-R衍生肽，需注意每个肽均出现两次，因其为重复设置，从而验证了结果的可靠性。肽阵列筛选发现七个来源于CHFR的肽段，它们与仍存在的内在无序区域（第500至650位残基）结合。

这些结果使我们能够确定 Still 在 CHFR 上的结合位点。尽管这七个肽段在 CHFR 的一级序列上相距较远，但它们在 CHFR 的三级结构中形成了一个明确的 Still 结合位点。

该方法适用于表征每一种蛋白质-蛋白质相互作用。在完成此操作步骤后，应采用荧光定量法、同位素标记法或等温滴定量热法（ITC）等定量方法，以验证并量化肽段的引入效果。