从复杂的动物相关样品测序宏基因组和Metatranscriptomes：净化不纯

该程序的总体目标是收集和处理复杂的宿主相关样本，例如囊性纤维化痰液，以使用宏基因组学和宏转录组学方法研究病毒和微生物群落。这是通过首先让受试者通过雾化器吸入 7% 高渗盐水，然后在 30 分钟内收集诱导痰液样本来实现的。接下来，立即将样品匀浆并均匀分布到标记为病毒宏基因组、微生物宏基因组、宏转录组和额外痰液的四个试管中。

接下来，密封 meta 转录组管，水平放置，并将痰液以中速匀浆 10 分钟。最后，在核酸分离用于宏基因组研究之前，将单个等分试样单独处理以分离和纯化病毒或细菌细胞。最终，分离的核酸用于高通量测序文库制备，以生成宏基因组学和元转录组学文库。

该程序的主要优点是它提供了一个全面的工作流程来处理复杂的宿主相关样品，用于 DNA 和 RNA 水平的病毒和细菌群落研究。该程序的视觉演示至关重要，因为样品预处理步骤对于确保正确处理样品很重要，而病毒和微生物细胞纯化步骤很难学习 由于程序的复杂性 在样品采集之前，每个样品标记四个 15 毫升的试管，第一个标有病毒宏基因组， 第二个是 3 号微生物宏基因组，带有宏转录组，4 号管是额外的痰液。将 2 毫升 0.1 毫米二氧化硅珠加入标记的元转录组试管中，然后加入 6 毫升基于异硫氰酸几烯酯的 RNA 裂解缓冲液或 GITC 裂解缓冲液。

按照文本方案中概述的样品采集程序，并使用预涉水样品杯，在样品采集后称量杯子并减去空杯的重量，以估计样品体积。对于剩余重量，1 克相当于 1 毫升样品。如果样品体积小于 8 毫升，则添加适当体积的 0.02 微米，过滤 1 XPBS，使最终体积达到 8 毫升。

然后立即使用 3 毫升注射器对样品进行匀浆，直到痰液中没有可见的团块，使用相同的注射器立即吸取 2 毫升痰液并将其注入含有二氧化硅珠和 GITC 裂解缓冲液的微量转录组管中。盖上盖子并使用 para 薄膜牢固密封盖子为避免泄漏，请使用涡旋，sir 立即以中速匀浆痰液 10 分钟。使用相同的注射器等分试样，将两毫升痰液分别放入标记为 vira 宏基因组和微生物宏基因组的试管中，并将剩余的痰液从痰杯转移到标记为额外痰液的试管中。

将所有试管储存在 4 摄氏度或冰上，必要时运输到实验室以产生病毒宏基因组。在制备缓冲液和溶液之后。通过添加 0.02 微米过滤的盐水镁缓冲液至总体积为 6 毫升来预处理样品。

为了帮助粘液溶解，向每个样品中加入 6 毫升 6.5 毫摩尔的 DTT。剧烈涡旋混合，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。剧烈涡旋后，样品再次在 3056 Gs 和 10 摄氏度下旋转 15 至 20 分钟。

将每个上清液收集到一个新的 15 ml 试管中。接下来，使用安装在注射器上的 45 微米点过滤器将上清液过滤到新的 15 毫升试管中。将 100 微升样品放入微量离心管中，然后进行氯仿处理。

提取上清液并进行 DN one 处理。加入等体积的 4% 对甲醛固定样品。对于 epi 荧光显微镜，请参阅文本协议，了解包罗万象的病毒颗粒富集方法。

否则，使用新鲜制备的氯化铯溶液，将 1 毫升 1.7 克/毫升的氯化铯溶液加入每个试管中，然后加入 1 毫升 1.5 克/毫升，1 毫升 1 点 35 克/毫升，最后加入 1 毫升 1.2 克/毫升氯化铯溶液。最后，将 6 至 8 mL 样品装入单独的梯度管中。标记各个图层以表示每个分数的位置。

然后将每对对 2 平衡到 1 毫克以内。小心地将每根试管锁入离心桶中。上样到转子上，在 82、844 Gs 和 4 摄氏度下离心 2 小时。

离心后，小心地从支架中取出试管，不要用连接到 3 毫升注射器的 18 号针头破坏密度梯度。确保针的开口端朝上。刺穿 1.5 克/毫升密度层下方的试管，然后慢慢将大约 1.5 毫升的溶液吸入注射器中。

慢慢取出针头，让管中剩余的馏分通过穿刺滴入新的 15 毫升管中。将其标记为上部腰部将含有 V ps 的注射器中的溶液转移到两个新的微量离心管中。制备缓冲液和溶液后，根据文本方案，加入 5 体积的 22 微米点过滤 1 XPBS 要在化学罩下稀释每个匀浆，加入 β MAR capta 乙醇至 2% 体积与体积终浓度之比，并在室温下摇动混合物孵育后 2 小时。

将样品在 3056 GS 和 10 摄氏度下旋转 15 分钟。弃去上清液后，使用 10 毫升分子级水重悬沉淀，并在室温下孵育 15 分钟，然后重复洗涤。最后一次离心后，丢弃 SUP natin 后，使用 5 毫升 1 毫升 XDNA 缓冲液重悬沉淀，然后加入 15 微升 ds。

每毫升样品 1 个 在 37 摄氏度下孵育，重复混合 2 小时。旋转样品并丢弃 snat 后，使用 10 毫升 SE 缓冲液重悬沉淀。然后旋转样品并重复洗涤。

使用 2 毫升 SE 缓冲液重悬沉淀，并将悬浮液转移到两个微量离心管中。然后在室温下以 16， 000 GS 离心试管 15 分钟。最后，去除上清液后，按照革兰氏阳性菌的说明使用基因组 DNA 提取试剂盒。

为了分离 DNA，这里总结了生成病毒宏基因组的先前结果。病毒组包含少量人源序列，只有一个样品含有 70% 人 DNA 样品 CCF 4 A，因此，它包含超过 97% 的人源序列。该图显示了密度梯度超速离心前后典型 CF 痰液样品的荧光图像。

在无大颗粒的情况下，观察到清晰的 vlp，经过此处看到的密度梯度分离。从一名开始口服抗生素的单例囊性纤维化患者中收集 7 份每日痰液样本。收集第 3 天后，从每个样品生成的 Illumina 测序文库中收集的低渗裂解物或从每个样品中收集的 HL DNA 的总产量从 210 ng 到大于 5 μg 不等。

除一个文库外，所有文库都产生了超过 100 万个序列，并且在数据预处理时保留了超过 85% 的高质量序列。使用打印 seq 软件，人源序列的总量范围为 14% 至 46%如图所示，子样品的微生物谱与两次低渗裂解处理后的样品高度相似。此外，第二次低渗裂解使宏基因组内非人序列的比例增加了 6% 至 17%。

不要忘记，处理临床样本和潜在病原体可能非常危险。在样品处理过程中，应始终使用个人防护设备。执行此程序时需要良好的分子生物学和微生物学技术，以确保无污染。

按照此程序，您应该能够对复杂样本（如 CF 痰液）进行病毒和微生物宏基因组学以及元转录组学研究。