使用 plusTipTracker 软件测量微管动态 Xenopus laevis 生长锥

本实验的目的是利用 plus tip tracker 软件包，对微管正端追踪蛋白（或称正端动态）以及活体生长锥进行定量分析。本文描述了分析 EB1-GFP 动态及培养的 Xenopus laevis 生长锥图像的步骤，但该类似方案也可适用于其他细胞类型，前提是已获得标记 EB1 蛋白的高分辨率活细胞成像以及培养的胚胎生长锥图像。实验的第一步是使用命令“plus tip, get tracks”来检测 EB1-GFP 荧光团（comets），将这些荧光团连接成轨迹，并确定微管动态的各项参数。

第二步是使用命令加尖端 C 轨迹，在生长锥图像上叠加显示微管轨迹。最后一步是使用加尖端组分析，对多组视频中的微管轨迹参数进行分析和比较。该技术相较于现有方法（例如通过手动追踪分析单个加尖端轨迹）的主要优势在于，该方法能够实现快速、自动化的检测、追踪、可视化和分析。

图像分析的第一步是检测 EB1-GFP 斑点，将这些斑点连接成轨迹，并确定微管动态参数。这可通过“plus tip”命令实现。在进行图像分析之前获取轨迹。

将每个延时电影转换为一系列 TIFF 图像文件，并将每个序列保存在名为 images 的独立文件夹中。请注意，images 区分大小写。要开始分析，请打开 MATLAB 应用程序，并在命令窗口中输入 plus tip get tracks。

这将导致一个新对话框出现。单击“设置新项目”，并通过选择相应的图像文件夹来选择一个或多个先前的 TIFF 图像序列。完成此步骤后，将创建一个文件目录。

单击，好的。当第一幅图像显示后，使用鼠标单击并创建一个多边形，使其完全包围整个生长锥。

双击鼠标以闭合多边形。如果图像中存在另一个生长锥，将弹出对话框。如需分析，请选择“是”。

否则选择“否”。下一步是选择将立即进行分析的项目。点击“选择项目”并选择相应的文件夹。

要分析列表，请选择将出现的 gooey 界面。从屏幕左侧选择项目，并将其移至右侧。然后点击“确定”。

选择一个位置以保存项目列表，然后点击保存，选择检测、跟踪和后期处理。完成这些选择后，对话框的右侧将变为可配置状态。填写后期处理设置。

根据所需的特定图像采集设置，点击“开始”。软件将执行已输入的各个步骤。命令窗口会显示每个功能的预计剩余时间，并在步骤运行完毕后予以提示。

在定义微管轨迹后，使用“plus tip C tracks”功能对轨迹进行可视化，以将微管轨迹叠加显示在生长锥图像上。该操作可通过在命令窗口中输入命令“plus tip C tracks type plus tip C tracks”实现。对话框加载后，点击“select project”。

选择包含要可视化的项目的父目录，然后点击“选择文件夹”。窗口出现后，选择要可视化的文件并点击“确定”。接下来，点击“选择已保存的感兴趣区域（ROI）”，导航至与上一步所选目录相同的感兴趣区域文件夹，并选择名为 R-O-I-Y-X 的文件。

单击“选择输出目录”以指定 MATLAB 保存轨迹可视化文件的位置，然后选择“生成轨迹视频”。屏幕上将显示所有轨迹。加号端跟踪轨迹由加号端注释计算得出。

该步骤以视频格式保存轨迹时间序列。最后一步是创建视频组，用于分析和比较微管轨迹参数。此操作可通过命令“plus tip group analysis”实现。

当多个视频的 plus tip get tracks 分析已完成，且不同的数据子集已准备就绪可供比较时，在命令窗口中输入 plus tip group analysis，以手动选择要比较的组。首先在层级结构中取消选中“auto group”，然后点击“select projects”。

导航至包含所有 ROI 文件夹的上级目录。要分析列表，请选择 GUI 窗口将出现。从屏幕左侧选择要包含在组中的所有项目，并将其移至右侧。

单击，确定。然后选择一个位置来保存项目列表，单击“保存”，此时将出现一个窗口。单击。

好的，列表选择粘性窗口将显示。再次仅选择对应于应合并在一起的第一组的文件，然后单击“确定”。输入组名，然后单击“确定”。

窗口将出现，根据提示进行操作并继续选择分组。然后选择保存分组列表的位置，点击保存。点击“选择输出目录”以确定输出文件夹的存储位置。

最后，选择要进行的组分析类型。此处我们选择合并所有细胞和组的数据。点击“比较组”。

该图像展示了从 function plus tip git 轨迹获得的微管动力学参数。该视频演示了从 function plus tip C 轨迹获得的微管轨迹。最后，该图像显示了从 function plus tip group 分析获得的微管参数。

使用电子表格应用程序。通过不同组别的视频所获得的这些参数，也可以利用一种处理程序以箱线图形式进行分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 plus tip tracker，通过 plus tip git tracks、plus tip C tracks 和 plus tip group analysis 等功能，获取关于活体生长锥中微管正端动态及生长行为的定量信息。