Name: 使用plusTipTracker软件测量微管动力学非洲爪蟾生长锥 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习使用plusTipTracker软件分析非洲爪蟾生长锥中的微管动力学。该方法通过EB1-GFP彗星检测和轨迹追踪，实现微管末端追踪蛋白的自动化定量分析，为神经科学研究提供高效工具。

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我们感谢Gaudenz Danuser博士及其实验室成员开发了plusTipTracker软件，并就该软件的使用提供了有益的讨论，特别是Maria Bagonis和Sebastien Besson。我们特别感谢波士顿学院媒体中心在视频制作与编辑过程中提供的协助与支持。我们还感谢Lowery实验室成员提供的有益讨论和建设性批评，以及Abigail Antoine对手稿的校对。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）授予LAL的R00 MH095768项目资助。

本实验方案和视频旨在作为原始论文的配套材料，该论文更详细地描述了软件包4，同时也作为Danuser实验室网站上软件下载所附带的技术报告的补充。如果读者对软件的使用仍有其他疑问，建议仔细查阅这些文档。
1. 图像分析前的准备
<ol>
	<li>将每个延时电影转换为一系列 TIFF（标签图像文件格式）图像文件。如果某个电影中包含多个生长锥/细胞，首先裁剪每个生长锥/细胞，以创建各自独立的图像序列。 
	注意：此步骤并非必需，因为在 plusTipTracker 中可以选择单独的兴趣区域（ROI）。然而，使用较小的图像尺寸可提高计算处理速度，因此如果图像中存在大量空白区域，建议执行此步骤。</li>
	<li>将每个 TIFF 序列保存在其各自的文件夹中，该文件夹命名为“images”，并位于 MATLAB&#160;可访问的路径下（注意“images”区分大小写）。要添加新路径，请在“当前文件夹”窗口中导航至相关文件目录，右键单击目录图标，然后选择“添加到路径 – 所选文件夹及其子文件夹”。同样重要的是，必须将 plusTipTracker 软件文件夹也添加到路径中。</li>
</ol>
2. plusTipGetTracks
注意：图像分析的第一步是检测 EB1-GFP 斑点，将斑点连接成轨迹，并确定微管动力学的参数。此步骤通过命令“plusTipGetTracks”4 实现。
<ol>
	<li>开始分析时，打开 MATLAB&#160;应用程序，并在命令窗口中输入“plusTipGetTracks”。这将弹出一个新的对话框。</li>
	<li>点击“Set Up New Projects”，然后选择一个（或多个）先前的 TIFF 图像序列，方法是选择相应的“images”文件夹（或包含“images”文件夹的目录）。完成此步骤后，将在存放“images”文件夹的同一目录下创建一个文件目录（roi_1），用于存储后续的数据文件。注意：“Set Up New Projects”步骤可提前在另一个会话中完成。</li>
	<li>将出现一个新窗口：“Select a polygon, right-click on last point, and click on ‘Create Mask’”。点击“OK”。随后将显示所选图像序列的第一幅图像。使用鼠标点击并绘制一个多边形，使其完全覆盖整个生长锥。双击鼠标以闭合多边形。</li>
	<li>多边形闭合后，将弹出一个对话框：“Do you want to select another ROI?” 如果图像中还有其他需要分析的生长锥，请选择“是”；否则选择“否”。</li>
	<li>选择将立即进行分析的项目。点击“Select Projects”，然后选择要分析的文件夹（roi_X）。</li>
	<li>将出现一个 listSelectGUI 界面。从屏幕左侧选择项目，并将其移至屏幕右侧。点击“OK”。选择一个位置以保存项目列表，然后点击“Save”。</li>
	<li>选择“Detection”（检测）、“Tracking”（追踪）和“Post-Processing”（后处理）。完成这些选择后，对话框的右侧将变为可配置状态。请配置每一项选项。
	<ol>
		<li>这些参数用于将检测到的彗星状信号连接成微管（MT）轨迹。有关选择追踪控制参数的详细说明，请参见随软件包下载附带的技术报告 PDF 第 9–10 页；若遇到问题，请仔细阅读该报告。针对在 Xenopus laevis 生长锥中追踪 EB1-GFP 彗星状信号的目的，建议使用以下追踪设置：搜索半径范围（像素）5–12，最小子轨迹长度（帧数）3，最大间隙长度（帧数）8，最大收缩因子 0.8，最大前向角度 50，最大后向角度 10，波动半径 2.5。这些设置如图 1所示。</li>
	</ol>
	 
	注意：最大收缩因子被设定为减少检测到的“向后间隙”数量，因为在生长锥的分析背景下，“向后间隙”并无实际意义，且在拥挤条件下很可能导致轨迹连接错误。此外，最大前向角度和波动半径均设置得相对较高，因为生长锥中的微管除了生长和收缩外，还会发生频繁的小幅位移；提高这些控制参数可在连接步骤中更好地适应此类运动。
	<ol>
		<li>根据所需的特定图像采集条件填写后处理设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置配置完成后，点击“Start”（开始）。软件将运行所选的设置。所需时间可能从几分钟到数小时不等，具体取决于所选项目的数量及其大小。命令窗口将显示每个功能的预计剩余时间。当 plusTipGetTracks 步骤完成后，命令窗口将显示“Finished!”（完成！） 
	注意：该软件现已计算出一系列关于微管动态的详细参数（详见参考文献 4），但在分析生长锥中微管动态时，最有用的参数包括微管生长轨迹速度（微米/分钟）、生长轨迹寿命（秒）和生长轨迹长度（微米）。</li>
</ol>
3. plusTipSeeTracks
注意：现在微管轨迹已定义完毕，可使用“plustipSeeTracks”函数进行轨迹可视化4。该函数可提供多种可视化输出结果，包括空间微管动态图谱和速度视频，但此处仅聚焦于使用“Track Movies”（轨迹电影）功能，将微管轨迹叠加显示在生长锥图像上。虽然plusTipGetTracks可同时分析多个视频，plusTipSeeTracks一次只能分析一个视频。
<ol>
	<li>在命令窗口中输入“plusTipSeeTracks”。</li>
	<li>对话框加载完成后，点击“Select Project”。选择包含待可视化项目的父目录，然后点击“Select Folder”。新窗口将出现：“Select the project&#160;you want to visualize”。选择要可视化的文件，然后点击“OK”。</li>
	<li>接着点击“Select Saved ROI”。导航至与上一步所选相同的 roi_X 文件夹，并选择名为“roiYX”的文件。</li>
	<li>点击“Select Output Directory”以指定 MATLAB&#160;保存轨迹可视化文件的路径。注意：建议使用包含其余数据的同一文件夹。</li>
	<li>选择“Make Track Movie”，屏幕将显示由 +TIP comets 计算出的所有轨迹。此步骤会将追踪的时间序列以电影格式保存在文件“allTracks_X_X_X”中。可选择将电影保存为 AVI 格式，否则默认格式为 Quicktime .mov 文件。</li>
</ol>

4. plusTipGroupAnalysis
注意：此最终函数用于创建电影组，以分析和比较其微管轨迹参数。
<ol>
	<li>在命令窗口中输入“plusTipGroupAnalysis”。若要手动选择需比较的组，请先取消勾选“从层级结构自动分组”。然后点击“选择项目”。浏览至包含所有待分析 roi_X 文件夹的父目录。</li>
	<li>将出现一个 listSelectGUI 界面。在屏幕左侧选择所有要包含在分组中的项目，并将其移至屏幕右侧。点击“确定”。选择保存项目列表的位置，然后点击“保存”。</li>
	<li>将弹出一个窗口：“请从列表中选择第一组”。点击“确定”。listSelectGUI 窗口将再次显示。此次仅选择对应于第一个需合并组的文件。点击“确定”。</li>
	<li>然后输入组名称，点击“确定”。将弹出窗口：“是否选择另一组？”根据需要回答并继续选择组。随后将出现窗口：“请选择保存组列表的位置”。导航至目标位置并点击“保存”。</li>
	<li>点击“选择输出目录”，以指定输出文件夹的存储位置。</li>
	<li>选择要执行的分组分析类型——是将各组的微管（MT）轨迹合并分析，还是按单个细胞进行分析。推荐的统计检验方法已预先设定。若要在分析中包含所有轨迹，请取消勾选“移除视频开头/结尾的轨迹”；否则，勾选此项将删除在视频开始或结束时正在进行的任何微管生长轨迹。</li>
	<li>完成分组分析选择后，点击“比较组”。</li>
</ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li>
<li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality%3A+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li>
<li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).</li>
<li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li>
<li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li>
<li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413(2012).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li>
<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

PlusTipTracker 提供了一个简单直观的图形用户界面，能够快速自动检测细胞或生长锥中几乎所有可见的 EB1-GFP 斑点，将这些斑点连接成轨迹，并计算微管参数。其他文献已报道过类似软件的设计（例如，Marx et al. 也利用了对生长锥中标记 EB1 动态的定量分析18）。然而，该软件在易获取性方面具有独特优势，因为它可从专注于为细胞生物学领域开发开源、即用型软件的 Danuser 实验室网站免费下载。尽管使用该软件需要具备 MATLAB&#160;的访问权限，但用户无需完全熟悉该应用程序即可使用。不过，为了便于使用，仍有几点需要注意。
首先，初次使用该软件和计算机应用程序时，最常见的问题之一与文件路径有关。如果出现此错误（提示信息为“Error using cd – Argument must contain a string. Error in formatPath…”），最简单的解决方法是确保 plusTipTracker 软件以及包含所有“images”子目录的文件夹均位于同一“MATLAB”文件路径下。建议不要将这些文件...

本方法的目的是获取有关活体生长锥中微管（MT）正端追踪蛋白（+TIP）动态的定量信息。MT +TIP 是一类定位于微管正端的蛋白质9,10。它们具有多种功能，可调控微管动态不稳定性11的相关参数，包括聚合速率、灾变频率和恢复频率。分析微管动态的一种常用方法是追踪 +TIP 蛋白 EB1 的行为，EB1 可特异性结合正在生长的微管正端1,12。已知 EB1 能招募多种其他蛋白质至生长中的微管正端13,14，并且最近被确认为一种微管成熟因子15，可促进微管生长并增加灾变频率15,16。
许多关于生长锥内微管（MT）动态的研究采用手动追踪方法，随时间测量EB1-GFP动态的变化1-3，因为EB1在微管正端的定位可作为微管聚合的标志。利用EB1-GFP彗星状信号作为微管生长的替代指标，其关键优势在于即使在微管高度重叠的区域，也能测量微管动态。尽管手动追踪EB1-GFP彗星状信号的方法已为微管行为提供了有价值的见解1-3，但该方法耗时且可能存在偏倚。此外，由于异常的生长锥行为可能源于细胞骨架动态的微小变化，仅分析少量微管（手动追踪时通常不可避免）可能会遗漏重要信息。
因此，我们使用软件包 plusTipTracker 来测量微管全局动态参数4在获取培养的胚胎生长锥中标记EB1的高分辨率活体图像后5该软件由Danuser实验室开发，已用于多项研究，以表征不同类型细胞中微管（MT）的动力学行为。6-8它是一个开源的、用户友好的基于 MATLAB 的软件包，可用于荧光标记的 +TIPs 电影图像的自动检测、追踪、可视化和分析。该软件可计算微管动态的一系列具体参数（详见参考文献4），但在生长锥中分析微管动态时，最有用的参数包括微管生长轨迹速度（微米/分钟）、生长轨迹寿命（秒）和生长轨迹长度（微米）。该软件可直接从 Danuser 实验室网站（在“软件”栏目下）下载。尽管 Danuser 实验室目前支持一种更新的 +TIP 追踪分析界面，该界面已整合到名为 u-track 2.0 的软件包中，但原有的独立版本软件仍将继续提供。这两个程序的核心算法相同（至少截至2014年），仅在界面和分析输出形式上存在差异。对于缺乏 MATLAB 使用经验的新手用户&#160;和/或计算分析经验，plusTipTracker 还具备更友好的用户功能，包括自动化的统计参数输出。
本文描述了分析培养的Xenopus laevis生长锥中EB1-GFP动态图像的步骤。该方案已在近期一篇研究微管（MT）动态性的论文中使用17。有关表达EB1-GFP的生长锥培养的详细操作步骤，另请参见Lowery et al. 20125。尽管本论文主要聚焦于生长锥中EB1-GFP动态性的研究，但该方案同样适用于其他细胞类型17。对于所有细胞类型，为实现最佳的+TIP追踪，帧间时间间隔应控制在0.5–2秒&#160;之间。帧间间隔最长可达4秒，但时间间隔增加会导致更多的追踪误差。

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker 软件</td><td>Danuser Lab</td><td>&lt;a href=&quot;http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html&lt;/a&gt;</td><td>该软件未来可能会由其他网站托管。&amp;nbsp; 如果所列网站不存在，请在网页搜索引擎中搜索 &quot;Danuser Lab Software&quot; 以找到该网站。</td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>Mathworks</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 plustiptracker 软件测量微管动态 xenopus laevis 生长锥

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

微管（MT）正端追踪蛋白（+TIPs）定位于微管的生长正端，并调控微管动态1,2。在研究微管动态时，最著名且广泛应用的+TIP之一是末端结合蛋白EB1，它可结合所有正在生长的微管正端，因此可作为微管聚合的标志物1。以往许多关于生长锥中EB1行为的研究采用耗时且存在偏倚的计算机辅助手动追踪方法来分析单个微管1-3。我们的方法是在培养的胚胎生长锥中获取标记EB1的高分辨率活细胞图像后，利用软件包plusTipTracker4来量化微管动态的整体参数5。该软件是一个基于MATLAB的开源、用户友好的工具包，能够对荧光标记的+TIP动态影像实现自动检测、追踪、可视化和分析。本文介绍了在培养的Xenopus laevis生长锥中，使用plusTipTracker分析荧光标记的+TIP彗星状信号的实验方案。然而，该软件也可用于表征多种细胞类型中的微管动态6-8。

按照本文所述使用该软件，将获得多个文件，其中包含量化活细胞中 +TIP 动态的信息。
函数 plusTipGetTracks 可识别轨迹（使用 图1 中所示的示例设置），并提供有关 +TIP 轨迹的参数。要查看软件获取的信息，请进入在步骤 2.2 中创建的 roi_X 目录。“feat” 文件夹包含 “overlayImages”，这是一系列显示已检测到的彗星状信号的图像。使用图像分析软件检查这些图像可以验证彗星状信号检测的准确性。“meta” 文件夹还包含有关 +TIP 彗星状信号的详细统计信息，包括 “projData” 文件和 “Stats” 文件。要查看 “Stats” 文件，可将其拖入电子表格应用程序的空白工作表中。该文件包含针对每段视频计算出的微管参数（图2）。如上所述，该软件可计算大量微管动态特异性参数（详见参考文献4），包括微管生长轨迹速度（单位：微米/分钟）、生长轨迹持续时间（单位：秒）以及生长轨迹长度（单位：微米）。
函数 plusTipS...

基于 MATLAB 的开源软件包 plusTipTracker 可用于分析荧光标记的 +TIPs 图像序列，以量化微管动力学。

使用 plusTipTracker 软件测量微管动态 Xenopus laevis 生长锥

微管（MT）正端追踪蛋白（+TIPs）定位于微管正端的生长末端，并调控微管动态1,2。其中最为人熟知且研究最深入的之一是……

本实验的目的是利用 plus tip tracker 软件包，对微管正端追踪蛋白（或称正端动态）以及活体生长锥进行定量分析。本文描述了分析 EB1-GFP 动态及培养的 Xenopus laevis 生长锥图像的步骤，但该类似方案也可适用于其他细胞类型，前提是已获得标记 EB1 蛋白的高分辨率活细胞成像以及培养的胚胎生长锥图像。实验的第一步是使用命令“plus tip, get tracks”来检测 EB1-GFP 荧光团（comets），将这些荧光团连接成轨迹，并确定微管动态的各项参数。第二步是使用命令加尖端 C 轨迹，在生长锥图像上叠加显示微管轨迹。最后一步是使用加尖端组分析，对多组视频中的微管轨迹参数进行分析和比较。该技术相较于现有方法（例如通过手动追踪分析单个加尖端轨迹）的主要优势在于，该方法能够实现快速、自动化的检测、追踪、可视化和分析。图像分析的第一步是检测 EB1-GFP 斑点，将这些斑点连接成轨迹，并确定微管动态参数。这可通过“plus tip”命令实现。在进行图像分析之前获取轨迹。将每个延时电影转换为一系列 TIFF 图像文件，并将每个序列保存在名为 images 的独立文件夹中。请注意，images 区分大小写。要开始分析，请打开 MATLAB 应用程序，并在命令窗口中输入 plus tip get tracks。这将导致一个新对话框出现。单击“设置新项目”，并通过选择相应的图像文件夹来选择一个或多个先前的 TIFF 图像序列。完成此步骤后，将创建一个文件目录。单击，好的。当第一幅图像显示后，使用鼠标单击并创建一个多边形，使其完全包围整个生长锥。双击鼠标以闭合多边形。如果图像中存在另一个生长锥，将弹出对话框。如需分析，请选择“是”。否则选择“否”。下一步是选择将立即进行分析的项目。点击“选择项目”并选择相应的文件夹。要分析列表，请选择将出现的 gooey 界面。从屏幕左侧选择项目，并将其移至右侧。然后点击“确定”。选择一个位置以保存项目列表，然后点击保存，选择检测、跟踪和后期处理。完成这些选择后，对话框的右侧将变为可配置状态。填写后期处理设置。根据所需的特定图像采集设置，点击“开始”。软件将执行已输入的各个步骤。命令窗口会显示每个功能的预计剩余时间，并在步骤运行完毕后予以提示。在定义微管轨迹后，使用“plus tip C tracks”功能对轨迹进行可视化，以将微管轨迹叠加显示在生长锥图像上。该操作可通过在命令窗口中输入命令“plus tip C tracks type plus tip C tracks”实现。对话框加载后，点击“select project”。选择包含要可视化的项目的父目录，然后点击“选择文件夹”。窗口出现后，选择要可视化的文件并点击“确定”。接下来，点击“选择已保存的感兴趣区域（ROI）”，导航至与上一步所选目录相同的感兴趣区域文件夹，并选择名为 R-O-I-Y-X 的文件。单击“选择输出目录”以指定 MATLAB 保存轨迹可视化文件的位置，然后选择“生成轨迹视频”。屏幕上将显示所有轨迹。加号端跟踪轨迹由加号端注释计算得出。该步骤以视频格式保存轨迹时间序列。最后一步是创建视频组，用于分析和比较微管轨迹参数。此操作可通过命令“plus tip group analysis”实现。当多个视频的 plus tip get tracks 分析已完成，且不同的数据子集已准备就绪可供比较时，在命令窗口中输入 plus tip group analysis，以手动选择要比较的组。首先在层级结构中取消选中“auto group”，然后点击“select projects”。导航至包含所有 ROI 文件夹的上级目录。要分析列表，请选择 GUI 窗口将出现。从屏幕左侧选择要包含在组中的所有项目，并将其移至右侧。单击，确定。然后选择一个位置来保存项目列表，单击“保存”，此时将出现一个窗口。单击。好的，列表选择粘性窗口将显示。再次仅选择对应于应合并在一起的第一组的文件，然后单击“确定”。输入组名，然后单击“确定”。窗口将出现，根据提示进行操作并继续选择分组。然后选择保存分组列表的位置，点击保存。点击“选择输出目录”以确定输出文件夹的存储位置。最后，选择要进行的组分析类型。此处我们选择合并所有细胞和组的数据。点击“比较组”。该图像展示了从 function plus tip git 轨迹获得的微管动力学参数。该视频演示了从 function plus tip C 轨迹获得的微管轨迹。最后，该图像显示了从 function plus tip group 分析获得的微管参数。使用电子表格应用程序。通过不同组别的视频所获得的这些参数，也可以利用一种处理程序以箱线图形式进行分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 plus tip tracker，通过 plus tip git tracks、plus tip C tracks 和 plus tip group analysis 等功能，获取关于活体生长锥中微管正端动态及生长行为的定量信息。

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科研

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生物学

使用plusTipTracker软件测量微管动力学非洲爪蟾生长锥

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利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

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秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

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基于人原代皮肤成纤维细胞的亨廷顿病模型中微管正端动态可视化

本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。...

利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

为了前进，生长锥必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生依赖于肌动蛋白动态和离合器耦合。本研究描述了分析生长锥前进过程中肌动蛋白动态、离合器耦合以及牵引力的方法。...

生长锥前进过程中的肌动蛋白动力学、黏着耦合与牵引力分析

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

学习使用plusTipTracker软件分析非洲爪蟾生长锥中的微管动力学。该方法通过EB1-GFP彗星检测和轨迹追踪，实现微管末端追踪蛋白的自动化定量分析，为神经科学研究提供高效工具。

使用 plusTipTracker 软件测量微管动态 Xenopus laevis 生长锥

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