Name: 实时成像果蝇蛹眼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用荧光显微镜对果蝇蛹眼神经上皮进行实时成像的方法。该方案通过组装成像装置和稳定样本，帮助研究人员观察细胞边界和发育过程中的细胞行为。

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作者感谢 David Larson 开发了用于活体成像黑腹果蝇（Drosophila）蛹眼的原始实验方案。我们感谢同事 Richard Carthew、Shoichiro Tsukita 和 Matthew Freeman，他们开发了转基因果蝇品系，我们将其组合用于构建活体成像果蝇品系。Brittany Baldwin-Hunter 对本文稿提出了有益的修改意见。本研究工作得到了卫斯理大学授予 Ruth Johnson 的启动资金支持。

图3展示了实验步骤的概要。
1. 组织制备
<ol>
	<li>为了确定目的基因表达改变的后果，以两组重复进行以下杂交，并在 25 °C 下培养：UAS-转基因（雄性）X GMR-GAL4; UAS-α-cat:GFP, ubi-DE-Cad:GFP ; + / SM5-TM6b （ virgin 雌性）。注意：为获得对照组织，将 UAS-lacZ 雄性与 GMR-GAL4; UAS-α-cat:GFP, ubi-DE-Cad:GFP 雌性杂交。β-半乳糖苷酶在视网膜细胞行为中不会引起缺陷。</li>
	<li>为增强 RNAi 转基因的效率，将 UAS-RNAi 雄性与 GMR-GAL4, UAS-Dcr-2; UAS-α-cat:GFP, ubi-DE-Cad:GFP; + / SM5-TM6b virgin 雌性杂交。 
	注意：在表达异位 Dcr-2 的视网膜中偶尔可观察到细胞行为的缺陷（数据未显示）。若采用此方法，建议谨慎操作。</li>
	<li>挑选具有适当基因型的白色未成熟蛹，并置于 1.5 ml 微离心管中。若蛹表达 Dcr-2，可选择雄性或雌性蛹：由于 UAS-Dcr-2 插入位于 X 染色体上，其在雄性中的表达更强。应在 0 小时 APF（蛹化后时间）对蛹进行性别鉴定，此时蛹壳尚未色素沉积——雄性生殖腺可见为位于蛹体侧面（约从后端起三分之一处）的大而透明的球状结构。</li>
	<li>将含有蛹的微离心管置于洁净的塑料吸头盒中，在 25 °C 下孵育。为防止蛹脱水，将一块 10 cm2 大小、浸透蒸馏水的纸巾放入吸头盒内。 
	注意：若吸头盒内湿度过高，蛹壳可能变得潮湿松软，导致后续解剖操作困难。</li>
	<li>孵育至适当时间。为捕捉与眼组织模式形成相关的细胞行为，建议在约 17 小时 APF、20 小时 APF 或 24 小时 APF 时准备蛹用于成像。有关特定细胞行为最佳观察时机的进一步讨论，请参见代表性结果部分。</li>
	<li>将一块新的双面胶带贴在黑色硅胶解剖皿上。将一只蛹背面向上放置，使其头部粘附于双面胶带上（图 1A）。尽量避免将蛹的胸部和腹部区域粘附在胶带上。用镊子小心提起并移除口器盖（operculum），以暴露蛹头。沿蛹壳一侧撕开，暴露单侧眼睛周围区域。</li>
	<li>轻柔地将蛹从粘性胶带上取下。若蛹仍牢固粘附，可在蛹壳与胶带交界处滴加少量蒸馏水，以减弱粘附力。</li>
</ol>
2. 装载
<ol>
	<li>用吸水纸制作一个15 mm2的小框，并在其中心打一个直径为5.5 mm的孔（图1B）。将其浸入蒸馏水中，然后置于载玻片中央。使用30 cc注射器挤出一圈均匀的凡士林，围绕在吸水纸框周围。确保凡士林圈的高度略高于蛹的厚度，且其直径略小于盖玻片的宽度。</li>
	<li>在载玻片上、吸水纸所打孔洞的正中央，添加一小滴凡士林（图1C）。小心地将蛹侧置，并由该凡士林滴支撑固定（图1D）。</li>
	<li>将盖玻片置于凡士林圈上方，使其接触眼神经上皮区域上方的上皮组织（图1D）。轻轻按压样品，使盖玻片与凡士林密封，并在蛹眼区域与盖玻片之间形成一个微小而平整的接触面。</li>
</ol>
3. 荧光成像
<ol>
	<li>使用荧光显微镜对蛹期样本进行成像。每隔 7 分钟，在黏附连接区域对眼神经上皮的顶端结构域进行连续光学切片扫描。 
	注意：a) 合适的连续光学切片通常为每个&#160;z-stack&#160;包含 4–5 层，z 轴步长为 0.2 μm。b) 上皮组织的拓扑结构可能存在不规则性，包括轻微隆起和褶皱，这可能导致难以对大面积组织区域获取清晰对焦的图像。在成像过程中，可能会发现感兴趣区域的一部分处于焦内，而邻近区域则失焦。在蛹眼与盖玻片之间加入少量蒸馏水，可消除部分急性组织褶皱，但无法消除蛹眼形态发生早期阶段常见的轻微不平整拓扑结构。在此类情况下，可通过扩展 z-stack 范围对组织进行过采样，直至整个视野的所有区域均获得清晰对焦的切片图像。c) 每隔 7 分钟采集一次连续光学切片，通常可支持 3 至 4 小时的活体成像，而不会显著降低 GFP 荧光强度，从而避免影响图像质量。若时间间隔更短，可能会减少总的成像时长。</li>
	<li>持续成像 3 至 4 小时。请勿使用许多荧光显微镜配备的自动对焦和定时功能，因为蛹体生长及血淋巴的搏动会导致视网膜位置发生移动，因此需每隔 14–21 分钟手动重新对焦。注意：超过 4 小时的成像可能会减缓甚至阻碍眼的形态发生过程。</li>
	<li>使用适当的去卷积软件以降低背景噪声并增强连续光学切片图像的对比度。对于每个 z-stack 文件，在 LAS AF 软件中执行以下操作（参见材料表）：进入“工具”面板，选择“3D 去卷积”，然后点击“应用”。</li>
	<li>为每个去卷积后的 stack 文件生成最大强度投影（MP）图像：进入“工具”面板，选择“3D 投影”，然后点击“应用”。 
	注意：对于经过过采样的组织，最大强度投影算法可能无法生成整体清晰对焦的图像。针对失焦区域的锐化技术将在步骤 5.2 中详细说明。</li>
</ol>
4. 成像后蛹体拯救及表型验证
<ol>
	<li>为了判断成像过程中是否引入了伪影或对蛹造成了损伤，需小心地将蛹从成像装置中取出：使用镊子移去盖玻片，并将蛹转移至一个装有干净食物的离心管中。在室温或 25 °C 下培养，直至成虫羽化。</li>
	<li>仔细观察成虫复眼的表型，并与来自原始杂交果蝇的成虫复眼进行比较。</li>
</ol>
5. 图像处理
<ol>
	<li>自动图像对齐： 
	注意：Drosophila 活体组织在成像过程中会发生位移和生长。因此，在不同时间点采集的图像中心可能并不对应于 Drosophila 组织中的同一位置。此外，整个视网膜盘在约 21 至 23 小时 APF 期间会旋转约 30°。为了突出单个细胞的行为并减少由生物体生长带来的干扰，需对每幅多焦点（MP）图像进行对齐。虽然此操作可手动完成，但此处使用的图像编辑软件（见材料表）具有内置算法，可加快处理过程。
	<ol>
		<li>从主菜单的“文件”选项卡中，打开“脚本”，选择“将文件加载为堆栈”。</li>
		<li>将 MP 图像文件导入“加载图层”面板，然后选择“确定”。请确保未选中“尝试自动对齐源图像”选项。 
		注意：如果选中此选项，软件可能会使用导致图像数据失真的对齐算法。</li>
		<li>当所有 MP 文件加载到图层面板后，请确保所有图像按时间顺序排列，最早的时间点位于图层堆栈的顶部。如果图层顺序不正确，请通过拖放方式调整至正确顺序。</li>
		<li>从主菜单的“编辑”选项卡中选择“自动对齐图层”。选择“仅重新定位”，然后点击“确定”。</li>
		<li>如果自动对齐算法未能将各帧对准相关焦点，可使用“移动”工具进行微调。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复合锐化： 
	注意：初始 MP 图像的离焦区域可通过 LAS AF 软件中对相应去卷积堆栈进行“裁剪”来实现锐化。裁剪堆栈文件可手动限定参与最大投影（Maximum Projection）算法的 z 堆栈区间。
	<ol>
		<li>在工具面板中（位于“处理”选项卡下）找到“裁剪”功能。手动限定起始和终止切片，使其仅覆盖初始离焦区域内的黏附带部分。点击“应用”，生成针对该区域优化的新堆栈文件。</li>
		<li>对局部优化后的堆栈生成新的最大投影图像，并导出为 TIFF 文件。</li>
		<li>在图像编辑软件中（见材料表），打开主菜单“文件”选项卡下的“脚本”，选择“将文件加载为堆栈”。</li>
		<li>将某一特定时间点的初始 MP 图像文件和局部优化后的 MP 文件导入“加载图层”面板，然后选择“确定”。请确保未选中“尝试自动对齐源图像”选项。</li>
		<li>在图层面板中同时选中两个图层，然后选择“自动混合图层”（位于主菜单“编辑”选项卡下），以自动遮罩两幅图像的相应区域，从而获得整个视网膜区域均清晰对焦的复合图像。将该复合图像保存为 TIFF 文件。</li>
		<li>对所有质量欠佳的 MP 图像重复步骤 5.2.1 至 5.2.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进一步调整：旋转、裁剪及调整动画图层的色阶：
	<ol>
		<li>选中所有图层后，使用变换工具（编辑 &#62; 自由变换）旋转图像，使视网膜的背腹轴与动画帧的 y 轴对齐。</li>
		<li>如有必要，使用裁剪工具将视野调整至所需的大小和形状。</li>
		<li>通过调整各帧的色阶，增强细胞膜与细胞体之间的对比度。</li>
		<li>出于视觉呈现目的或为突出特定细胞行为，可在每一帧中引入伪彩色以高亮显示感兴趣区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动画制作：将图像转换为视频：
	<ol>
		<li>从主菜单“窗口”选项卡中打开“动画”面板。在动画面板右上角的菜单中选择“从图层创建帧”。</li>
		<li>请注意，图层会按从堆栈底部开始的顺序依次添加到动画面板中。若要反转帧的顺序，请先选中所有帧，然后从动画面板菜单中选择“反转帧”。</li>
		<li>使用帧缩略图下方的下拉菜单为每一帧设置帧延迟时间。 
		注意：本文中展示的视频 1 至 4 的帧延迟时间为 0.8 秒。</li>
		<li>从主菜单“文件”选项卡中打开“导出”，选择“渲染视频”。在“文件选项”中选择 QuickTime 导出，并选择所需的视频格式；在“渲染选项”中将帧速率设为“自定义”，输入帧速率为 15，然后点击“渲染”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
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<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li>
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<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112(1989).</li>
<li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li>
<li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li>
<li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

野生型发育过程的描述（上文）为RNAi或过表达基因型中图式形成事件的比较提供了基础。在确定特定目的蛋白所调控的细胞行为时，对活体组织发育过程的比较具有重要价值。此外（本文未详述），活细胞成像能够对目的基因在眼发育图式形成事件中所起的作用进行定性及/或定量的描述。在羽化后30至32小时（APF），大多数色素细胞已获得稳定位置，且凋亡过程已将视网膜区域中多余的细胞清除。此后，随着色素细胞逐渐呈现其特征性形态，仅观察到细微变化：三级色素细胞（3°）变为六边形，而一级色素细胞（1°）轻微扩展的同时，相邻的矩形二级色素细胞（2°）的宽度减小。后续色素和晶状体物质的生成可能会阻碍对黏附连接的成功成像。
尽管这是一种有价值的策略，但在对活体蛹眼进行成像时，必须注意若干潜在问题。首先，移除蛹体前端的蛹壳会使动物在制片和成像过程中极易受到脱水、过热和机械损伤的影响。此类损伤可能引发非典型的组织发育，从而干扰实验数据，且这些异常与待研究的基因型本身无关。其次，本文所述方案要求玻璃盖玻片直接接触蛹头部上皮组织。我们观察到，若在将盖玻片压向眼睛时施加过大的压力，会导致视网膜发育停滞。事实上，在其他系统中已...

复眼Drosophila的特征在于其约750个小眼以蜂窝状排列，其间由附属色素细胞构成的蜂巢状晶格分隔4,5。这些色素细胞通过一系列协调的生物学事件形成特定模式：局部细胞运动、细胞生长、细胞形态变化以及细胞凋亡。对该上皮组织进行活体成像，可在一个生理相关且未受干扰的三维环境中研究调控这些事件的分子机制。
与先前的方案6,7相比，本文所述技术引入了一种高效的方法，用于稳定无法与成像过程分离的外部组织运动。该方法增强了对发育中黑腹果蝇（Drosophila）蛹眼上皮组织中细胞行为的研究——该组织在成像过程中会发生生长、旋转和位移。此外，本文描述的运动稳定技术也可用于研究其他存在外部运动情境下的细胞行为。
为了在Drosophila视网膜区域中可视化细胞边界，构建了转基因果蝇品系，该品系在眼特异性驱动子GMR-GAL41-3的控制下表达ubi-DE-Cadherin:GFP以及UAS-α-catenin:GFP。使用两种GFP标记的膜蛋白标记物可在较低光照强度下实现细胞边界的可视化，从而在反复暴露于高能波长光时最小化组织损伤和荧光漂白，进而提高成像帧率和延时成像时长。为了增强RNAi转基因的效率，还在第二个果蝇品系中引入了UAS-Dcr-28。
第三项更新是对先前方案的改进，介绍了一种更简单的成像装置，可在大多数实验室中轻松组装。该装置无需依赖大学“机械加工车间”或类似服务机构来定制专用的成像设备。此成像装置与用于成像其他蛹期组织的装置类似9,10。
本文介绍了一种简单的活细胞成像实验方案，可用于直接评估从蛹形成后约17小时至42小时（hr APF）期间参与眼图式形成的形态发生事件。具体而言，该方案能够用于确定在蛹发育阶段调控基因表达所导致的生物学效应。

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>可向作者申请获取</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&amp;nbsp;</td><td>可向作者申请获取</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M双面胶带</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>黑色Sylgard解剖皿</td><td></td><td></td><td>将Sylgard（用细磨的炭粉染成黑色）或Sylgard 170倒入玻璃培养皿至边缘，室温下静置24–48小时使其聚合</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>道康宁（Dow Corning）</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard（黑色）</td><td>道康宁（Dow Corning）</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>康宁（Corning）</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 × 75 × 1 mm 玻璃显微镜载玻片</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 × 40 mm 玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools）</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm色谱纸</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>19-086-291</td><td>或在当地药店购买。</td></tr><tr><td>30 ml 注射器</td><td>费舍科学（Fisher Scientific）</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM 显微镜</td><td>徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF 版本 2.6.0.7266 显微镜软件</td><td>徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活体成像 果蝇 蛹期复眼

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

固有过程 果蝇 蛹期发育会以多种方式改变并扭曲眼上皮组织，使得在活细胞成像过程中难以追踪单个细胞的行为。这些过程包括：视网膜旋转、细胞生长以及整体生物体的运动。此外，上皮组织拓扑结构的不规则性（包括在制备成像样本过程中常引入的微小隆起和褶皱）导致在单一焦平面上难以获取多个小眼清晰对焦的图像。本文所述的工作流程可解决上述问题，从而实现对发育过程中细胞活动的便捷分析 果蝇 蛹期眼部发育。将适当发育阶段的蛹置于成像装置中，该装置可在大多数实验室中轻松组装。 泛素-DE-钙黏蛋白:GFP 和 GMR-GAL4驱动的 UAS-α-连环蛋白:GFP 用于可视化眼上皮中的细胞边界 1-3去卷积处理应用于在多个焦平面上捕获的荧光图像后，为每个时间点生成最大投影图像，并使用图像编辑软件进行增强。采用图像配准算法快速稳定多余的运动，从而更易于追踪单个细胞的行为。

活体成像蛹眼是一种成功的研究策略，可用于观察参与神经上皮模式形成的细胞行为。通过在眼发育过程中表达可改变蛋白质水平的转基因，能够便捷地评估特定蛋白质的功能。为此 GMR-GAL4 用于在形态发生沟后驱动转基因表达。这种方法的优势在于不会干扰在前两个幼虫龄期中建立眼区的早期事件。此外，许多RNAi转基因需要较长时间才能有效降低蛋白水平（数据未显示）。因此，使用 GMR-GAL4 驱动品系通常能在三龄幼虫阶段支持眼部正常发育，并在变态过程中使眼盘外翻顺利进行，且仅在蛹期眼形态发生后期才显著降低蛋白水平。然而，若幼虫发育阶段因高效RNAi转基因而受到干扰，则果蝇杂交可维持在 18 °C 以降低转基因表达，并将蛹转移至 25 °C 在0小时羽化前（0 hr APF）。为评估RNAi转基因表达的效率，应采用标准技术对发育阶段匹配的蛹进行转录本或蛋白质水平的检测例如 定量PCR、免疫荧光、免疫印迹
在幼虫发育过程中，每个小眼的光感受器核心以一种从眼盘后部向前部传播的波状模式被招募11。这种发育梯度在蛹期眼组织中仍然保留...

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇 蛹眼神经上皮。该方法通过使用多种GFP标记的连接蛋白来增强细胞边界的可视化，补偿了组织移动和拓扑不均一性，并采用易于组装的成像装置。

果蝇蛹发育的固有过程可能导致眼上皮发生位移和形变，从而难以追踪单个细胞的行为……

本实验的总体目标是展示一种高效生成果蝇瞳孔眼发育活体成像视频的方法。首先，需去除果蝇蛹壳的角质层，并沿一侧撕开以暴露单眼的神经上皮组织；第二步是组装成像装置，并将蛹体固定在一小滴石蜡油上。使用标准荧光显微镜获取神经上皮在黏附带区域的连续切片图像。最后一步是在标准图像编辑软件中对图像进行稳定化处理并调整颜色。最终，通过活细胞成像技术研究果蝇神经上皮，以阐明形成该模式的细胞行为。眼睛 该方法的可视化演示至关重要，因为解剖蛹的部分组织后，将其正确安装到成像装置中可能较为困难，因为此阶段的蛹相当脆弱。此外，蛹的正确朝向以及盖玻片在眼上皮上方的准确放置，对成功成像至关重要。本次操作演示将由本实验室的 Mark Hellerman 完成。实验开始时，从先前杂交的基因型中选取白色预开花的植株，放入1.5毫升离心管中。接着，将一块10平方厘米大小、浸有蒸馏水的组织培养滤纸放入洁净的塑料枪头盒中。将微型离心管插入该枪头盒内。湿润的组织可防止蛹体脱水，随后在25摄氏度下孵育17至25小时。孵育后，将一片新的双面胶带贴到黑色雪茄解剖皿上。将蛹背面向上放置在胶带上，并确保蛹的头部粘附在双面胶带上，而胸部和腹部区域不与胶带粘连。使用镊子小心提起并移除A型角膜接触镜，以暴露瞳孔头部。接着，沿瞳孔囊的一侧撕开。为暴露一只眼睛周围的区域，轻柔地将瞳孔从胶带上取下。用吸水纸制作一个15平方毫米的小框，并在中间打一个5毫米的孔。将该框浸入蒸馏水中，然后用30毫升注射器将其放置在显微镜载玻片的中央。挤出一圈均匀的凡士林，围绕在吸水纸框架周围。接着，在载玻片上直接添加一小滴凡士林。小心地将蛹侧放，并用凡士林小滴将其固定支撑。将盖玻片置于凡士林环上方，使其接触眼球上方的上皮组织。轻轻按压标本，使盖玻片与凡士林密封，并在瞳孔眼区与盖玻片之间形成一个微小的平坦接触面，即瞳孔制备样本。使用荧光显微镜，每隔七分钟对眼球的AAL区域以及黏附连接区域的神经上皮进行连续切片成像。使用适当的去卷积软件，对每个 Zack 文件和 L-A-S-A-F 软件的连续切片图像进行背景降低和对比度增强。进入工具面板，选择 3D 去卷积，然后点击应用。对每个去卷积后的图像序列文件生成最大投影（MP）图像。对每个MP图像进行对齐，以突出显示单个细胞的行为，并减少由生物体生长引起的干扰。在Photoshop CS5的主菜单“文件”选项卡中，使用内置算法，打开“脚本”，然后选择“将文件载入堆栈”。接下来，将MP图像文件导入到图层加载面板中。请确保不要选中“尝试自动对齐源图像”选项，否则图像数据可能会发生畸变。当所有 MP 文件均已加载到图层窗格后，检查所有图像是否按时间顺序排列，并确保最早的时间点位于图层顶部。通过拖放堆叠图层，直至其顺序正确。如有需要，可选择自动对齐图层。选择重新定位并单击确定。通过校正初始多点图像中失焦的区域，可获得焦点均匀的视网膜视野。开始图像处理时，请在LAS软件中使用裁剪功能。手动限制 Saf 的初始和终止切片，使其仅覆盖初始失焦区域内的黏附带。单击应用，生成一个针对该区域优化的新图像栈文件。接下来，对局部优化后的图像栈生成新的最大强度投影，并将其作为 TIF 文件在 Photoshop 中导出。打开脚本并选择将文件加载到堆栈中。然后将初始 MP 文件和优化后的 MP 文件输入到加载图层面板中。再次确保未选中“尝试自动对齐源图像”选项，并点击确定。选择两个图层并使用自动混合图层功能，以生成一个整体清晰的视网膜视野图像。将该合成图像保存为 TIF 文件。使用变换工具旋转图像，使视网膜的背腹轴与视频帧的 Y 轴对齐。使用单个帧的亮度调整功能，增强细胞膜与细胞体之间的对比度。然后选择“从图层创建帧”以将图像转换为视频。请注意，图层会按照从堆栈底部开始的顺序依次添加到动画窗格中。要反转图层的顺序，首先选择所有帧，然后选择“反转帧”。将每帧的帧延迟时间设置为 0.8 秒，并选择 QuickTime。导出并选择所需的视频格式。最后，在渲染选项中，将帧率设置为自定义，并输入15的帧率，然后点击渲染。通过该技术观察到眼睛发育过程中存在显著的梯度变化，这促使了对眼睛图式形成的详细描述。在初级包裹过程中，两个细胞被招募为初级细胞，它们迅速包围感光细胞束，并相互连接形成稳定的连接。当初级细胞进行包裹和封闭时，未分化的间质细胞呈无序排列。每个感光细胞束的局部细胞运动发生了重组。最初，细胞聚集在每个小眼的背侧和腹侧。细胞间的嵌合排列将两列细胞重组为单列。在嵌合排列之后，通过显微镜观察到了三级竞争现象。竞争细胞在被取代前占据三级生态位约5到10分钟。最终，单个细胞建立起稳定的三级生态位。在最终修剪过程中，细胞凋亡激增，使内部支撑细胞（ICS）数量减少至在复眼中高效生成肠样细胞晶格所需的最低数量。一旦掌握，若操作正确，PPE 的成像可在四小时内完成。后续图像处理大约需要一小时。

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发育生物学

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活体成像果蝇蛹期复眼

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