实时成像果蝇蛹眼

该协议提供了一种对活果蝇蛹眼神经上皮进行成像的有效方法。该方法补偿了组织移动和不均匀的拓扑结构，通过使用多种 GFP 标记的连接蛋白增强了细胞边界的可视化，并使用易于组装的成像装置。

该程序的总体目标是展示一种生成果蝇瞳孔眼发育实时成像电影的有效方法。这是通过首先去除瞳孔盒的 O 型烫发并沿侧面撕裂以露出一只眼睛的神经上皮来实现的。第二步是组装成像装置并将蛹安装在一小颗凡士林珠上。

接下来，使用标准荧光显微镜获取粘附带区域中神经上皮的序列切片。最后一步是在标准图像编辑软件中稳定素材并进行颜色调整。最终，果蝇神经上皮的活细胞成像用于阐明该模式的细胞行为。

这种方法的眼睛视觉演示至关重要，因为部分解剖蛹然后将其正确安装在成像装置中可能很棘手，因为蛹在这个阶段相当脆弱。此外，蛹的正确方向和盖玻片在眼上皮上方的正确放置对于成功成像至关重要。演示该程序的将是来自我们实验室的 Mark Hellerman。

要开始实验，请从先前交叉的基因型中选择白色 pre puy，并将它们放入 1.5 mL离心管中。接下来，将一块浸泡在蒸馏水中的 10 厘米见方的纸巾放入干净的塑料吸头盒中。将微量离心管插入吸头盒。

湿组织将防止蛹干燥，然后在 25 摄氏度下孵育 17 至 25 小时。孵育后，将一块新鲜的双面胶带放在黑色雪茄解剖皿上。将蛹的背侧朝上放在胶带上，确保蛹的头部连接到双面胶带上，而不会粘附蛹的胸部和腹部区域。

使用镊子小心地提起并取下 A 型烫发，露出瞳孔头。接下来，沿着瞳孔盒的侧面撕裂。要暴露一只眼睛周围的区域，请轻轻地从胶带上取下瞳孔。

用吸墨纸构建 15 平方毫米的小框架，并在中间打一个 5 毫米的孔。将框架和蒸馏水浸入水中，然后将其放在显微镜的中心。用 30 cc 注射器载玻片。

挤出一圈均匀的凡士林，围绕吸墨纸框架。接下来，将一小滴凡士林直接添加到载玻片上。小心地将蛹侧放，并用凡士林珠支撑它。

将盖玻片放在凡士林环的顶部，使其接触眼睛上方的上皮。轻轻压缩制剂以将盖玻片密封在凡士林上，并在瞳孔眼区域和盖玻片图像之间产生一个小的平坦接触面，即瞳孔制剂。使用荧光显微镜，每 7 分钟通过眼睛的 AAL 结构域、粘附连接区域的神经上皮捕获连续切片。

使用适当的反卷积软件来减少背景并提高每个 Zack 文件和 L-A-S-A-F 软件的序列截面图像的对比度。导航到 工具 面板。选择 3D deconvolution 并单击 apply。

为每个反卷积堆栈文件生成最大投影或 MP 图像。对齐每个 MP 图像以突出单个细胞的行为并减少生物体生长引起的干扰。使用 Photoshop CS five 中的内置算法，从主菜单的"文件"选项卡中，打开脚本并选择"将文件加载到堆栈中"。

接下来，将 MP 图像文件导入 Load layers 面板。确保 attempt to automatically align source images 选项未选中。否则，图像数据可能会失真。

将所有 MP 文件加载到图层窗格中后，检查所有图像是否按时间顺序排列，以及最早的时间点是否位于图层的顶部。堆叠拖放它们，直到它们正确排序。如果需要，请选择 Auto align layers。

选择 reposition （重新定位） 并单击 okay （确定）。失焦时，可以校正初始 MP 图像的区域以产生均匀聚焦的视网膜视野。要开始图像处理，请使用 LAS 中的 crop 函数。

Saf 手动限制初始和最终切片，因此它们仅跨越初始聚焦区域内的粘附带。单击 apply 以生成针对此区域优化的新堆栈文件。接下来，为本地优化的堆栈生成新的最大投影，并在 Photoshop 中将其导出为 TIF 文件。

打开脚本并选择 Load files into stack（将文件加载到堆栈中）。然后将初始 MP 文件和优化后的 MP 文件输入到加载图层面板中。同样，确保未选择 attempt to automatically align source images 选项，然后选择 okay.

选择两个图层，然后选择 Auto blend Layers 以产生均匀聚焦的视网膜视野。将此合成图像另存为 TIF 文件。使用变换工具旋转图像，使视网膜的背腹轴与影片帧的 Y 轴对齐。

使用单个帧的水平调整来增强细胞膜和细胞体之间的对比度。然后选择 从图层制作帧 将图像转换为电影。请注意，图层将按顺序添加到动画窗格中，从堆栈底部开始。

要反转堆栈的顺序，请选择所有帧，然后选择 reverse frames。为每帧选择 0.8 秒的帧延迟时间，然后选择 QuickTime。导出并选择所需的视频格式。

最后，在 render options （渲染选项） 下，选择要自定义的帧速率，然后输入帧速率 15。然后单击 render。使用这种技术在眼睛上观察到明显的发育梯度，这促使对眼睛图案进行了详细描述。

在初级包裹过程中，两个细胞被募集为初级细胞，它们迅速包围相互连接的光感受器束，形成稳定的连接。未分化的 intero 材料细胞在原代包裹和密封时以杂乱无章的模式存在。每个光感受器束局部细胞运动都重组。

初始细胞分组在每个 oma 的背侧和腹侧。单元格间嵌入将单元格从两行重新排列为一行。插层后，在显微镜下捕捉三级竞争。

竞争细胞在置换前占据了三级生态位 5 到 10 分钟。最终，单个细胞建立了稳定的三级生态位。在最终修剪过程中，细胞凋亡的激增将 ICS 的数量减少到在复眼中有效生成进入材料细胞晶格所需的最低限度。

一旦掌握，如果作正确，可以在 4 小时内完成 PPE 的成像。后续图像处理大约需要 1 小时。