Name: 荧光淬一个脂质体包封的近红外荧光团的作为一个工具在体内光学成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习制备可激活脂质体用于体内炎症高灵敏度近红外荧光成像的方法。该技术通过磷脂水合与染料包封，实现荧光淬灭与激活调控，为生物医学成像提供新工具。

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本工作由以下机构资助： 德国研究基金会资助项目 HI-698/10-1 和 RU-1652/1-1。感谢 Doreen May 提供出色的技术协助，以及感谢德国耶拿 DYOMICS GmbH 公司的大力支持。

注意：所有操作均经地区动物伦理委员会批准，并符合国际关于动物伦理使用的指南。
1. 材料与仪器的准备
<ol>
	<li>自组装囊泡分散液（SFV）的制备
	<ol>
		<li>将以下磷脂溶解并配制成氯仿中的储备液：214 mg/ml 卵磷脂酰胆碱（EPC）、134 mg/ml 胆固醇、122 mg/ml 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（mPEG2000-DSPE）和 2 mg/ml 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐）（NBD-DOPE），储存于玻璃小瓶中。</li>
		<li>在圆底烧瓶中加入约 3 ml 氯仿，然后转移适量的磷脂储备液至该烧瓶中，以制备摩尔比为 EPC:Chol:mPEG2000-DSPE = 6.5:3:0.5 的脂质体。如需对脂质体进行双荧光标记，则在脂质溶液中加入 0.3 mol% 的 NBD-DOPE。</li>
		<li>使用旋转蒸发仪在减压（300 mbar）和 55 °C 条件下蒸发除去有机磷脂溶液中的氯仿。</li>
		<li>待形成均匀的磷脂薄膜后，进一步将压力降至 10 mbar，持续 1–2 小时，以去除残留的氯仿沉积物。</li>
		<li>在氯仿蒸发过程中，将 DY-676-COOH（6.181 µM）溶解于 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）中，并用液氮填充杜瓦瓶。开启超声水浴并设定温度为 50 °C。</li>
		<li>取适量（0.5–1 ml）DY-676-COOH（6.181 µM）溶液加入圆底烧瓶中，以水合干燥的磷脂膜，剧烈涡旋直至形成自组装囊泡（SFV）分散液。确保所有磷脂均被充分分散，避免脂质损失。</li>
		<li>小心将含有 SFV 分散液的圆底烧瓶浸入液氮中，冷冻 3–5 分钟。随后将烧瓶置于 50 °C 超声水浴中解冻，再剧烈涡旋 1–2 分钟。重复此过程六次，共完成七次冻融循环。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SFV 挤出以形成均一脂质体囊泡
	<ol>
		<li>将 SFV 分散液转移至 1 ml 注射器（注射器-a）中，使用 LiposoFast-Basic 挤出装置通过 100 nm 聚碳酸酯膜将其挤出至另一注射器（注射器-b）中。</li>
		<li>将分散液从注射器-b 反向挤回注射器-a，重复该循环十次。随着挤出过程进行，注射器内溶液逐渐由浑浊变为澄清。完成十次循环（即二十次单向挤出）后，取下注射器-b，最后一次将分散液从注射器-a 直接挤出至无菌 1.5 ml 反应管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化脂质体包封的 DY-676-COOH，去除游离染料
	<ol>
		<li>使用浸泡在 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）中的 G25 凝胶填料制备凝胶层析柱（柱长 28 cm，直径 0.8 cm）。</li>
		<li>将 0.5 ml 挤出后的囊泡分散液加至凝胶床顶部，使样品渗入凝胶基质中。</li>
		<li>用 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）洗脱脂质体（图 1A），并持续洗涤层析柱直至游离染料完全流出。如有需要，可根据生产商说明书通过脱盐和脱水方法回收游离染料。</li>
		<li>通过超速离心（200,000 × g，8 °C 下 2 小时）浓缩洗脱得到的脂质体，然后将其重新分散于适量无菌 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定包封的 DY-676-COOH 浓度
	<ol>
		<li>通过将 DY-676-COOH 溶解于含 0.1% Triton X100 的 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）中，配制标准浓度系列（0、82、124、247、494、988 nM），绘制标准曲线。</li>
		<li>取 2 µl 脂质体样品（终脂浓度为 100 nmol，来自 50 mmol/L 储备液），加入含 1% Triton X100 的 100 µl Tris 缓冲液中，室温孵育 5 分钟以破坏囊泡并释放包封的染料。随后用 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）稀释样品，使 Triton X100 的终浓度为 0.1%（v/v），总体积为 1 ml。所有样品均需设复孔。</li>
		<li>在激发波长 λ=645 nm、发射波长 λ=700 nm 条件下测定所有样品（游离 DY-676-COOH 和经 Triton X100 处理的脂质体）的吸收值和荧光发射值。利用游离染料的标准曲线确定包封染料的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质体表征
	<ol>
		<li>采用动态光散射法测定脂质体的粒径和Zeta电位。将脂质体样品用经滤膜除菌（0.2 µm）的 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）稀释至脂质浓度为 100–300 µM。将稀释后的样品转移至低体积一次性比色皿中，按照仪器制造商的操作说明进行测量。</li>
		<li>根据标准操作流程，通过电子显微镜对脂质体进行表征，以验证其粒径、完整性和均一性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 验证制备脂质体的荧光淬灭与激活
<ol>
	<li>荧光猝灭与激活的理化分析
	<ol>
		<li>准备两个1.5 ml离心管用于Lip-Q，另准备两个离心管用于游离的DY-676-COOH。将总共100 nmol脂质（2.38 µl浓度为42 mmol/L的Lip-Q储备液，其中包含138 µg/ml包封的DY-676-COOH）转移至相应离心管中。向另一组离心管中加入与Lip-Q所含染料量相当的游离DY-676-COOH（0.38 µg，例如由138 µg/1,000 µl × 2.38 µl Lip-Q计算得出）。将每种探针的一个离心管在4 °C孵育，另一个离心管于-80 °C冷冻过夜（16 hr）。</li>
		<li>将加热块升温至 30 °C。用碎冰填充冷却盒，并将一份 10 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）平衡至室温。</li>
		<li>从4 °C取出探针，室温下避光平衡（用铝箔包裹），并将-80 °C保存的探针在30 °C快速解冻5分钟。解冻后立即将探针置于冰上冷却1分钟，随后转移至室温（同样用铝箔包裹以避光）。</li>
		<li>向各探针中加入10 mM Tris缓冲液（pH 7.4），使终体积为100 µl，室温平衡10分钟。</li>
		<li>将每种探针各80 µl移取至低体积玻璃比色皿中，使用分光光度计在400–900 nm范围内测定各探针的吸光度。测定后将探针回收至相应的离心管中。</li>
		<li>将每种探针各80 µl转移至合适的玻璃比色皿中，在荧光分光光度计上以674 nm激发，测量694–800 nm范围内的荧光发射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞摄取与荧光激活
	<ol>
		<li>在标准条件下（37 °C，5% CO₂），使用相应的培养基获取并培养以下细胞系2 以及95％的加湿空气环境）。此处使用小鼠巨噬细胞系J774A.1（DMEM培养基，添加10%（v/v）胎牛血清）、人胶质母细胞瘤细胞系U-118MG（MEM培养基，含必需维生素和10%（v/v）胎牛血清）和人纤维肉瘤细胞系HT-1080（RPMI培养基，含5% FCS）。</li>
		<li>用多聚-L-赖氨酸包被8孔腔室载玻片（每孔加入100 µl 0.001% 多聚-L-赖氨酸，37 °C孵育10分钟。吸除溶液，将腔室载玻片置于无菌操作台中室温干燥至少4小时。用200 µl Hanks平衡盐溶液洗涤腔室载玻片3次，然后用石蜡和铝箔密封，4 °C保存备用。</li>
		<li>在培养腔室载玻片干燥的同时，对脂质体和染料溶液进行过滤除菌，并于4 °C保存备用。</li>
		<li>用于全身体内探针摄取分析 体内 近红外荧光成像系统，为每种3种测试细胞系各准备5个小型培养瓶（共15个培养瓶）。每瓶接种2 × 106 将 J774A.1、U-118MG 和 HT-1080 细胞以每培养瓶 5 ml 培养基接种于培养瓶中（设五个重复），培养 16–24 小时。同时，将每种细胞系（J774A.1 和 HT-1080 细胞各 30,000 个，U-118MG 细胞 20,000 个）分别接种至腔室载玻片的两个孔中，每孔加入 500 µl 培养基，培养 16–24 小时。</li>
		<li>第二天，向每种细胞系的2个培养瓶以及腔室载玻片上每种细胞系的1个孔中加入100 nmol（终浓度脂质总量）的Lip-Q。立即将每种细胞系的1个培养瓶转移至4 °C，另一个培养瓶放回培养箱。 
		注意：加入培养瓶和腔室载玻片的探针体积相同，因此腔室载玻片中的探针浓度高出10倍（5 ml 对比 500 µl培养基）。这是必要的，因为显微检测的灵敏度低于近红外荧光成像系统，后者用于对培养瓶中的细胞沉淀进行成像。</li>
		<li>将游离的 DY-676-COOH 以相当于 Lip-Q 中染料含量的浓度加入每种细胞系的 2 个培养瓶以及腔室载玻片的每种细胞系的 1 个孔中，随后立即将每种细胞系的 1 个培养瓶转移至 4 °C（能量耗竭条件），另一培养瓶连同腔室载玻片放回培养箱。在相应条件下培养所有细胞 24 小时。未加探针的培养瓶中的细胞作为未处理对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>近红外荧光成像与半定量分析
	<ol>
		<li>孵育24小时后，用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞2次，刮取细胞于500 µl HBSS中，于500 µl离心管中以200 × g离心5分钟，收集细胞。</li>
		<li>将含有细胞沉淀（及HBSS）的试管放入近红外荧光（NIRF）成像仪中，使用激发光滤光片（615–665 nm）和发射光滤光片（截止波长 &#62;700 nm</li>
		<li>扣除自发荧光，并根据制造商说明书评估目标信号与自发荧光的强度。这将提供荧光强度的半定量水平，以平均信号（缩放计数/秒）表示，该值为经曝光时间、相机增益、像素合并和位深度校正后的计数水平，从而使各测量值之间具有可比性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦显微镜分析
	<ol>
		<li>孵育24小时后，用500 µl HBSS洗涤细胞2次，收集培养板上的细胞。</li>
		<li>用 200 µl 含 3.7% (v/v) 甲醛的 HBSS 在室温下固定细胞 30 分钟。</li>
		<li>固定过程中，用封片液将DNA染料Hoechst-33258按1:50比例稀释。</li>
		<li>固定后，用 HBSS 洗涤细胞 2 次，然后将小室从玻片上分离。在每个对应于小室孔位的区域加入 50 µl 含 DNA 染料的封片液。用盖玻片覆盖细胞，边缘用透明指甲油封固，在室温避光条件下空气干燥 10 分钟。</li>
		<li>在合适的荧光显微镜或共聚焦显微镜上观察细胞。使用以下激发和发射参数以检测相应组分：细胞核（Hoechst-33258：激发 405 nm，发射 420–480 nm）；NBD-DOPE（脂质体脂质：激发 488 nm，发射 530 nm）；DY-676-COOH（近红外荧光染料：激发 633–645 nm，发射 650–700 nm）。 
		注意：确保可用的荧光显微镜配备有合适的滤光片，能够支持激发和发射波长大于630 nm的荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

3. 基于脂质体的 在体 内 炎症的荧光成像
<ol>
	<li>动物与材料的准备
	<ol>
		<li>在标准条件下饲养约8至12周龄、体重约36 g的雄性NMRI小鼠，自由摄食和饮水。</li>
		<li>实验开始前7天，给所有小鼠喂食低脱镁叶绿酸饮食，以降低组织自发荧光。</li>
		<li>二十四&#160;每次实验开始前数小时，剃除小鼠目标区域的毛发（例如， 如果需要成像后肢水肿，应包括整个背部区域。</li>
		<li>称重动物，并计算每只小鼠所需注射的探针剂量（Lip-Q 和 Lip-dQ 按每公斤体重 10 µmol（脂质浓度）给药，游离 DY-676-COOH 剂量与 Lip-Q 中所用染料含量相当）。</li>
		<li>使用与细胞团块成像相同的设置，通过全身近红外荧光成像仪对动物进行成像。该测量可提供动物的自发荧光信号。</li>
		<li>将10 mg酵母聚糖-A溶解于1 ml等渗盐溶液中，4 °C下保存过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导炎症和 体内 近红外荧光成像
	<ol>
		<li>每只小鼠准备3支注射器，分别装有以下溶液。第一支注射器加入50 µl酵母聚糖A溶液（10 mg/ml），第二支注射器加入50 µl等渗生理盐水溶液。第三支注射器装入探针溶液，其中Lip-Q和Lip-dQ（10 µmol/kg体重（脂质））用于实验动物，游离DY-676-COOH（浓度与Lip-Q相同）用于对照动物。确保探针用无菌HBSS稀释至终体积150 µl。</li>
		<li>在动物眼部涂抹眼霜以防止干燥，并使用2%异氟烷麻醉动物，直至其进入深度睡眠状态，在触碰足部时无反应（此过程约需2分钟）。</li>
		<li>将小鼠置于加热垫上（仍处于麻醉状态），在右侧后肢皮下注射酵母聚糖-A溶液，左侧后肢皮下注射生理盐水。立即通过静脉注射探针，随后对动物进行成像，并记录注射/测量时间（设为 t = 0 小时）。将获得的图像保存为图像立方体，并对所有其他动物及相应探针重复上述步骤。</li>
		<li>注射后每2小时成像一次，持续10小时，然后在24小时时再次成像，确保测量室载物台保持温暖（例如，在其下方放置加热垫），以避免动物低体温。每次测量后，将动物放回含有食物和水的笼具中 随意 并将笼子放入温度适宜的动物饲养室。&#160; 先使用2%异氟烷麻醉动物，直至其对触碰无反应，随后用二氧化碳实施安乐死，持续5-10分钟，确保动物完全停止呼吸并出现尸僵。&#160;</li>
		<li>根据标准方案解剖小鼠，相关方案可在线获取（http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/），并对器官进行成像。</li>
		<li>根据制造商说明书评估测量结果，首先对动物整体荧光信号进行解混（unmixing），然后划定自体荧光区域（左后肢注射生理盐水）和炎症区域的目标荧光区域（右后肢注射zymosan-A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于脂质体也可作为荧光染料的递送系统，因此可用于靶向疾病的成像。将高浓度的荧光染料（如本研究中使用的近红外荧光染料 DY676-COOH）包封于脂质体内，会导致所包埋染料的荧光发生强烈淬灭。荧光淬灭是多种荧光团在高浓度条件下常见的现象，该特性可在多个方面加以利用 体内 成像应用，其中要求对目标区域具有高灵敏度和可靠的检测能力。使用脂质体还可保护染料，这对于 体内 应用
薄膜水化与挤出技术是一种广泛应用的方法，可根据需要成功制备不同粒径范围的脂质体，并可实现多种修饰，例如包载多种不同的物质25。因此，该方法适用于制备包载近红外荧光染料DY-676-COOH用于成像的脂质体。该方法所得脂质体的囊内染料浓度为600–840 µM，处于该染料的荧光淬灭浓度范围内。用于均质化自组装囊泡分散液的LiposoFast-Basic手动挤出器，由于其装置兼容最大1 ml体积的注射器，适合在小规模实验室中制备脂质体。对于大规模制备，建议使用更大的高压均质器，其可处理每小时高达1,000 L的囊泡分散液。凝胶过滤（尺寸排阻）色谱是一个关键步骤，可...

脂质体已被广泛研究，是临床应用中最具有生物相容性的生物医学药物递送系统之一1,2它们主要由磷脂和胆固醇组成，这两种成分均为生物相容性化合物，可模拟天然细胞膜的部分结构。亲水性物质可被包封在脂质体的水相内部，而疏水性物质则可嵌入脂质体的磷脂双分子层中。3将物质包封于脂质体的水相内腔中可使其免受降解 体内 同时可防止治疗疾病所用的细胞毒性药物（如旨在破坏肿瘤细胞的化疗药物）对宿主系统产生毒性作用。通过聚乙二醇（PEGylation）等聚合物修饰脂质体表面，可进一步延长脂质体在血液中的循环时间 体内 由于空间位阻稳定作用4此外，脂质体能够包封高浓度的多种物质，例如蛋白质5,6，亲水性物质7,8 和酶9因此，它们可作为可靠的临床治疗和诊断工具，值得被批准用于递送阿霉素等细胞毒性药物以进行癌症治疗4由于其具有良好的柔韧性，脂质体还可负载荧光染料，用于诊断及影像引导手术。
荧光成像提供了一种经济且非侵入性的体内诊断工具，但其应用需满足一些基本要求。研究表明，最适合用于体内成像的荧光染料，其特征吸收和发射峰值应位于光散射和组织自体荧光（主要来源于水和血红蛋白）较低的波长范围内。因此，这类探针的吸收/发射最大值通常处于650至900 nm之间10。此外，荧光染料在体外和体内的稳定性至关重要，因为调理作用及快速清除会显著限制其在体内成像中的应用11。其他不利因素，如稳定性差、灵敏度低，或像吲哚菁绿（ICG）所表现出的对靶器官的细胞毒性效应12-16，在设计用于体内成像的探针时也必须予以充分考虑。基于上述发现，目前已有多种临床前近红外（NIR）荧光染料、纳米颗粒以及新技术被积极开发，用于炎症过程、癌症的体内成像以及图像引导手术17-20。尽管大多数临床前近红外荧光（NIRF）染料在体外具有良好的稳定性，但其在体内经肝脏和肾脏的快速灌注与清除仍阻碍了其在疾病及炎症过程的体内光学成像中的广泛应用。
因此，我们提出了一种将荧光染料（如已被充分表征的近红外荧光染料 DY-676-COOH）包封于脂质体中的实验方案。该染料在相对较高浓度下易发生自猝灭21。当浓度较高时，位于彼此 Förster 半径范围内的荧光分子之间会形成 H-二聚体和/或 π-堆积相互作用，从而导致荧光染料分子间发生 Förster 共振能量转移（FRET）。而在低浓度下，荧光分子之间的距离增大，从而阻止了 π-堆积相互作用和 H-二聚体的形成，产生强烈的荧光发射。在高浓度与低浓度之间切换，并伴随荧光的猝灭与激活，是一种可用于光学成像的有前景的策略22。在这方面，将高浓度的近红外荧光染料 DY-676-COOH 包封于脂质体的水相内腔，相较于游离染料，更有利于in vivo成像。该方法的挑战首先在于实现正确的包封，其次在于验证高浓度染料包封所带来的优势。比较猝灭型脂质体、游离染料以及低染料浓度的非猝灭型脂质体制剂的成像特性，是必不可少的步骤。我们通过一种简单但高效的薄膜水化与挤出法，结合反复冻融循环，证明了将处于猝灭浓度的 DY-676-COOH 包封于脂质体中是可行的。其他用于制备脂质体的方法，如逆相蒸发法23和乙醇注射法24，也能实现多种亲水性物质的高包封效率。然而，待包封物质的性质可能影响其包封效率。实际上，本文所介绍的薄膜水化与挤出法在 DY-676-COOH 的包封中表现出最高的效率。为了说明 DY-676-COOH 脂质体包封的优势，我们采用了酵母多糖诱导的水肿模型，该模型可在数小时内研究炎症过程。在此模型中，我们证明了与游离染料或低染料浓度的非猝灭型脂质体制剂相比，包封了高浓度 DY-676-COOH 的脂质体更适用于全身in vivo光学成像以检测炎症过程。因此，本实验方案提供了一种简单快速的方法，用于制备猝灭型荧光脂质体，并验证其在in vitro和in vivo条件下的激活能力与成像潜力。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;制备脂质体的材料与设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>卵磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051P</td><td>溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（214 mg/ml）</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（134 mg/ml）</td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（122 mg/ml）</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（2 mg/ml）</td></tr><tr><td>Sartorius MC1（d = 0.01 mg）</td><td>Sartorius AG</td><td>Research RC 210 P</td><td>用于称量磷脂</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>用于磷脂膜的水合</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>用于磷脂膜的水合</td></tr><tr><td>真空控制器</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>用于磷脂膜的水合</td></tr><tr><td>真空箱</td><td>B&amp;uuml;chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>用于磷脂膜的水合</td></tr><tr><td>循环冷却器</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER&lt;br/&gt; GMBH &amp;amp; CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>用于磷脂膜的水合</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>溶于10 mM Tris中，储备液保存于-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>Applichem</td><td>A1086</td><td>10 mM缓冲液，pH 7.4</td></tr><tr><td>三氯甲烷</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>用于脂质体制备</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>用于脂质体制备</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2（Pop-off Cup，编号146-3011-00）</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>用于脂质体制备</td></tr><tr><td>Sephadex G25 medium&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>用于脂质体纯化</td></tr><tr><td>曲拉通X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>用于破坏脂质体以进行染料定量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>用于脂质体挤出</td></tr><tr><td>聚碳酸酯滤膜，100 nm（Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane，NUCLEPR PC 19 MM，0.1 U）</td><td>VWR</td><td></td><td>用于通过LiposoFast-Basic进行脂质体挤出</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>用于染料定量</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>用于测定脂质体粒径和Zeta电位</td></tr><tr><td>超速离心机&amp;nbsp;</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>用于样品浓缩</td></tr><tr><td>转子</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>用于样品浓缩</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;脂质体评估与光学成像的材料与设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>酿酒酵母来源的Zymosan-A</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>用于诱导炎症</td></tr><tr><td>等渗盐水（0.9%）</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>用于稀释Zymosan-A</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>用于动物麻醉</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Actavis GmbH&amp;nbsp;</td><td>PZN-7253744</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>用于在麻醉期间保持动物体温</td></tr><tr><td>Omnican-F（1 ml注射器）&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>用于探针的皮下和静脉给药</td></tr><tr><td>泛醇眼霜</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>用于防止动物在麻醉期间眼睛干燥</td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>不含Mg²⁺、Ca²⁺和酚红，用于探针稀释和细胞洗涤</td></tr><tr><td>8孔细胞培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>用于细胞培养后显微镜观察&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养基</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（0.01%，50&amp;nbsp;ml）</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>用于包被细胞培养板</td></tr><tr><td>封片剂Permafluor</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>S21022-3</td><td>显微镜封片液</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>AppliChem</td><td></td><td>显微镜DNA染色剂</td></tr><tr><td>Hera-Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>用于细胞培养的无菌操作台</td></tr><tr><td>HERA cell</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>用于细胞培养的培养箱</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于共聚焦显微镜成像</td></tr><tr><td>Maestro-TM活体荧光成像系统</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>用于小型动物全身荧光成像</td></tr><tr><td>分光光度计（Ultrospec 4300 pro UV）</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>用于吸光度测定</td></tr><tr><td>荧光分光光度计（Jasco FP-6200）</td><td>Jasco</td><td></td><td>用于荧光发射测定</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;动物&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NMRI小鼠（8-12周龄，雄性）</td><td>Elevage Janvier, 法国</td><td></td><td>用于炎症实验</td></tr></tbody></table>

一种近红外荧光染料的脂质体包封型荧光淬灭技术作为工具 体内 光学成像

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

光学成像提供了多种诊断方式，作为生物医学成像工具已引起广泛关注。尽管目前已有大量成像技术且仪器设备不断进步，但仍需要高灵敏度的探针用于体内成像。现有临床前荧光探针的一个典型问题是其在体内快速被清除，从而降低了成像灵敏度。为克服快速清除问题，增加靶部位的染料分子数量，并由此降低背景自发荧光，本研究将近红外荧光染料DY-676-COOH封装于脂质体中，并验证其用于体内炎症成像的潜力。已知DY-676在高浓度下具有自猝灭特性。我们首先确定了适合自猝灭的浓度，然后将该猝灭浓度的染料封装到聚乙二醇化（PEGylated）脂质体的水相内腔中。为了验证脂质体的猝灭与激活潜力，我们采用一种强烈的冷冻方法，该方法可破坏脂质体膜结构而不影响所封装的染料。具有高度荧光猝灭特性的脂质体被命名为Lip-Q。通过多种细胞系的实验，我们证明Lip-Q主要通过吞噬作用被细胞摄取，这一机制进而支持其作为工具用于小鼠模型中体内炎症成像的潜力。此外，我们采用酵母多糖诱导的小鼠水肿模型，进一步验证Lip-Q在体内光学炎症成像中的应用潜力。考虑到炎症引起的增强渗透性和滞留效应（EPR）可能导致探针摄取，我们在动物实验中将一种始终发光的脂质体配方（含低浓度、非猝灭型DY-676-COOH，称为Lip-dQ）以及游离的DY-676-COOH与Lip-Q进行了比较。

高浓度荧光染料（如本文所用的近红外荧光染料 DY676-COOH）包封于脂质体的水相内腔时，会导致强烈的荧光淬灭。荧光淬灭是多种荧光团在高浓度条件下常见的现象，该特性可在多个方面加以利用 体内 成像应用中，当需要高灵敏度和对目标区域的可靠检测时，脂质体的使用还可保护染料，这对于 体内 应用。对脂质体进行充分表征十分必要，包括多个因素，如包封染料的水平、脂质体的稳定性与粒径、荧光猝灭以及包封染料的活性。 体外 以及适用性 体内 成像目的。因此，游离染料 DY-676-COOH、淬灭脂质体（Lip-Q）以及包封染料浓度极低的非淬灭脂质体（Lip-dQ）之间的比较尤为关键，特别是对于 在体内 表征
采用薄膜水化与挤出法制备脂质体，并在挤出前进行多次冻融循环，此类脂质体中仍含有未结合的游离染料分子。由于游离染料在凝胶过滤介质中的保留时间较长，而脂质体洗脱较快，因此可通过凝胶过滤有效分离游离染料与脂质体（图1B）。根据凝胶过滤后的稀释程度，可选择性地进行超速离心步骤，以...

使用荧光染料进行 体内 成像效果可能因调理作用、快速清除、检测灵敏度低以及对宿主的细胞毒性效应而受到显著限制。通过薄膜水化与挤出法将荧光染料封装于脂质体中，可实现荧光淬灭与保护，从而提高成像性能 体内 具有高检测灵敏度的成像

光学成像提供了多种诊断方式，作为一种生物医学成像工具，已引起广泛关注。尽管其存在巨大的……

本实验的总体目标是制备一种活化脂质体，以实现对体内炎症的高灵敏度成像。该目标首先通过制备由磷脂组成的脂质膜来实现，随后在第二步中，将磷脂膜用近红外荧光染料的淬灭浓度溶液水化，从而自发形成囊泡。自发形成的囊泡（SFV）被挤出以确保脂质体囊泡的均一性，随后将脂质体与未包封的残留染料分子分离纯化。最终，通过吸收光谱和荧光发射的光谱测量，显示染料在体内包封状态下的荧光淬灭情况。近红外荧光成像则用于展示脂质体在炎症过程成像中的应用潜力。该技术相较于其他现有技术的主要优势在于，我们可以在造影剂被细胞内化后直接测定信号。这意味着信号在细胞内被激活，因此所检测到的信号完全来源于细胞内部。该技术的应用前景涵盖癌症的诊断与治疗。由于吞噬细胞（如肿瘤相关巨噬细胞）可摄取并在肿瘤内降解脂质体，从而释放治疗药物或成像探针。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为包封效率受到所用DAI的性质以及水合过程效率的影响。要开始自发形成的囊泡分散体系，首先向圆底烧瓶中加入约三毫升氯仿，随后加入适当体积的新鲜配制的磷脂储备溶液，其摩尔比为6.5:3:0.5，用于脂质体的双荧光标记。接下来，向脂质溶液中加入0.3摩尔百分比的N-B-D-D-O-P-E。然后使用旋转蒸发仪在减压条件下（300 毫巴，55 摄氏度）蒸发有机磷脂溶液中的氯仿。待形成均匀的磷脂膜后，继续将压力降至 10 毫巴，维持一至两小时，以去除残留的氯仿沉积物。溶解荧光染料羧酸，配制所需缓冲液，并用液氮填充杜瓦瓶。然后开启设定为 50 摄氏度的超声水浴。接着将适量的染料羧酸转移至圆底烧瓶中，以水合干燥的磷脂薄膜，并剧烈涡旋振荡烧瓶，直至自发形成囊泡分散液，确保所有磷脂均被充分分散，以避免脂质损失。随后，小心地将含有 SFV 分散液的圆底烧瓶置于液氮中冷冻。三到五分钟之后，将烧瓶放入超声浴中以解冻分散液，并剧烈涡旋烧瓶一到两分钟。接下来，为促进形成均一的囊泡，将SFV分散液吸入一支1毫升注射器中，然后使用Lipo Sofas基础挤出装置将其通过一个100纳米聚碳酸酯膜挤入第二支1毫升注射器中。再将分散液反向挤回第一支注射器，重复转移10次。溶液应从浑浊状态变为澄清的分散液。完成第10次挤出循环后，取下第二个注射器，将分散液最后一次直接挤入无菌的1.5毫升离心管中。随后，将0.5毫升挤出的囊泡分散液转移至装有经Tris缓冲液浸泡的G 25凝胶珠的28厘米凝胶层析柱的凝胶床上，并让样品流入凝胶基质中。用Tris缓冲液洗脱脂质体，并收集脂质体组分，直至脂质体完全流出。然后通过超速离心浓缩洗脱的脂质体，并将其重新分散于适量的无菌Tris缓冲液中。脂质体的电子显微镜照片应显示脂质体囊泡主要呈未融合的形态，以分析脂质体的荧光淬灭和激活能力。接下来，将总共100纳摩尔的相应脂质分别转移至两个1.5毫升微量离心管中。然后将相当于染料Q中染料含量的游离二羧酸转移至另一个1.5毫升离心管中，并将每种探针的一管样品置于4摄氏度、另一管置于负80摄氏度下孵育。次日早晨，将加热块预热至30摄氏度。用碎冰填充冷却盒，并将一份三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris缓冲液）平衡至室温。接下来，将探针从负80摄氏度冰箱中取出，在30摄氏度下快速解冻5分钟，同时将另一组探针从4摄氏度平衡至室温5分钟。然后将所有探针置于冰上冷却1分钟，再转移回室温。现在向每个探针中加入Tris缓冲液，使最终体积达到100 µL。然后在室温下再孵育10分钟，用移液器将每种探针各80 µL转移至低体积玻璃比色皿中，在分光光度计上测定400至900纳米范围内的吸收光谱。将探针回收至对应的离心管中，再将每种探针各80 µL转移至合适的玻璃比色皿中。使用光谱荧光计测定荧光发射，激发波长为674纳米，检测694至800纳米范围内的荧光信号。为了评估脂质体的炎症检测性能，取一支注射器加入50 µL的xon a溶液，另取一支注射器加入50 µL等渗生理盐水溶液，再取一支注射器加入实验探针溶液，均用HBSS稀释至终体积为150 µL。通过脚趾夹捏确认动物已麻醉后，在实验动物眼部涂抹眼霜，然后将小鼠置于加热垫上。将xon a溶液在动物右后肢皮下注射，生理盐水溶液在左后肢皮下注射。然后立即静脉注射探针，并对动物进行成像。最后，将获得的图像保存为图像立方体。在注射后每2小时对动物成像一次，持续10小时，然后在24小时时再次成像。脂质体探针显示，吞噬性摄取占主导地位，且该过程可被能量耗竭所抑制，这一点可通过高吞噬活性的巨噬细胞系和低吞噬活性的人胶质母细胞瘤细胞系对脂质体Q（lip Q）的摄取情况观察到。与体外培养细胞系中观察到的吞噬性摄取一致，静脉注射LIP Q后，在小鼠模型中可观察到水肿区域荧光强度随时间依赖性增加，背景荧光极低，注射后8至10小时达到最大荧光强度。相比之下，游离羧酸或始终处于激活状态的脂质体Lip DQ给药后，整个动物体显示出较强的近红外荧光。注射后0至4小时内，游离羧酸快速灌注并被清除，干扰了成像过程，导致无法可靠地检测水肿区域。此外，非淬灭脂质体脂 DQ 在注射后 2 至 4 小时内显示出水肿的最大荧光信号，并在八小时内基本保持稳定，随后以与淬灭脂质体相似的方式逐渐减弱。在探针给药 24 小时后处死小鼠，对其器官进行基于 Q 的水肿荧光成像，结果显示肝脏、胆囊和肾脏有轻微的离体荧光，而脾脏、肺和心脏的荧光信号极低甚至无信号，表明探针主要通过胆汁排泄途径被清除。在进行该操作时，需注意使用高浓度的荧光淬灭染料，并确保磷脂充分分散。观看本视频后，您应充分了解如何制备活化脂质体，以高灵敏度进行体内炎症成像。明白了吗？请务必注意，在科研中使用动物时，必须遵循国际指南，这意味着您需要申请在实验中使用动物，并获得当地伦理委员会的批准。

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生物工程

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