Name: 从复杂的动物相关样品测序宏基因组和Metatranscriptomes：净化不纯 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 了解宏基因组和宏转录组测序技术，用于分析囊性纤维化患者痰液样本中的病毒与微生物群落。该方法通过标准化流程实现复杂宿主相关样品的深度解析。

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本研究由美国国立卫生研究院（1 R01 GM095384-01）资助，授予 Forest Rohwer。我们感谢Illumina公司旗下的Epicentre公司提供了Ribo-Zero流行病学试剂盒的早期使用机会。我们感谢Mark Hatay设计并制作了超速离心管支架。我们感谢Andreas Haas和Benjamin Knowles对稿件提出的批判性审阅和讨论，以及Lauren Paul在拍摄过程中提供的协助。

注意：诱导痰样本由加州大学圣地亚哥分校（UCSD）成人囊性纤维化诊所的研究协调员根据加州大学机构审查委员会（HRPP 081500）和圣地亚哥州立大学机构审查委员会（SDSU IRB#2121）的规定采集。
1. 样本采集与预处理（采集后30分钟内进行样本预处理）
<ol>
	<li>在采集样本前，标记四个15 ml离心管，分别标注为：(i) 病毒宏基因组，(ii) 微生物宏基因组，(iii) 宏转录组，以及 (iv) 额外痰液。每个样本均需重复此步骤。向标记为“宏转录组”的管中加入2 ml 0.1 mm二氧化硅珠，随后加入6 ml基于硫氰酸胍的RNA裂解缓冲液（GITC-裂解缓冲液）。</li>
	<li>在样本采集过程中，使用无菌生理盐水（60 ml）进行漱口，以最大限度减少口腔微生物的污染。通过雾化器吸入4 ml 7%高渗盐水后，在30分钟内收集痰液样本。样本需立即处理，具体步骤如下所述。</li>
	<li>将样本稀释至总体积8 ml。
	<ol>
		<li>通过在采集样本前后称量空痰杯的重量，估算样本体积。</li>
		<li>若样本体积小于8 ml，加入适量经0.02 μm滤膜过滤的1×PBS，使样本总体积至少达到8 ml。</li>
		<li>立即使用3 ml注射器充分混匀样本，直至痰液中无可见团块。</li>
		<li>使用同一注射器吸取2 ml痰液，并立即进入步骤1.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>痰液样本中总RNA的保存
	<ol>
		<li>将步骤1.3.4中获得的2 ml痰液样本注入含有二氧化硅珠和GITC-裂解缓冲液的“宏转录组”管中。</li>
		<li>盖紧管盖，并用Parafilm密封，防止泄漏。</li>
		<li>立即以中等速度涡旋震荡10分钟以充分均质化痰液。根据所用涡旋仪的情况，必要时将离心管水平放置并用胶带固定。</li>
		<li>将离心管置于4 °C或冰盒中，必要时运送至实验室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用同一注射器，分别将2 ml痰液分装至标记为“病毒宏基因组”和“微生物宏基因组”的离心管中，并将痰杯中剩余的痰液转移至标记为“额外痰液”的离心管中。</li>
	<li>将所有离心管置于4 °C或冰盒中，必要时运送至实验室。</li>
</ol>
2. 病毒宏基因组的生成
<ol>
	<li>缓冲液和溶液的制备
	<ol>
		<li>提前配制 50 mM 二硫苏糖醇（DTT），4 °C 保存。该溶液可稳定保存 2 周。</li>
		<li>配制盐水镁（SM）缓冲液（250 ml）：1 M NaCl、10 mM MgSO4、50 mM Tris-HCl；调节 pH 至 7.4。经 0.02 µm 滤膜过滤除菌，室温保存。</li>
		<li>根据牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）冻干粉的活性（以 Dornase 单位/mg 干重定义），用分子级水将其配制成 100 U/µl 的酶液。</li>
		<li>配制 10x DNase I 缓冲液（50 ml）：100 mM MgCl2、20 mM CaCl2；调节 pH 至 6.5。经 0.02 µm 滤膜过滤除菌，室温保存。</li>
		<li>配制 4% 多聚甲醛溶液。</li>
		<li>配制 200x TE 缓冲液：2 M Tris-HCl（pH 8.5）、0.2 M EDTA。经 0.02 µm 滤膜过滤除菌，室温保存。</li>
		<li>用分子级水配制 10 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。</li>
		<li>用分子级水配制 50 ml CTAB/NaCl 溶液（10% CTAB，700 mM NaCl）。CTAB 需溶解过夜。若仍有沉淀，可在 65 °C 加热溶液。该溶液在室温下黏度较高。 
		注：使用 0.02 μm 滤膜过滤缓冲液可去除溶液中的病毒样颗粒，但无法去除游离核酸污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品预处理
	<ol>
		<li>配制适量新鲜的 6.5 mM 二硫苏糖醇（DTT）。</li>
		<li>加入经 0.02 µm 滤膜过滤的 SM 缓冲液，将匀浆液稀释至总体积为 6 ml。</li>
		<li>为促进黏液溶解，向样品中加入等体积（6 ml）的 6.5 mM 二硫苏糖醇（DTT），剧烈涡旋混匀，37 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>剧烈涡旋处理后的样品，于 10 °C、3,056 x g 离心 15–20 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的 15 ml 离心管中。</li>
		<li>对下一个样品重复步骤 2.2.3 和 2.2.5。</li>
		<li>使用装在注射器上的 0.45 µm 滤膜将上清液转移并过滤至新的 15 ml 管中。 
		注：若滤膜堵塞，可从注射器中回收样品，并跳过过滤步骤。</li>
		<li>取 100 µl 经 0.45 µm 滤膜过滤的样品，进行氯仿和 DNase I 处理（见步骤 2.3.12–2.3.15），并加入等体积的 4% 多聚甲醛以固定样品，用于落射荧光显微镜观察（图 2A）。</li>
		<li>若采用“全捕获”病毒颗粒富集方法（见讨论部分），则跳至步骤 2.3.12，省略基于氯化铯梯度超速离心的病毒颗粒筛选步骤。但此方法可能导致氯仿抗性细菌污染，以及病毒裂解液中宿主 DNA 含量较高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒样颗粒（VLPs）的富集与纯化
	<ol>
		<li>通过将适量氯化铯（CsCl）溶解于未过滤的 SM 缓冲液中，分别配制所需密度的 CsCl 溶液（1.7 g/ml、1.5 g/ml、1.35 g/ml 和 1.2 g/ml）。使用前经 0.02 µm 滤膜过滤各溶液。</li>
		<li>按 图 2B 所示设置 CsCl 梯度。</li>
		<li>向每根离心管中依次加入 1 ml 1.7 g/ml 溶液、1 ml 1.5 g/ml 溶液、1 ml 1.35 g/ml 溶液、1.2 g/ml 溶液（可选），最后加入 6–8 ml 样品。标记各层以标识每部分的位置。</li>
		<li>将每对相对的离心管配平至相差不超过 1 mg。</li>
		<li>小心将每根离心管放入转子吊桶中。即使吊桶为空，也需全部装入。将吊桶安装到转子上。</li>
		<li>于 4 °C、82,844 x g 条件下离心 2 小时。</li>
		<li>离心结束后，小心从转子架中取出离心管，避免破坏密度梯度。</li>
		<li>使用带 18 G 针头的 3 ml 注射器，在 1.5 g/ml 密度层下方刺穿离心管（图 2，红色箭头），抽取约 1.5 ml 液体至注射器中。</li>
		<li>缓慢拔出针头，让管中剩余液体通过穿刺孔滴入新的 15 ml 管中，收集上层组分。标记为“上层废液”。</li>
		<li>将注射器中的 1.5 g/ml 组分（含 VLPs）推出，分别收集至两个新的微量离心管中。</li>
		<li>对所有样品重复步骤 2.3.8–2.3.10。</li>
		<li>向病毒浓缩液中加入 0.2 体积的氯仿，剧烈振荡，室温孵育 10 分钟，最大转速离心 5 分钟，收集水相。</li>
		<li>向经氯仿处理的病毒浓缩液中加入 10x DNase 缓冲液和 DNase I（终浓度 = 2.5 U/µl），37 °C 孵育 1.5–2 小时。</li>
		<li>于 65 °C 孵育 15 分钟以灭活 DNase 活性。</li>
		<li>取 15 µl 经氯仿和 DNase I 处理的病毒组分至新管中，加入 15 µl 4% 多聚甲醛，固定样品用于落射荧光显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 提取
	<ol>
		<li>将各样品的病毒浓缩液汇集至一个洁净并经高压灭菌的 50 ml Oak Ridge 高速离心管中。</li>
		<li>加入以下成分：0.1 体积 200x TE 缓冲液、每毫升样品加 10 μl 0.5 M EDTA、1 体积甲酰胺和 10 μl 甘油。充分混匀，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>根据新体积，加入 2 体积室温的 100% 乙醇。充分混匀，4 °C 孵育至少 30 分钟。</li>
		<li>使用 SS-34 转子，在 4 °C、17,226 x g 条件下离心 20 分钟，沉淀 DNA。</li>
		<li>用移液管小心弃去上清液。用冰冻的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。</li>
		<li>尽可能去除液体，室温下晾干沉淀 15 分钟。</li>
		<li>用 567 μl 1x TE 缓冲液（pH 8.0）重悬 DNA 沉淀。 
		注：室温下至少静置 15 分钟以确保完全重悬。将重悬的 DNA 于 4 °C 保存过夜，待后续处理。</li>
		<li>将全部 567 μl 重悬的 DNA 溶液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入 30 μl 预热的 10% SDS 和 3 μl 蛋白酶 K（20 μg/ml），充分混匀，56 °C 孵育 1 小时。将 CTAB/NaCl 预热至 65 °C。</li>
		<li>加入 100 μl 5 M NaCl，充分混匀。加入 80 μl 预热的 CTAB/NaCl 溶液，涡旋混匀，65 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入等体积氯仿，涡旋混匀，16,100 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入等体积酚/氯仿，涡旋混匀，16,100 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入等体积氯仿，涡旋混匀，16,100 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入等体积异丙醇，混匀，-20 °C 孵育至少 30 分钟。</li>
		<li>沉淀 DNA，4 °C、16,100 x g 离心 15 分钟。小心吸弃上清液，用冰冻的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。</li>
		<li>短暂离心，去除管中残留乙醇。室温下晾干沉淀 15 分钟。</li>
		<li>用 50 μl 洗脱缓冲液（5 mM Tris，pH 8.5）重悬 DNA 沉淀。室温下静置至少 5 分钟以充分水合。</li>
		<li>使用高灵敏度荧光定量法测定 DNA 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Phi29 聚合酶进行扩增（可选）
	<ol>
		<li>配制 2x 退火缓冲液：80 mM Tris-HCl（pH 8.0）、20 mM MgCl2。</li>
		<li>将 Phi29 DNA 聚合酶稀释至 5 U/μl。</li>
		<li>预先混合样品缓冲液，包含 50 μl 随机六聚体引物（100 μM）、125 μl 2x 退火缓冲液和 25 μl 水。分装后于 -20 °C 保存。</li>
		<li>预先混合反应缓冲液，包含 100 μl Phi29 10x 缓冲液、40 μl 10 mM dNTPs 和 560 μl 水。分装后于 -20 °C 保存。</li>
		<li>将 1 μl 模板 DNA 加入 4 μl 样品缓冲液中。</li>
		<li>95 °C 孵育 3 分钟，然后置于冰上冷却。</li>
		<li>向步骤 2.4.4 的混合物中加入 14 μl 反应缓冲液，通过反复吹打混匀。</li>
		<li>加入 1 μl Phi29 DNA 聚合酶，通过反复吹打混匀，30 °C 孵育 18 小时，随后 65 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>使用基因组 DNA 纯化柱或酚/氯仿抽提结合乙醇沉淀法纯化反应产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>落射荧光显微镜观察（参见 Haas et al. 201428 中的过滤系统设置） 
	注：分离与纯化后，可使用核酸染料结合落射荧光显微镜验证样品中病毒颗粒的存在及其纯度（图 2A 和 图 2C）。样品中的游离 DNA 可能导致背景荧光过高。因此，在固定和染色前应对样品进行 DNase I 处理。
	<ol>
		<li>配制封片液（0.1% 抗坏血酸，50% 甘油）。将 100 μl 10% 抗坏血酸加入 4.9 ml 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀。再加入 5 ml 100% 甘油，充分混匀，标记为“封片液”。</li>
		<li>使用 0.02 μm 氧化铝基质一次性注射器滤膜过滤封片液，分装至微量离心管中，-20 °C 保存。</li>
		<li>取 100 μl 样品至新微量离心管中，加入等体积 4% 多聚甲醛以固定 VLPs。室温孵育至少 10 分钟。</li>
		<li>加入 800 μl 经 0.02 μm 滤膜过滤的水，使总体积达 1 ml。向管中加入 1 μl SYBR Gold 染料，室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>启动真空泵，调节压力至 -9 至 -10 psi（-62.1 至 -68.9 kPa），设置过滤系统。</li>
		<li>用水清洗滤座，将带环形聚丙烯支撑环的 0.02 µm 氧化铝基质滤膜放入滤座中。</li>
		<li>将滤塔置于滤座上方的滤膜上，并用夹具固定。</li>
		<li>将 1.5 ml 微量离心管中的内容物移入滤塔中，静置数分钟使样品滤过。</li>
		<li>在载玻片上标记并加入 10 µl 封片试剂。</li>
		<li>保持真空开启状态，取下滤塔和夹具。</li>
		<li>小心从滤座上取下滤膜，用 Kimwipe 擦拭滤膜底部，然后将滤膜直接放置在载玻片的封片液上。</li>
		<li>再加入 10 µl 封片试剂至滤膜上，盖上盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生成微生物宏基因组
<ol>
	<li>缓冲液与溶液的制备
	<ol>
		<li>配制 50 ml 的 1× DNase 缓冲液：50 mM NaAc、10 mM MgCl2、2 mM CaCl2；调节 pH 至 6.5。经滤膜（0.22 µm）除菌，室温保存。</li>
		<li>根据牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）的 Dornase 单位/毫克干重所定义的活性，将冻干的 DNase I 酶溶解于分子级水中，配制成 1000 U/µl 的溶液。</li>
		<li>配制 100 ml 的 SE 缓冲液：75 mM NaCl、25 mM EDTA；调节 pH 至 7.5。经滤膜（0.22 µm）除菌，室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 提取前的样品预处理
	<ol>
		<li>向匀浆液中加入 5 倍体积的 0.22 µm 滤膜过滤的 1× PBS 进行稀释。例如，向 2 ml 样品中加入 10 ml 的 1× PBS。</li>
		<li>加入 β-巯基乙醇至终浓度为 2%（v/v）。在化学通风橱中，室温下轻轻摇动混合物 2 小时。</li>
		<li>在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 10 ml 分子级水（或 0.22 µm 过滤水）中，室温孵育 15 分钟。</li>
		<li>重复步骤 3.2.3 和 3.2.4 一次。</li>
		<li>在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 5 ml 的 1× DNase 缓冲液中，并按每毫升样品加入 15 µl DNase I（1,000 U/µl）。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 2 小时，期间反复混匀。</li>
		<li>在 65 °C 下孵育 15 分钟以灭活 DNase 活性。</li>
		<li>在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。将沉淀物重悬于 10 ml SE 缓冲液中。</li>
		<li>重复步骤 3.2.10。</li>
		<li>在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 2 ml SE 缓冲液中，并转移至两个微量离心管中。</li>
		<li>在微量离心管中沉淀细胞。室温下以 16,100 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>移除上清液，并使用基因组 DNA 提取试剂盒的革兰氏阳性菌变体方案从沉淀的细胞中提取 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生成宏转录组
<ol>
	<li>样品预处理
	<ol>
		<li>在样品采集和均质化后，立即在GITC裂解缓冲液中通过珠击法进行细胞机械裂解。参见步骤1.4。</li>
		<li>在4 °C、600 × g条件下离心混合物5分钟，使二氧化硅珠沉淀。</li>
		<li>将上清液转移至新管中。</li>
		<li>每使用750 μl GITC裂解缓冲液，加入200 μl氯仿，手动剧烈振荡15秒，室温孵育10分钟，然后在4 °C、3,056 × g条件下离心15分钟。在此次15分钟离心过程中，准备步骤4.2的操作。</li>
		<li>离心15分钟后（此时会形成清晰的水相-中间相-有机相分层），将水相（避免扰动中间相）转移至新的无RNase的管中。 
		注意：水相中含有RNA。在进行下一步前，将管子置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用市售的基于柱法的RNA纯化试剂盒或传统的异丙醇沉淀法进行总RNA提取与纯化。
	<ol>
		<li>基于二氧化硅柱的RNA纯化
		<ol>
			<li>测定所获得水相部分的总体积。</li>
			<li>向样品中加入适量的RNA结合缓冲液，并充分混匀。</li>
			<li>根据制造商说明书调整混合物至适当的结合条件。充分混匀后进行短暂离心。</li>
			<li>将混合物加载至RNA柱中。对于体积较大的样品，可分多次上样，每次柱子最多上样4次；否则，建议每个样品使用多个柱子。</li>
			<li>根据制造商说明书对柱子进行适当洗涤。</li>
			<li>用至少30 µl无RNase的水洗脱RNA。进行两次洗脱可略微提高RNA得率，但会导致RNA浓度被稀释。</li>
			<li>测定RNA浓度，并直接进行DNase I处理。建议使用Bioanalyzer检测RNA质量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RNA沉淀法
		<ol>
			<li>向样品中加入等体积的异丙醇（例如，向500 µl水相部分中加入500 µl异丙醇）以及2 µl浓度为10 µg/µl的无RNase糖原。</li>
			<li>室温孵育混合物10分钟。</li>
			<li>在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。</li>
			<li>小心移除上清液，加入1 ml无RNase的75%乙醇。在7,500 × g、4 °C条件下离心5分钟，以确保沉淀完整。</li>
			<li>小心移除乙醇。</li>
			<li>重复步骤4.2.2.4和4.2.2.5一次。</li>
			<li>将沉淀在空气中干燥10分钟。</li>
			<li>用50 µl无RNase的水重悬沉淀，55 °C孵育5分钟，随后直接进行DNase处理。建议使用Bioanalyzer检测RNA质量。</li>
			<li>将RNA分装后于-20 °C保存，或于-80 °C长期保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

病毒宏基因组学
使用聚乙二醇（PEG）沉淀法或小体积浓缩装置对病毒颗粒进行浓缩。在某些情况下可能无需浓缩，但需进行预过滤或低速离心以去除真核细胞和微生物细胞。病毒裂解物将进一步通过密度梯度超速离心9,41或小孔径滤膜（例如，0.45 μm）进行富集和纯化，以去除真核细胞及较大的微生物细胞25。密度梯度超速离心通常采用高密度但惰性的溶液（如蔗糖或氯化铯）来分离和浓缩病毒颗粒41。该物理分离方法基于病毒颗粒的大小和浮力密度。因此，正确选择滤膜孔径以及精确制备梯度对于分离特定的病毒群落至关重要，因为病毒样颗粒（VLPs）的物理回收效率直接决定了最终获得的病毒群落组成41 （即，无法通过滤膜或不在提取密度范围内的病毒颗粒将不会在宏基因组中被检测到）。在完成病毒的分离与浓缩后，样品中仍可能存在非病毒来源的基因组污染物，包括游离的核酸以及微生物和真核细胞。因此，验证样品中病毒颗粒的纯度极为关键（图1A和&#160;图1B）。通常采用氯仿处理以裂解残留的细胞，随后进行核酸酶处理，以在核酸提取前降解游离的核酸。
本方案的一个局限性在于使用密度梯度离心法分离病毒颗粒，该方法可能排除因浮力过大而无法进入CsCl梯度的包膜病毒颗粒。一种可替代的“全捕获”方法是省略密度梯度离心步骤，直接从经氯仿和DNase I处理的0.45 μm滤液中提取群落DNA。该方法也适用于处理拭子或血浆等体积较小的样本。然而，这种方法可能导致耐氯仿的细菌污染以及较多的耐DNase I的细胞外DNA。
目前的测序方案在文库构建过程中需要1 ng至1 μg的核酸，其中较高的DNA得率可提供更广泛的测序选择。所获得病毒组（viromes）的DNA浓度通常介于检测限以下至超过200 ng/μl之间。回收的病毒核酸量可能不足以直接进行测序文库构建。在此类情况下，核酸扩增至关重要。连接子扩增鸟枪法文库（linker amplification shotgun libraries, LASLs）2,42,43 和基于多重置换扩增（multiple displacement amplification, MDA）的全基因组扩增是两种最常用于生成足够测序用DNA的方法。以Phi29 DNA聚合酶为基础的MDA方法已知存在扩增偏好性，可能优先扩增单链DNA（ssDNA）和环状DNA，从而导致分类学和功能特征的非定量分析44,45。LASLs方法的优化版本已被证明仅引入极低程度的偏差，具有更高的灵敏度（适用于起始材料量较少的情况），并可轻松适配于不同的测序平台43。然而，该方法步骤较多，需要专用设备以最大限度减少DNA损失，且仅适用于双链DNA（dsDNA）模板。在本实验室中，该方法已成功应用于扩增从支气管肺泡灌洗液、珊瑚及海水来源的病毒样颗粒（VLPs）中提取的可检测及不可检测量级的DNA（未发表数据及Hurwitz&#160;et al.46）。
由于病毒群落具有高度多样性和很大程度上未知的特性，开发数据分析流程一直是病毒宏基因组学分析中最具有挑战性的方面之一。尽管据估计生物圈中存在约108种病毒基因型，但迄今为止，现有的病毒数据库仅包含约4,000个病毒基因组，大约仅为该估计总病毒多样性的一万分之一。因此，基于相似性的搜索方法（如BLAST47）在病毒宏基因组中进行分类学和功能注释时面临固有的困难。许多序列无法在数据库中找到具有显著相似性的基因组，因而被归类为未知序列。尽管基于同源性的搜索仍是为序列数据分配分类和功能的最重要手段，但已发展出若干不依赖数据库的替代分析方法48-50。Fancello et al.51 对病毒宏基因组学中使用的计算工具和算法进行了全面综述。
微生物宏基因组学
通常，从低渗裂解处理的微生物群落（HL-DNA）中提取的总DNA量范围为20 ng至5 μg。产量高度依赖于患者的健康状况以及采集的痰液样本量，这解释了本研究中提取的HL-DNA总产量存在差异的原因（表2）。获得高质量测序数据的关键步骤取决于所构建测序文库的质量。图2展示了利用基于酶切的DNA片段化方法，从囊性纤维化（CF）痰液来源的微生物DNA构建的测序文库的典型片段大小范围。最佳文库片段大小取决于所选用的测序平台和应用目的，因此如有需要，可通过超声处理或雾化等替代方法优化片段化步骤。除本部分展示的代表性结果外，该方法在多个时间点采集的多位囊性纤维化患者痰液样本中的成功应用，还见于Lim et al. (2012)9 和 Lim et al. (2014)10。
既往研究9,10表明，每位患者均携带一组独特的微生物群落，该群落随时间发生动态变化，从而反映出群落中主要菌群的持续存在，而波动可能由抗生素治疗等干扰因素引起。这些波动是否在无外界干扰或采样及样本处理过程影响下仍每日发生，目前尚不明确。基于HL-DNA宏基因组和16S rDNA扩增子分析，为期7天的纵向采样显示，在未使用抗生素干扰的情况下（第1、2、3天），微生物谱的每日波动极小（图3A和&#160;3B）。在第3天采样后立即开始口服抗生素治疗后，第4天微生物群落结构的变化变得明显。尽管抗生素环丙沙星可靶向多种已知细菌病原体，如P. aeruginosa、Staphylococcus aureus和Streptococcus pneumoniae，但治疗后P. aeruginosa的相对丰度增加，而Streptococcus spp.和P. melaninogenica的丰度则下降。至第6天，微生物群落逐渐恢复至初始状态的群落结构。结果提示，单个患者体内微生物谱的波动更可能源于呼吸道内微生物群落的扰动。
鉴于16S rDNA文库与HL提取DNA的宏基因组在微生物谱型上的一致性，我们排除了本研究中所用16S rRNA引物可能引入的偏差。从总DNA与HL提取DNA获得的16S rDNA分类谱型之间存在差异（图3B）的一个可能解释是，抗生素处理后环境中存在大量Pseudomonas spp.的胞外DNA。这一推论得到了以下发现的支持：这些差异在抗生素处理后的第7天最为显著，即治疗结束3天后，而该治疗方案除其他病原体外，也靶向Pseudomonas spp.。环丙沙星通常作为囊性纤维化（CF）患者合并慢性P. aeruginosa感染的一线治疗药物，尽管其抗菌谱覆盖了大多数与CF相关的病原体。我们推测，抗生素治疗清除了包括Streptococcus spp.在内的敏感菌群，从而为耐药性P. aeruginosa创造了生态位。Pseudomonas aeruginosa可能通过增强其生物膜群落获得耐药性，而研究表明其胞外DNA是生物膜结构的主要支撑成分52。即使微生物群落结构已开始恢复，胞外DNA仍可能残留在CF患者的痰液中。因此，这些数据表明，本实验流程中所采用的低渗裂解及洗涤步骤，不仅有助于去除人源DNA，还可能有效去除可能歪曲真实微生物谱型的微生物来源的胞外DNA。
宏转录组学
高质量的宏转录组应包含相对较少的核糖体RNA（rRNA）序列，并能够无偏地代表群落的转录本（mRNA）。由于mRNA的半衰期较短且含量有限，因此本方案的关键在于尽量减少样品操作步骤，以最大限度地回收转录本。
近年来，已开发出多种核糖体RNA（rRNA）去除方法，并被整合到商业试剂盒中。这些方法包括基于寡核苷酸杂交的 MICROBEnrich、Ribo-Zero 和样本特异性减法杂交技术53，以及基于外切酶酶活性、靶向含有5’单磷酸的RNA的 mRNA-ONLY 试剂盒。此外，还可使用若干mRNA富集方法，例如优先对线性RNA进行多聚腺苷酸化并扩增的 MessageAmp II-Bacteria 试剂盒。其中一些方法（例如，mRNA-ONLY、MICROBExpress 和 MessageAmp）可联合使用以达到最佳效率。然而，所有这些方法的效果均存在局限性，尤其是在处理部分降解的rRNA时——这在从囊性纤维化（CF）样本提取的总RNA中常有观察。依赖多聚腺苷酸化的RNA扩增技术无法用于生成同时包含真核和原核mRNA的宏转录组。此外，序列上添加的poly(A)尾可能会减少可用序列数据的量。含有同聚物重复序列的区域通常质量评分较低，导致测序及测序后分析软件过滤掉大量reads，且在切除poly(A)尾后，有效read长度将显著缩短54。
针对复杂的囊性纤维化（CF）微生物群落和部分降解的RNA（图4A和图4C），我们之前的研究表明，与使用其他试剂盒的联合处理方法相比，Ribo-Zero Gold试剂盒的杂交捕获法在去除人源和微生物核糖体RNA（rRNA）方面更为有效9（表3）。由此获得的数据可同时用于分析人宿主和微生物的转录本。根据RNA的得率和质量，以及最终选择的测序平台，许多实验步骤（包括cDNA合成）可与文库构建流程整合优化。例如，经Ribo-Zero处理的RNA可使用ScriptSeq RNA-Seq文库构建试剂盒制备宏转录组测序文库。
动物相关群落的宏基因组分析能够全面表征包含宿主及其相关群落的整体功能实体。本文所述的工作流程适用于多种复杂的动物相关样本，尤其适用于除目标病毒和微生物颗粒外，还含有较厚黏液、大量细胞碎片、胞外DNA、蛋白质和糖蛋白复合物以及宿主细胞的样本。尽管在每一步骤中都可能损失部分病毒和微生物颗粒，但颗粒的分离与纯化对于最大限度减少宿主DNA的干扰至关重要。宏基因组数据可提供所研究群落的代谢潜能信息，而宏转录组学则通过揭示编码功能的差异表达对其进行补充9。对基因组和转录组数据的综合评估，为群落相互作用的动态机制提供了新的见解，并有助于推动更优疗法的开发9,10,55。

过去十年中，通过应用测序技术，已对与人体相关的病毒和微生物群落进行了广泛研究1,2。这些研究结果促使人们认识到微生物在人类健康与疾病中的重要作用。其中主要推动力来自人类微生物组计划，该计划描述了存在于人体皮肤、口腔腔隙、呼吸道、泌尿生殖道以及胃肠道中的细菌（以及部分古菌）3。通过对健康人呼吸道开展的进一步微生物组研究，包括支气管肺泡灌洗（BAL）4,5 和鼻咽拭子采样4，发现肺部可作为环境采样装置，导致微生物在呼吸道中短暂定植。然而，微生物在受损呼吸道表面的定植可能引发严重且慢性的肺部感染，例如囊性纤维化（CF）患者中所观察到的情况。
囊性纤维化是一种由囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）基因突变引起的致死性遗传病6。这些突变导致CFTR蛋白功能缺陷，进而影响上皮细胞顶端表面的跨上皮离子转运。该疾病累及多个器官系统，但大多数病死率和发病率归因于囊性纤维化肺病7。囊性纤维化肺部为微生物定植提供了独特的生态系统。离子转运缺陷导致黏液在气道内积聚，形成以静止、富含营养的黏膜表面为锚定点的好氧、微需氧和厌氧微环境。这种环境促进了包括病毒、细菌和真菌在内的微生物定植与增殖。急性和慢性肺部微生物感染引发持续但无效的免疫反应，导致广泛的气道重塑、肺功能下降，最终发展为呼吸衰竭。
囊性纤维化（CF）肺部相关的细菌群落已通过依赖培养和不依赖培养的方法得到了充分描述，这些方法包括16S核糖体RNA（rRNA）基因测序8和宏基因组鸟枪法测序9,10。基于16S rRNA的方法能够表征多种微生物物种，并捕捉群落多样性的广泛变化。然而，该方法在解析群落结构方面的分辨率有限（详见Claesson et al. 201011的总结），且对代谢潜能的预测仅限于所鉴定分类单元已知的一般功能。因此，16S rRNA基因测序方法在分析CF肺部复杂微生物群落所需的分类学和功能分析精度方面存在不足。本文所述的宏基因组学方法可补充基于16S rRNA的分析，克服其局限性，并提供一种相对高效的方法，用于同时分析CF肺部微生物群落的分类组成和基因内容。
从与动物相关的样本中分离出的微生物DNA通常含有大量宿主DNA。囊性纤维化（CF）痰液或肺组织样本通常含有大量由免疫反应中性粒细胞释放的人源DNA，常占总DNA的99%以上12–14。尽管可能存在一些完整的宿主细胞，但大部分DNA以游离状态存在于溶液中，或吸附在微生物表面。此外，高度黏稠的黏液栓、细胞碎片以及其他未知污染物的存在，进一步增加了微生物细胞分离的难度。已有多种方法被尝试用于去除样本中的人源DNA，包括使用Percoll梯度离心分离人细胞与微生物细胞15、DNase I处理、溴化乙锭单叠氮化物选择性降解人源DNA16，以及MolYsis试剂盒，但效果均有限。迄今为止，针对CF痰液样本最有效的微生物DNA纯化方法是Breitenstein et al.（1995）17所描述方法的改进版本。该方法在此称为低渗裂解法（hypotonic lysis, HL），结合使用β-巯基乙醇断裂黏蛋白中的二硫键、低渗条件裂解真核细胞，以及DNase I降解游离DNA9。尽管尚无更优替代方案，HL方法仍引发了一些担忧：（i）可能因微生物非预期裂解而引入偏差；（ii）观察到的菌群组成波动9,10是否为样本处理过程中技术变异所导致的人工假象。除构建宏基因组测序文库外，本研究还通过分析同一患者连续七天采集的痰液样本，比较HL法提取的总DNA与微生物DNA的16S rRNA基因谱，以探讨上述问题。
与微生物群落相比，与动物相关的病毒群落特征研究仍较为有限18,19。囊性纤维化（CF）气道中的病毒群落仅得到初步表征20–22。首项针对CF气道病毒群落DNA的宏基因组学研究显示，与CF肺部相关的大多数病毒为噬菌体20。CF个体与非CF个体中噬菌体的代谢潜能存在显著差异。具体而言，CF个体中的噬菌体群落携带反映细菌宿主对CF气道生理环境适应性以及细菌毒力相关特征的基因20。后续针对CF肺组织中病毒的宏基因组学研究进一步揭示了不同解剖区域之间病毒群落在空间分布上的显著异质性22。此外，CF肺组织中病毒多样性为迄今在任何生态系统中观察到的最低水平22。所鉴定出的大多数病毒为噬菌体，具有感染CF致病菌的潜力。然而，也检测到真核病毒，如疱疹病毒、腺病毒和人乳头瘤病毒（HPV）。在一次解剖过程中观察到肺组织中存在囊肿时，即使该患者从未被诊断患有肺乳头瘤或癌，仍成功回收了超过99%的人乳头瘤病毒基因组。这表明，存在的病毒多样性不仅反映了组织损伤的严重程度，还可能揭示并解释一种尚未被认知的潜在疾病。本文所述方案提供了一种简单而有效的方法，用于从含有大量黏稠黏液、宿主与微生物细胞、游离DNA以及细胞碎片的样本中分离病毒样颗粒（VLPs）。
宏转录组学可补充宏基因组学，用于监测微生物群落及宿主中基因表达的动态变化9,23。在此情况下，需要优先富集微生物和宿主的mRNA。由于细菌mRNA不具有多聚腺苷酸化结构，因此无法采用基于寡核苷酸-dT的mRNA富集方法。如果已知宿主相关样本中含有大量真核生物mRNA，则也不能使用依赖多聚腺苷酸化的RNA扩增技术。许多与动物相关的样本（包括囊性纤维化痰液）除了含有高浓度的细胞外，还含有大量细胞碎片以及包括RNase在内的核酸酶。因此，另一项具有挑战性的任务是在宏转录组处理过程中防止RNA严重降解。在大多数情况下，从囊性纤维化痰液中提取的总RNA已发生部分降解，限制了后续应用及所获得RNA的利用价值。近年来，已有多种核糖体RNA（rRNA）去除方法被开发并整合到商业试剂盒中。然而，这些方法的效果有限，尤其是在处理部分降解的rRNA时效果更差9,24。本文所采用的方法能够获得部分降解但仍适用于高效去除总rRNA的总RNA。Lim et al.（2012）通过直接比较两种不同试剂盒在去除部分降解总RNA中的rRNA效率，对此进行了说明9。
总体而言，本论文的目标是提供一套完整的实验方案（图1），以诱导痰液样本为例，从单一的宿主相关样本中同时构建病毒和微生物的鸟枪法宏基因组以及宏转录组。分子生物学实验流程应设有独立的扩增前和扩增后操作区域，以最大限度减少交叉污染。本方法可轻松适用于其他类型的样本，如组织22、鼻咽和口咽拭子25、支气管肺泡灌洗液（BAL）以及珊瑚样本（未发表数据）。尤其在需要开展微生物宏基因组学和宏转录组学研究时，样本应在采集后立即处理。若样本经过冷冻，可能破坏微生物细胞的完整性，从而限制完整微生物细胞的分离，影响微生物宏基因组的构建。然而，冷冻并不完全排除开展宏转录组学研究或病毒分离的可能性，但冻融过程可能影响RNA的质量以及回收病毒颗粒的数量。值得注意的是，在多项与成年囊性纤维化（CF）患者及其他慢性肺部疾病相关的研究中，诱导痰液一直是主要的样本来源26,27，因为支气管肺泡灌洗可能具有较强侵入性。在我们的研究中，痰液样本采用谨慎且一致的采样方法收集，即，在采集前使用无菌生理盐水漱口并冲洗口腔，以将口腔微生物对痰液样本的污染降至最低。

<table><tbody><tr><td>基于异硫氰酸胍的RNA裂解缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>本研究使用了TRIzol LS试剂</td></tr><tr><td>二氧化硅珠；0.1至0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>本研究使用了硅酸锆珠</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇，分子生物学级（干粉）</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>可从其他任意公司购买</td></tr><tr><td>无菌注射器滤器；0.45 &amp;micro;m孔径，亲水性PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I酶&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器；0.02 &amp;micro;m孔径</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>直径：25 mm</td></tr><tr><td>超透明离心管</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &amp;frac12; 英寸（14 x 90 mm），适用于SW41 Ti转子及VLPs密度梯度超速离心</td></tr><tr><td>SW41 Ti转子</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34固定角转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA聚合酶</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Phi29随机六聚体</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>此前购自Fidelity Systems</td></tr><tr><td>带环形聚丙烯支撑环的氧化铝基质滤膜；0.02 &amp;micro;m孔径</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>本研究使用了Whatman Anodisc滤膜；直径25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold核酸凝胶染料</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>可从其他任意公司购买</td></tr><tr><td>糖原，RNA级</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>可从其他任意公司购买</td></tr><tr><td>橡树岭高速离心管</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>用于大体积DNA提取程序，适用于SS-34固定角转子</td></tr><tr><td>总rRNA去除试剂盒</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold试剂盒（流行病学）可用于将rRNA去除与测序文库制备相结合</td></tr><tr><td>氯化铯&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

纯化不纯：从复杂的动物相关样本中测序宏基因组和宏转录组

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

高通量测序技术的普及已彻底改变了生物学的众多领域。为了更深入地理解宿主相关的病毒和微生物群落，研究人员开发了一套全面的DNA和RNA提取工作流程。该流程可从单个样本中同时生成病毒和微生物的宏基因组以及宏转录组，用于下一代测序。这些方法的结合可提供关于群落分类学特征及其编码功能的全面视图。所介绍的方法使用囊性纤维化（CF）痰液样本——一种具有挑战性的样本类型，因其极为黏稠，并含有大量黏蛋白、游离的中性粒细胞DNA以及其他未知污染物。此处描述的实验方案针对上述问题进行了优化，能够成功回收病毒和微生物DNA，同时最大限度减少人源DNA的污染。为补充宏基因组学研究，还优化了一项宏转录组学实验流程，用于回收微生物和宿主mRNA，其中核糖体RNA（rRNA）序列含量相对较少。本文提供了数据特征的概述，可作为评估方法成功与否的参考依据。此外，还收集了其他CF痰液样本，以（i）评估单个患者在连续七天内微生物组谱的稳定性，以及（ii）比较宏基因组学方法与基于16S核糖体RNA基因测序方法的一致性。结果表明，在未使用抗生素干扰的情况下，微生物谱的日间波动极小；且常见CF相关细菌的分类谱在低渗裂解（HL）来源DNA构建的16S rDNA文库与宏基因组之间高度相似。然而，由总DNA和HL来源DNA生成的16S rDNA分类谱之间的差异表明，低渗裂解及后续洗涤步骤不仅有助于去除人源DNA，还能去除可能歪曲真实微生物谱的微生物来源的胞外DNA。

以囊性纤维化气道为例，该论文提出了一套综合性的实验流程，结合宏基因组学和宏转录组学方法，用于表征与动物相关的样本中的微生物和病毒群落。

高通量测序技术的普及已彻底改变了生物学的众多领域。为了更深入地理解宿主相关的病毒及……

本实验的总体目标是采集和处理复杂的与宿主相关的样本（如囊性纤维化痰液），以通过宏基因组学和宏转录组学方法研究其中的病毒和微生物群落。首先让受试者通过雾化器吸入7%高渗盐水，随后在30分钟内收集诱导痰样本。接着，立即将样本均质化，并等量分装至四个标记为病毒宏基因组、微生物宏基因组、宏转录组和额外痰液的试管中。接下来，将宏转录组样品管密封后水平放置，并以中等速度振荡10分钟以均质化痰液。最后，将各份样品分别处理，以分离和纯化病毒或细菌细胞，随后进行核酸提取，用于宏基因组学研究。最终，所提取的核酸将用于高通量测序文库的构建，以生成宏基因组和宏转录组文库。该方法的主要优势在于提供了一套全面的工作流程，可用于处理复杂的宿主相关样本，从而在 DNA 和 RNA 水平上研究病毒和细菌群落。对该过程进行可视化演示至关重要，因为样本预处理步骤对于确保样本的正确处理具有关键作用，而病毒和微生物细胞纯化步骤由于操作复杂，难以掌握。在样本采集前，为每个样本标记四个 15 毫升离心管，分别标注为：第一管为病毒宏基因组，第二管为微生物宏基因组，第三管为宏转录组，第四管为额外痰液。向标注为宏转录组的管中加入 2 毫升 0.1 毫米的二氧化硅珠，随后加入 6 毫升基于胍基异硫氰酸盐的 RNA 裂解缓冲液（GITC 裂解缓冲液）。按照文本方案中所述的样本采集流程，使用预先称重的采样杯，通过采集样本后称量采样杯重量，并减去空杯重量，从而估算样本体积。对于剩余重量，每1克相当于1毫升样本。若样本体积少于8毫升，需加入适量的0.02微米滤过的1×PBS缓冲液，使最终体积达到8毫升。然后立即使用一支3毫升注射器对样本进行匀浆，直至痰液中无可见的团块为止。用同一支注射器立即吸取2毫升痰液，注入含有硅胶珠和GITC裂解缓冲液的微转录组管中。盖紧管盖，并用Parafilm封口膜密封，防止泄漏；随后立即使用涡旋振荡器以中等速度匀浆痰液10分钟。使用同一支注射器，分别将2毫升痰液分装至标记为病毒宏基因组和微生物宏基因组的管中，并将痰杯中剩余的痰液转移至标记为额外痰液的管中。将所有试管置于四摄氏度或冰上保存，必要时运送至实验室以制备病毒宏基因组。在配制好缓冲液和溶液后，通过加入0.02微米滤过的氯化镁盐溶液，将样品预处理至总体积为六毫升。为促进黏液溶解，向每个样本中加入 6 毫升 6.5 毫摩尔的 DTT。剧烈涡旋混匀，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。再次剧烈涡旋样本后，在 10 摄氏度下以 3056 ×g 离心 15 至 20 分钟。将每份上清液收集到新的15毫升离心管中。接着，使用安装在注射器上的0.45微米滤器将上清液过滤至新的15毫升离心管中。取100微升样品加入微量离心管中，然后进行氯仿处理。吸取上清液并进行DNase I处理。加入等体积的4%多聚甲醛固定样品。对于落射荧光显微镜观察，请参考文本方案中提供的通用病毒颗粒富集方法。否则，使用新配制的氯化铯溶液，通过向每根离心管中依次加入1毫升浓度为1.7克/毫升的氯化铯溶液、1毫升浓度为1.5克/毫升的氯化铯溶液、1毫升浓度为1.35克/毫升的氯化铯溶液，最后加入1毫升浓度为1.2克/毫升的氯化铯溶液，来建立氯化铯梯度。最后，向各梯度管中分别加入6至8毫升样品。标记各层的位置，以标明每部分的所在位置。然后将每对相对的离心管质量平衡至相差不超过一毫克。小心地将每个离心管固定到甩平转子的吊桶中。装入转子后，在4°C、82,844 ×g条件下离心两小时。离心结束后，使用连接18号针头的3毫升注射器，小心地从离心管架中取出离心管，注意不要破坏密度梯度。确保针头开口端朝上。将针头插入1.5克/毫升密度层稍下方的位置，缓慢吸取约1.5毫升溶液至注射器中。缓慢取出针头，让管中剩余的组分通过穿刺处滴入一个新的15毫升离心管中。将此组分标记为上层组分腰部。将注射器中含有V ps的溶液转移至两个新的微量离心管中。按照文本方案准备好缓冲液和溶液后，加入五倍体积经0.22微米滤膜过滤的1×PBS，以稀释每份匀浆。在化学通风橱中，加入β-巯基乙醇至终浓度为2%（体积比），室温下摇动混合物孵育两小时。在3056 ×g、10 °C条件下离心样品15分钟。弃去上清液后，加入10 mL分子生物学级水重悬沉淀，室温孵育15分钟，然后重复洗涤一次。最后一次离心后，弃去上清液，加入5 mL 1× DNA缓冲液重悬沉淀，再加入15 µL ds。每毫升样品在37摄氏度下孵育，期间反复混匀，持续两小时。将样品离心后弃去上清液，加入10毫升SE缓冲液重悬沉淀。然后再次离心样品，并重复洗涤步骤。用 2 毫升 SE 缓冲液重悬沉淀，并将悬液转移至两支微量离心管中。然后在室温下以 16,000 ×g 离心 15 分钟。最后，弃去上清液后，按照革兰氏阳性菌的操作说明使用基因组 DNA 提取试剂盒进行提取。为了分离DNA，此处总结了先前用于生成病毒宏基因组的结果。这些病毒组中含有的人类来源序列很少，仅有一个样本含有70%的人类DNA；样本CCF four A被排除在密度梯度超速离心步骤之外，因此其含有的人类来源序列超过97%。该图显示了一个典型的囊性纤维化（CF）痰液样本在密度梯度超速离心前后的荧光图像。在此处所示的密度梯度分离后，未见大颗粒，仅观察到清晰的病毒样颗粒（vlp）。从一名开始口服抗生素的囊性纤维化患者中连续七天收集了痰液样本。自采集第三天起，从各样本中通过低渗裂解获得的HL DNA总产量，经由为各样本构建的Illumina测序文库测定，范围从210纳克至超过5微克。除一个文库外，其余文库均获得了超过 100 万条序列，并且在数据预处理后保留了超过 85% 的高质量序列。使用 print seq 软件分析显示，人源序列所占比例在 14% 至 46% 之间。如图所示，经过两次低渗裂解处理后，各亚样本的微生物谱与原始样本高度相似。此外，第二次低渗裂解使宏基因组中非人源序列的比例增加了 6% 至 17%。请注意，处理临床样本和潜在病原体可能具有极高的危险性。在样本处理过程中，必须始终穿戴个人防护装备。进行本实验操作时，需要具备良好的分子生物学和微生物学技术，以确保不发生污染。通过此操作流程，您将能够对囊性纤维化痰液等复杂样本进行病毒和微生物宏基因组学以及宏转录组学研究。

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科研

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Biology

生物学

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