纯化不纯：从复杂的动物相关样本中测序宏基因组和宏转录组

本实验的总体目标是采集和处理复杂的与宿主相关的样本（如囊性纤维化痰液），以通过宏基因组学和宏转录组学方法研究其中的病毒和微生物群落。首先让受试者通过雾化器吸入7%高渗盐水，随后在30分钟内收集诱导痰样本。接着，立即将样本均质化，并等量分装至四个标记为病毒宏基因组、微生物宏基因组、宏转录组和额外痰液的试管中。

接下来，将宏转录组样品管密封后水平放置，并以中等速度振荡10分钟以均质化痰液。最后，将各份样品分别处理，以分离和纯化病毒或细菌细胞，随后进行核酸提取，用于宏基因组学研究。最终，所提取的核酸将用于高通量测序文库的构建，以生成宏基因组和宏转录组文库。

该方法的主要优势在于提供了一套全面的工作流程，可用于处理复杂的宿主相关样本，从而在 DNA 和 RNA 水平上研究病毒和细菌群落。对该过程进行可视化演示至关重要，因为样本预处理步骤对于确保样本的正确处理具有关键作用，而病毒和微生物细胞纯化步骤由于操作复杂，难以掌握。在样本采集前，为每个样本标记四个 15 毫升离心管，分别标注为：第一管为病毒宏基因组，第二管为微生物宏基因组，第三管为宏转录组，第四管为额外痰液。向标注为宏转录组的管中加入 2 毫升 0.1 毫米的二氧化硅珠，随后加入 6 毫升基于胍基异硫氰酸盐的 RNA 裂解缓冲液（GITC 裂解缓冲液）。

按照文本方案中所述的样本采集流程，使用预先称重的采样杯，通过采集样本后称量采样杯重量，并减去空杯重量，从而估算样本体积。对于剩余重量，每1克相当于1毫升样本。若样本体积少于8毫升，需加入适量的0.02微米滤过的1×PBS缓冲液，使最终体积达到8毫升。

然后立即使用一支3毫升注射器对样本进行匀浆，直至痰液中无可见的团块为止。用同一支注射器立即吸取2毫升痰液，注入含有硅胶珠和GITC裂解缓冲液的微转录组管中。盖紧管盖，并用Parafilm封口膜密封，防止泄漏；随后立即使用涡旋振荡器以中等速度匀浆痰液10分钟。使用同一支注射器，分别将2毫升痰液分装至标记为病毒宏基因组和微生物宏基因组的管中，并将痰杯中剩余的痰液转移至标记为额外痰液的管中。

将所有试管置于四摄氏度或冰上保存，必要时运送至实验室以制备病毒宏基因组。在配制好缓冲液和溶液后，通过加入0.02微米滤过的氯化镁盐溶液，将样品预处理至总体积为六毫升。

为促进黏液溶解，向每个样本中加入 6 毫升 6.5 毫摩尔的 DTT。剧烈涡旋混匀，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。再次剧烈涡旋样本后，在 10 摄氏度下以 3056 ×g 离心 15 至 20 分钟。

将每份上清液收集到新的15毫升离心管中。接着，使用安装在注射器上的0.45微米滤器将上清液过滤至新的15毫升离心管中。取100微升样品加入微量离心管中，然后进行氯仿处理。

吸取上清液并进行DNase I处理。加入等体积的4%多聚甲醛固定样品。对于落射荧光显微镜观察，请参考文本方案中提供的通用病毒颗粒富集方法。

否则，使用新配制的氯化铯溶液，通过向每根离心管中依次加入1毫升浓度为1.7克/毫升的氯化铯溶液、1毫升浓度为1.5克/毫升的氯化铯溶液、1毫升浓度为1.35克/毫升的氯化铯溶液，最后加入1毫升浓度为1.2克/毫升的氯化铯溶液，来建立氯化铯梯度。最后，向各梯度管中分别加入6至8毫升样品。标记各层的位置，以标明每部分的所在位置。

然后将每对相对的离心管质量平衡至相差不超过一毫克。小心地将每个离心管固定到甩平转子的吊桶中。装入转子后，在4°C、82,844 ×g条件下离心两小时。

离心结束后，使用连接18号针头的3毫升注射器，小心地从离心管架中取出离心管，注意不要破坏密度梯度。确保针头开口端朝上。将针头插入1.5克/毫升密度层稍下方的位置，缓慢吸取约1.5毫升溶液至注射器中。

缓慢取出针头，让管中剩余的组分通过穿刺处滴入一个新的15毫升离心管中。将此组分标记为上层组分腰部。将注射器中含有V ps的溶液转移至两个新的微量离心管中。按照文本方案准备好缓冲液和溶液后，加入五倍体积经0.22微米滤膜过滤的1×PBS，以稀释每份匀浆。在化学通风橱中，加入β-巯基乙醇至终浓度为2%（体积比），室温下摇动混合物孵育两小时。

在3056 ×g、10 °C条件下离心样品15分钟。弃去上清液后，加入10 mL分子生物学级水重悬沉淀，室温孵育15分钟，然后重复洗涤一次。最后一次离心后，弃去上清液，加入5 mL 1× DNA缓冲液重悬沉淀，再加入15 µL ds。

每毫升样品在37摄氏度下孵育，期间反复混匀，持续两小时。将样品离心后弃去上清液，加入10毫升SE缓冲液重悬沉淀。然后再次离心样品，并重复洗涤步骤。

用 2 毫升 SE 缓冲液重悬沉淀，并将悬液转移至两支微量离心管中。然后在室温下以 16,000 ×g 离心 15 分钟。最后，弃去上清液后，按照革兰氏阳性菌的操作说明使用基因组 DNA 提取试剂盒进行提取。

为了分离DNA，此处总结了先前用于生成病毒宏基因组的结果。这些病毒组中含有的人类来源序列很少，仅有一个样本含有70%的人类DNA；样本CCF four A被排除在密度梯度超速离心步骤之外，因此其含有的人类来源序列超过97%。该图显示了一个典型的囊性纤维化（CF）痰液样本在密度梯度超速离心前后的荧光图像。

在此处所示的密度梯度分离后，未见大颗粒，仅观察到清晰的病毒样颗粒（vlp）。从一名开始口服抗生素的囊性纤维化患者中连续七天收集了痰液样本。自采集第三天起，从各样本中通过低渗裂解获得的HL DNA总产量，经由为各样本构建的Illumina测序文库测定，范围从210纳克至超过5微克。

除一个文库外，其余文库均获得了超过 100 万条序列，并且在数据预处理后保留了超过 85% 的高质量序列。使用 print seq 软件分析显示，人源序列所占比例在 14% 至 46% 之间。如图所示，经过两次低渗裂解处理后，各亚样本的微生物谱与原始样本高度相似。此外，第二次低渗裂解使宏基因组中非人源序列的比例增加了 6% 至 17%。

请注意，处理临床样本和潜在病原体可能具有极高的危险性。在样本处理过程中，必须始终穿戴个人防护装备。进行本实验操作时，需要具备良好的分子生物学和微生物学技术，以确保不发生污染。

通过此操作流程，您将能够对囊性纤维化痰液等复杂样本进行病毒和微生物宏基因组学以及宏转录组学研究。