生产和目标单价量子点
2014年10月23日
我们提供了从确定长度的硫代磷酸酯 DNA 制备单价靶向量子点 （mQD） 的详细说明。DNA 包装的产量很高，因此，产物不需要纯化。我们展示了使用 SNAP 标签将 mQD 靶向细胞表面受体，用于活细胞成像应用。
该程序的总体目标是为制备用于活细胞中靶膜蛋白的单分子成像的单价量子点提供一种简单且通用的方案。这是通过首先将化学计量量的长多聚磷酸寡核苷酸配体引入量子点来实现的。长 DNA 完全包裹量子点并防止与第二个 DNA 分子结合，从而专门定量地生成单价量子点。分别。
制备 Benzo Guine 功能化、携带互补序列的 DNA，以靶向活细胞上表达的 snap 标记膜蛋白。接下来，用苯并 guine、DNA 连续处理表达卡扣标记膜蛋白的活细胞，然后用单价量子点进行处理，导致靶向受体的选择性标记。最后一步是通过单分子荧光显微镜对靶蛋白分布和扩散轨迹进行成像。
最终提取活细胞中靶蛋白的实时动态时空信息，以揭示靶分子在体内的工作原理。这种合成一价量子点的方法的主要优点是其简单性和普遍的可访问性。与许多其他需要特殊技能或设备的方法不同，这种方法相对简单。
因此，它应该适用于任何实验室和任何学科。当 Zeva 和我开始讨论如何结合我们在 DNA 纳米颗粒合成方面的专业知识以更好地控制纳米颗粒的反应性时，我们第一次有了这种方法的想法。我们在一个周末一起进行了初步批准原则实验。
我们的第一次试验越来越成功。在本视频中，我们使用单价量子点来研究活哺乳动物细胞中 Notch 受体的单粒子动力学。然而，这些单价量子点应该可以在任何需要单粒子跟踪的研究中找到广泛的用途。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为并非所有市售的量子点在几何或化学上都是相同的。因此，需要进行一些优化。这种方法的目视演示对于相转移至关重要，而磷 I 相关的 DNA 添加步骤可能会让没有多合成化学经验的实验室望而生畏。
首先，在 5 毫升玻璃瓶中稀释 200 微升有机相量子点的 1 微摩尔溶液和 400 微升氯仿。将这些量子点与 400 微升 0.3 摩尔四丁基溴化铵氯仿溶液和 36 微升纯岩心硫醇的混合物混合，摇动过夜。然后加入 800 微升 0.2 摩尔氢氧化钠水溶液，摇晃 30 秒。
相转移发生在几分钟内，表现为有色颗粒转移到密度较大的有机相上方的水相中。如果颗粒聚集在水相和有机相之间的第三相中，请使用 pec 刻度盘增加孵育时间。如果水相保持透明，则量子点没有相转移。
增加 pec dial 的浓度以缓解相转移不良。接下来，回收有色水相。然后用 racon 离心柱将收集的量子点浓缩至 1 毫升。
将浓缩的量子点溶液加入用含有 30 毫摩尔氯化钠的 10 毫摩尔 tris 缓冲液平衡的 cidex NEP 10 色谱柱中。pH 值为 8 用 1.5 毫升洗脱缓冲液通过重力流洗脱量子点。继续用吸收光谱法测量 350 纳米量子点的浓度。
为了制备单价靶向量子点购买或合成磷酸化 8 DNA，请在含有 30 毫摩尔氯化钠 pH 8 的 10 毫摩尔 tris 缓冲液中制备 1 毫升 100 阿诺摩尔量子点溶液。接下来，加入 500 微升 100 纳摩尔磷酸化 IO 8 DNA 溶液。滴加到水性量子点上 1 分钟，同时剧烈搅拌。
搅拌或将混合物放在摇摇器上再搅拌 9 小时。去除大约 10 微升量子点混合物，在分析 agros 凝胶上运行。此外，在水相中去除相似浓度的未共轭量子点。
然后以大约 2 μL 的 6 x fi 调用上样缓冲液以增加溶液密度。将这两个样品一起放在 0.8% 重量体积的 AROS 凝胶上，溶于钠二醇缓冲液中，在 150 V 电压下电泳 15 分钟。结果应该是未共轭对照泳道中的单个条带在靠近孔的位置迁移，泳道中的两个条带具有共轭量子点。
使用两个波段的相对强度计算未共轭量子点分数。然后使用该分数计算匹配量子点数量所需的 100 纳摩尔磷酸 8 DNA 溶液的额外体积。用这个计算出的体积再次重复该过程，或者直到共轭的量子点在凝胶上塌陷成一个条带，表明所有量子点完全共轭。
接下来，加入 100 微升 10 毫摩尔羧基。将 6 个烷烃硫醇连接到共轭的一价目标量子点上，并摇晃 10 分钟。要去除过量的烷烃聚乙二醇，将 0.5 毫升量子点溶液加入用 Elucian 缓冲液预先平衡的 ACE fitex knap 五柱中。
然后通过重力流用 1 毫升 elu 缓冲液收集单价靶向量子点。用中心康离心柱浓缩收集的量子点。这些单价靶向量子点可以每月储存 4 摄氏度，在成像实验之前使用在全内反射、荧光或草坪质量玻璃上表达 snap tagg 蛋白的酪蛋白或牛血清白蛋白板细胞等试剂食用一价量子点。
在这个特定的实验中，我们使用表达卡扣标记缺口一受体和高质量玻璃表面的 U2 OS 细胞系，在细胞附着到玻璃上后，去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤。然后在室温下将细胞在含有苯甲酰 DNA 的 PBS 或细胞培养基中孵育 10 至 30 分钟，如文本方案中所述制备，与苯并 Guin DNA 孵育后，用 PBS 或细胞培养基仔细洗涤细胞，然后用一价量子点孵育细胞约 5 至 10 分钟。洗涤未结合的一价量子点，并将细胞放回适合成像和培养成像的缓冲液或培养基中。
由于单价量子点的亮度，使用草皮显微镜的细胞在草皮中以高帧速率收集图像，同时对活细胞的基底面进行成像。一旦量子点被带负电荷的 DNA 包被，它们就应该使用等分试样的未包裹的量子点作为对照，与未振裂的量子点分开迁移到凝胶上。添加 Phosphol IO 8 DN 后，应出现第二个更快的迁移条带。单价量子点的完全形成证明了不动带的丢失及其坍缩到移动带中。
如果等分试样的一价量子点产物迁移为可与未包裹的量子点分离的单带，则量子点确实是单价的，可以用于后续步骤。此处显示的是在不同单价量子点浓度下表达 snap notch M cherry 构建体的细胞的代表性标记。用 PEG 12 钝化的单价量子点与 M cherry 共定位，表明特异性标记。
较低的标记密度通常更适合单粒子跟踪。看完这个视频，你应该对如何合成一种明亮的、模块化的、单价的、靶向的荧光纳米粒子有了很好的了解，一旦掌握了这项技术，就可以在一价量子点的两个数据准备和一小时的光电池标记中完成 如果执行得当。重要的是要记住，使用市售的起始试剂，我们可以生产具有优异光物理特性的单价量子点，可用于长时间的单粒子跟踪实验。
在此程序之后，可以使用突扣标签融合标记其他蛋白质，以跟踪它们在活细胞上的分子动力学。使用量子点可能非常难以尘埃落定，因此在执行此程序时不要忘记戴上护目镜手套和实验室外套。
概述
本文介绍了一种使用磷酸硫酸盐DNA制备单价靶向量子点（mQDs）的简单协议。该方法允许高产量的DNA包裹在量子点周围，无需纯化，便于特定膜蛋白的活细胞成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物技术
- 细胞生物学
背景
- 单价量子点对于单分子成像至关重要。
- 靶向特定膜蛋白可提高成像精度。
- 现有方法可能复杂并需要专业技能。
- 该协议旨在简化制备过程。
研究目的
- 提供mQD制备的通用协议。
- 实现靶标膜蛋白的活细胞成像。
- 展示mQD在研究蛋白质动力学中的实用性。
使用的方法
- 向量子点引入长链磷酸硫酸寡核苷酸配体。
- 用苯并噻吩功能化DNA和mQD对活细胞进行连续处理。
- 单分子荧光显微镜用于成像。
- 优化量子点的制备和结合步骤。
主要结果
- 成功生成高产量的单价量子点。
- 有效靶向活细胞中snap标记的膜蛋白。
- 实时成像蛋白质分布和动力学。
- 展示该方法对各种实验室的可及性。
结论
- 该协议简化了mQD用于成像应用的制备。
- 单价量子点可广泛用于单粒子跟踪研究。
- 视觉演示对成功实施至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monovalent quantum dots (mQDs) address a critical limitation in single-molecule imaging by eliminating multivalent binding artifacts that confound spatial organization studies of membrane proteins. This protocol enables biopharma R&D teams to generate defined, monovalent probes using accessible chemistry, supporting mechanistic de-risking in target validation and lead identification workflows. The approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, single-particle tracking data on receptor dynamics in live cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise spatial mapping of single receptor molecules, reducing mechanistic ambiguity in pathway analysis.
- Operational Value: Uses commercially available CdSe/ZnS QDs and phosphorothioate DNA, allowing rapid implementation without specialized equipment or GMP facilities.
- Predictive Confidence: Supports portfolio triage by delivering quantitative binding and diffusion data that correlate with target engagement in native cellular environments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, monovalent probes with consistent valency, ensuring reproducible signal in fluorescence-based assays for compound screening.
- Operational Value: Enables scalable production of mQDs at both small and large scale using simple mixing steps, facilitating assay standardization across discovery teams.
- Assay Readiness: Provides quantitative outputs via single-molecule fluorescence microscopy, allowing precise measurement of receptor density, mobility, and ligand-induced conformational changes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates utility in live mammalian cells, enabling direct translation of in vitro binding data to physiologically relevant systems for de-risking lead candidates.
- Operational Value: Compatible with SNAP-tag labeling strategies, allowing seamless integration into existing protein engineering and expression pipelines.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing real-time spatiotemporal dynamics of target proteins, such as Notch receptor trafficking, which informs mechanistic suitability for therapeutic modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The mQD production and targeting workflow fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, enabling continuous assessment of target behavior across stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating single-receptor events, clarifying signaling pathways and oligomerization states critical for target selection.
- Screening: Delivers assay-ready, monovalent probes with high photostability and defined stoichiometry, supporting reliable compound screening and SAR analysis.
- Analytics: Provides single-particle tracking readouts—diffusion coefficients, co-localization, and residence times—that enable quantitative comparison of ligand or mutant effects on receptor dynamics.
- Translational Research: Uses live-cell imaging to bridge in vitro findings with native physiology, supporting biomarker alignment and mechanism-of-action confirmation.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, platform-compatible method for generating targeted mQDs applicable to diverse membrane proteins beyond Notch, maximizing reagent and workflow leverage.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false-positive signals from multivalent aggregation, increasing confidence in target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Employs simple mixing and purification steps with standard lab equipment, ensuring reproducibility and low technical variance across sites.
- Strategic Value: Lowers barriers to entry for single-molecule imaging, enabling broader adoption across discovery teams and reducing dependency on specialized core facilities.
- Portfolio Impact: Improves risk-adjusted prioritization by delivering direct, quantitative insights into target behavior, minimizing late-stage failures due to unanticipated biological complexity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and fluorescence microscopy for optimal quantum dot conjugation and imaging.
- Depends on access to phase-transfer reagents (e.g., tetrabutylammonium bromide) and spin columns for aqueous transfer and purification.
- Necessitates standardization of quantum dot batches and DNA oligonucleotide quality to ensure consistent monovalent conversion.
- Involves optimization of incubation times and concentrations based on quantum dot core/shell chemistry and size, as noted in user experience.
- Relies on proper passivation (e.g., PEGylation) to minimize non-specific binding in live-cell environments, a practical consideration for reproducible labeling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:38
Phase Transfer of Quantum Dots from Organic to Aqueous Phase
4:21
Preparation of Monovalent Targeted Quantum Dots
6:43
Labeling Live Cells with Monovalent Quantum Dots
8:06
Results: Production of Monovalent Quantum Dots and Labeling of SNAP-tagged Proteins on Live Cells
9:15
Conclusion
