Name: 生产和目标单价量子点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习使用硫代磷酸DNA制备单价靶向量子点的方法，实现活细胞中膜蛋白的单分子成像。该方案无需纯化即可获得高产率，适用于神经科学和细胞生物学研究。

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由美国国防部W81XWH-10-1-1023项目（Z.J.G.）、加州大学旧金山分校系统与合成生物学中心资助项目P50 GM081879（Z.J.G.）、美国国立卫生研究院5R21EB015088-02（Y.J.）和1R21EB018044（Z.J.G. &amp;#38; Y.J.）提供资金支持。D.S. 受人类前沿科学计划跨学科博士后研究奖学金资助。

1. 单价量子点的制备
<ol>
	<li>量子点从有机相向水相的相转移
	<ol>
		<li>取200 µl浓度为1 µM的有机相量子点溶液，加入400 µl氯仿，在5 ml玻璃小瓶中稀释。</li>
		<li>将400 µl浓度为0.3 M的四丁基溴化铵（TBAB）氯仿溶液与36 µl纯mPEG巯基化合物（CH3O(CH2CH2O)6C2H5SH）混合，震荡过夜。</li>
		<li>加入800 µl浓度为0.2 M的NaOH水溶液，震荡30秒。数分钟内发生相转移，表现为有色颗粒转移至上方水相，下方为密度较大的有机相。</li>
		<li>若颗粒在水相与有机相之间的中间相发生聚集，可延长mPEG巯基化合物的孵育时间。若水相仍保持澄清，则表明量子点未发生相转移（见图3A）。也可通过在第2步中提高mPEG巯基化合物的浓度，以改善相转移效果。</li>
		<li>收集（有色）水相，然后使用Centricon离心浓缩柱（截留分子量30 kDa）将收集的量子点浓缩至1 ml。</li>
		<li>将浓缩后的量子点溶液加入预先用含30 mM NaCl的10 mM Tris缓冲液（pH 8.0）平衡的Sephadex NAP10柱中。通过重力流用1.5 ml洗脱缓冲液洗脱量子点。</li>
		<li>利用吸收光谱法在350 nm处测定量子点的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>修饰量子点（mQDs）的制备
	<ol>
		<li>购买（或合成）ptDNA。本方案使用的序列为5’-AS50(CT)10(ACTG)5 -3’（见表1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-AS50(CT)10(ACTG)5-3'</td>
			<td>ASASASASASASASASASASASASASASASAS 
			ASASASASASASASAS ASASASASASASASASAS 
			ASASASASASASASASASASASASASASASASAS 
			CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGACTGACTGACTGACTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-NH2-(CT)10(CAGT)5-3'</td>
			<td>NH2-/C6spacer/ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-DNA</td>
			<td>BG-/C6spacer/ CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于生成和靶向mQD的DNA序列。
<ol start="2" style="margin-left: 40px;">
	<li>在含有 30 mM NaCl 的 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）中制备 1 ml 的 100 nM 量子点（QD）溶液。</li>
	<li>在剧烈搅拌下，于 1 分钟内逐滴加入 500 µl 的 100 nM ptDNA 溶液至水相量子点溶液中，随后继续搅拌或置于摇床上反应额外 9 小时。 
	注意：理论上此步骤应产生 ptDNA:QD 的 1:2 摩尔比。然而实际化学计量通常并不完全理想，结果通常更接近 1:1.5。为获得 ptDNA:QD 的 1:1 比例，需通过凝胶电泳后的密度测定法，根据上述已知体积精确量化偶联比例。</li>
	<li>取约 10 µl 的量子点混合物用于分析型琼脂糖凝胶电泳。同时取等浓度的未偶联水相量子点（来自步骤 1.2.1）作为对照。
	<ol>
		<li>加入约 2 µl 的 6× Ficoll 上样缓冲液（以增加溶液密度），将这两个样品一同在含硼酸钠缓冲液的 0.8% wt/v 琼脂糖凝胶中以 150 V 电压电泳 15 分钟。在未偶联对照泳道中可见一条靠近加样孔迁移的单一条带，而在偶联量子点泳道中可见两条条带（见图 2B中的凝胶结果）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据两条带的相对强度计算未偶联量子点的比例（参见图 2B中的公式），并利用该比例计算为匹配所有量子点数量所需的额外 100 nM ptDNA 溶液体积。</li>
	<li>使用计算所得体积重复步骤 1.2.3 至 1.2.5 一次，或直至偶联量子点在凝胶上合并为单一一条带，表明所有量子点已完全偶联。</li>
	<li>向上述制备的偶联 mQD 中加入 100 µl 溶于含 30 mM NaCl 的 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）中的 10 mM (CO2H)CH2O(CH2CH2O)6C11H23SH（羧基 PEG6 烷基硫醇），并震荡 10 分钟。 
	注意：这些 PEG 配体可钝化量子点表面。更长的 PEG 链可更有效地钝化量子点，但也会增加其粒径。疏水性烷基硫醇官能团对量子点的总体亲和力远高于用于相转移的较弱疏水性 PEG-硫醇。因此，此步骤不可进行过久，否则 ptDNA 将被烷基-PEG-硫醇取代。约 30 分钟孵育后，将有显著比例的 DNA 从量子点上被置换下来（图 3B）。</li>
	<li>为去除过量的烷基 PEG-硫醇，将 0.5 ml 量子点溶液加入已预先用洗脱缓冲液（含 30 mM NaCl 的 10 mM Tris 缓冲液）平衡的 Sephadex NAP5 柱中，通过重力流用 1.0 ml 洗脱缓冲液收集 mQD。</li>
	<li>使用 Centricon 离心浓缩柱（30 kDa）浓缩收集的量子点。将这些 mQD 储存于 4 °C，可保存数月，切勿冷冻。 
	注意：若在离心管底部观察到有色沉淀，则表明量子点已发生聚集，可能不再可用。</li>
</ol>
2. 靶向（苄基鸟嘌呤-）DNA 的制备
<ol>
	<li>制备或购买氨基末端的DNA。本方案使用序列 5’-NH2-(CT)10-(CAGT)5-3’（见表1）。聚CT连接子可提高对深埋于糖萼中的功能位点的可及性，但并非所有应用均需使用。若有DNA合成仪，可使用适当的5’氨基修饰剂（如5’氨基修饰剂C6）合成氨基修饰的DNA。</li>
	<li>将BG-N-羟基琥珀酰亚胺（BG-NHS）溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mg/ml的溶液。 
	注意：BG-NHS会从空气中吸收水分，导致活性NHS酯发生水解，尤其在DMSO和二甲基甲酰胺（DMF）等易吸湿的溶剂中更为明显。BG-NHS最好以粉末形式存放在-80 °C，置于原装小瓶中，并将小瓶放入含有干燥剂的次级容器内。使用前需升温至室温。或者，可立即将BG-NHS酯分装至单次使用量，溶于干燥极性溶剂后于-80 °C冷冻保存，或在步骤2.2中与氨基DNA完全反应。</li>
	<li>将步骤2.1中溶于DMSO的BG-NHS与溶于HEPES缓冲液（pH 8.5）水溶液中的氨基末端DNA混合进行反应。典型反应条件为：将20 µl 10 mg/ml的BG-NHS DMSO溶液与2 µl 2 mM NH2-(CT)10-(CAGT)5溶于58 µl去离子水中，并加入20 µl 0.5 M HEPES缓冲液（pH 8.5）。反应在1.5 ml微量离心管中进行。需迅速混合，因反应迅速，且必须与NHS酯的水解竞争。</li>
	<li>超声处理5–10分钟以确保充分混匀。室温孵育约1小时。可通过调整BG与DNA的化学计量比来推动反应完全。</li>
	<li>使用标准NAP5柱对反应产物进行脱盐，置换至100 mM三乙胺乙酸盐（TEAA，pH 7）溶液中。</li>
	<li>通过反相高效液相色谱（HPLC）纯化BG-DNA，以去除未反应的氨基-DNA。采用100 mM TEAA与乙腈（ACN）的梯度洗脱，乙腈浓度在30分钟内从8%升至95%。未反应的氨基-DNA先于BG-DNA洗脱。收集BG-DNA组分至锥形管中。
	<ol>
		<li>使用C18 Zorbax柱进行标准寡核苷酸纯化，并采用以下梯度： 
		0→15 分钟：8→30% ACN； 
		15→21 分钟：30–90% ACN； 
		21→25 分钟：90→8% ACN； 
		25→30 分钟：8% ACN；</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将收集的组分在液氮中速冻后冻干。用去离子水重新溶解DNA。为更加彻底，可再冻干两次以去除残留的TEAA。高浓度残留的TEAA对细胞具有毒性。</li>
	<li>将冻干的BG-DNA溶于水中，确保冲洗管壁，并稀释至约25 µM的储存浓度。分装后于4 °C保存。样品在此条件下储存约9个月未见明显降解。</li>
</ol>
3. 使用单价量子点标记活细胞
<ol>
	<li>可选步骤：在成像实验前，使用如酪蛋白（0.5%）或牛血清白蛋白（BSA，1–3%）等试剂对磁性量子点（mQDs）进行钝化处理。</li>
	<li>将表达SNAP标签蛋白的细胞接种于适用于全内反射荧光（TIRF）成像的高质量玻璃表面。本实验中，我们使用表达SNAP标签化Notch1受体的U2OS细胞系以及高质量的玻璃表面。</li>
	<li>待细胞贴壁后（约24小时），移除培养基，用PBS洗涤，并在室温下用约100–150 µl含约1 µM BG-DNA（来自上述步骤2.6）的PBS或细胞培养基孵育细胞10–30分钟。</li>
	<li>与BG孵育后，用PBS或细胞培养基小心洗涤细胞，随后加入步骤1.2.9制备的mQDs（可选地经步骤3.1钝化处理），孵育约5–10分钟。</li>
	<li>可选步骤：洗去未结合的mQDs，并将细胞重新置于适合成像和培养的缓冲液/培养基中。对于需进行TIRF模式成像的细胞，通常无需最终洗涤步骤，因为在溶液中未结合的mQDs扩散速度远快于已结合的mQDs，在分析过程中无法被检测到。</li>
</ol>
4. 显微镜观察 &amp;#38; 分析
<ol>
	<li>使用TIRF显微镜对细胞进行成像。 
	注意：显微镜必须配备可分离的激发和发射滤光片，或定制的量子点（QD）滤光立方体。量子点（QD）最适合用短波长激光（405 或 488 nm）激发。不同直径的量子点具有特征性的发射波长，通常伴随较大的斯托克斯位移（Stoke’s shift）。</li>
	<li>由于磁性量子点（mQD）亮度较高，在对活细胞基底侧进行TIRF成像时，应以高帧率采集图像。 
	注意： alternatively，可使用转盘共聚焦显微镜在其他焦平面上追踪单分子动态。自动化单粒子追踪软件通常能够准确追踪亮度高且光稳定性好的mQDs。</li>
</ol>

<ol><li>Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+EGFR+signaling+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (3), 168-172 (2000).</li>
<li>Luo, W., He, K., Xia, T., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+monitoring+in+living+cells+by+use+of+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule monitoring in living cells by use of fluorescence microscopy.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (1), 43-49 (2013).</li>
<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
<li>Fernández-Suárez, M., Ting, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+super-resolution+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 929-943 (2008).</li>
<li>Sark, W. G. J. H. M., Frederix, P. L. T. M., Vanden Heuvel, D. J., Gerritsen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photooxidation+and+photobleaching+of+single+CdSe%2FZnS+quantum+dots+probed+by+room-temperature+time-resolved+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Photooxidation and photobleaching of single CdSe/ZnS quantum dots probed by room-temperature time-resolved spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (35), 8281-8284 (2001).</li>
<li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+events%2C+one+quantum+dot+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307 (5709), 538-544 (2005).</li>
<li>Howarth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent%2C+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nature Methods. 5 (5), 397-399 (2008).</li>
<li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic+aldehyde+and+hydrazine+activated+peptide+coated+quantum+dots+for+easy+bioconjugation+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aromatic aldehyde and hydrazine activated peptide coated quantum dots for easy bioconjugation and live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1006-1011 (2011).</li>
<li>Tikhomirov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+programming+of+quantum+dot+valency%2C+self-assembly+and+luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA-based programming of quantum dot valency, self-assembly and luminescence.</a> Nature Nanotechnology. 6 (8), 485-490 (2011).</li>
<li>Farlow, J., Seo, D., Broaders, K. E., Taylor, M. J., Gartner, Z. J., Jun, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+targeted+monovalent+quantum+dots+by+steric+exclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of targeted monovalent quantum dots by steric exclusion.</a> Nature Methods. 10 (12), 1203-1205 (2013).</li>
<li>Gartner, Z. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+assembly+of+3-dimensional+microtissues+with+defined+cellular+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Programmed assembly of 3-dimensional microtissues with defined cellular connectivity.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences USA. 106 (12), 4606-4610 (2009).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

mQD 设计的模块化特性使其具备更高的实验灵活性。例如，可快速制备多种不同颜色的 mQD，从而实现对多个靶标的同步成像。单链 DNA 靶向序列可将 mQD 引导至蛋白质、糖类12、脂质和表面13。目前已有多种具有正交反应性的酶标签可供使用，使得不同靶向的 mQD 能够同时对多个靶标进行成像。除了使用 SNAP 标签进行靶向外，利用 CLIP 标签、HALO 标签以及生物素化蛋白质对靶标蛋白进行 mQD 标记也已成功实现。本方案展示了利用这些 mQD 对活细胞表面受体进行特异性标记的方法，但该方案亦可轻松适用于多种不同实验场景。
制备具有确定价态的磁性量子点（mQDs）的关键方法学见解在于，需要约50个硫代磷酸酯连接的碱基来包裹量子点（从而防止两个分子同时结合）。poly-AS50序列可重复且稳定地结合Life Technologies公司生产的605 nm量子点。尽管该产品已停产，但这种空间位阻排斥策略可推广应用于其他厂商生产的具有不同尺寸、形状和光谱特性的类似产品。
ptDNA 包被的量子点（QDs）的效率和稳定性在很大程度上取决于量子点的表面化学性质和结构。因此，实验方案的成功与否将依赖于所用量子点的商业来源及其化学结构。在本实验方案中，不同商业来源的量子点主要存在三个方面差异：相转移所需条件的不同；初始 PEG-硫醇配体结合强度的差异，可能阻碍 ptDNA 的取代；以及暴露的 CdSe 核心程度的不同，可能导致 mPEG 硫醇相转移条件下量子点发生荧光淬灭。
截至发表时，用于制备磁性量子点（mQDs）的最佳结构量子点为购自 Life Technologies 的 4–10 nm CdSe/ZnS 核/壳结构量子点，其发射光谱分别为 545、585、605 &amp;#38; 625 nm（图 2A）。基于“Vivid”配方的量子点（545，605， 等等。）在加入mPEG巯基后会发生猝灭，因此不适用于此应用。Aldrich和Ocean Nanotech的量子点效果良好，但需要更长的相转移步骤，并需用三辛基氧化膦进行预处理。本方案已针对Life Technologies的量子点进行优化。
用于包裹量子点的聚腺苷酸磷硫酰化序列，其末端连接了一段含有( ACTG )5序列的天然20聚体DNA尾部，靶向链可与此序列杂交。该序列具有便利性，因其几乎不形成二级结构，并且在PBS缓冲液中37 °C条件下仍能保持杂交状态。若具备DNA合成仪，可自行合成ptDNA，随后使用C8柱通过反相高效液相色谱（HPLC）进行纯化。与具有天然骨架的等长寡核苷酸相比，ptDNA在HPLC中的洗脱时间更晚。我们通常在纯化后保留磷硫酰化寡核苷酸5’端的DMT保护基团。
对于大多数实验应用，通常需要对ptDNA包裹的量子点（QDs）进行钝化处理，以提高其胶体稳定性并降低背景结合。本方案采用聚乙二醇（PEG）层对量子点进行钝化。使用带有额外PEG单元的羧基-PEG烷基硫醇（(CO2H)CH2O(CH2CH2O)12C11H23SH，即羧基-PEG12烷基硫醇）可显著降低背景信号，但较长的PEG链体积更大，且通常成本更高。使用羧基-PEG烷基硫醇配体包覆的多功能量子点（mQDs）在生理缓冲液（如磷酸盐缓冲盐水和培养基）中具有高度稳定性。在4 °C下长期储存（&#62; 8个月）的mQDs未显示明显聚集或ptDNA脱落11。根据具体实验需求，仅对量子点进行PEG钝化并不总能充分降低mQDs的非特异性结合。在使用前，将细胞和mQDs在含3% BSA的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育20分钟，可显著减少与细胞的非特异性结合，但会使mQDs的表观流体动力学半径增加约50%。使用0.5%酪蛋白进行钝化可进一步降低非特异性结合，但其导致的粒径增大程度比BSA更显著。
与mQDs互补的DNA链的5’端可进行修饰，以实现对多种不同生物分子的靶向。目前已有多种成熟技术可用于蛋白质、脂质的共价修饰 &amp;#38; 单链DNA（ssDNA）结合。只要ssDNA呈递在细胞外，即可被可溶性mQD接触。在细胞培养条件下，带有上述序列的mQD会迅速与其互补DNA链发生杂交。为了实现高效靶向，可能需要在ptDNA与靶向序列之间插入一段10–20倍的聚(CT)间隔序列，以将结合序列抬升至细胞表面厚且带负电荷的糖萼之上。在本实验方案中，我们选择制备一种BG-DNA，其互补序列为(CAGT)5 该物质可同时与mQDs杂交，并通过共价键连接至SNAP-tag蛋白，实现快速且特异性的标记。类似的方案也适用于将其他NHS酯类化合物与氨基修饰的寡核苷酸进行偶联。
对于单分子成像，通常需要较低的标记密度以分辨单个分子。在含有钝化剂的 PBS 中，mQD 的终浓度约为 0.5 nM 是一个理想目标。然而，这种高倍稀释有时会导致细胞标记不足。若发生此情况，可追加 mQD 直至观察到理想的标记密度。以 SNAP 标记的人源 Notch1 为例，当 mQD 浓度高于&#62;10 nM 时，细胞呈现密集标记，而 0.5 nM mQD 则导致靶向细胞基底表面约有 20 个 mQD 结合（见图 4B）。细胞的 mQD 标记效果高度依赖于接种细胞的融合度。过度融合的细胞在其基底表面无法有效标记。
综上所述，本文介绍了一种制备单价且模块化量子点（QDs）的简便方法。这些单价量子点（mQDs）在活细胞成像中具有广泛的应用价值，如在活体U2OS细胞中对Notch受体的成像所示。mQDs的应用不仅限于这一特定案例，还可有望拓展至其他细胞靶标，如其他蛋白质、核酸和酶。

单个分子在活细胞上的动态行为与其生物学功能密切相关。单分子荧光成像是一种研究细胞表面单分子动态的常用方法1,2,3。然而，这些研究中最常用的成像探针存在若干重要缺陷。例如，传统的有机染料和荧光蛋白亮度中等，摩尔消光系数约为 105–106 M-1 cm-1，但光化学稳定性差，在典型的活细胞成像条件下发射约 105–106 个光子后即发生漂白4,5。相比之下，半导体纳米粒子（常称为量子点，QDs）亮度显著更高且更加稳定，其消光系数在 106–107 M-1 cm-1 范围内，并在发生光漂白前可发射超过 107–108 个光子5。与有机荧光团相比，量子点在亮度和光稳定性方面的提升使得能够在显著更快的帧率下以及更长的轨迹中对单个分子进行观测6。
尽管这些强大的成像试剂具有优势并已实现商业化，但仍存在若干缺陷。首先，其靶向价态定义不明确，可能导致靶向生物分子发生交联6。其次，它们通常具有较大的流体力学尺寸（&#62; 20 nm），限制了其在某些空间拥挤的细胞环境中的可及性7。第三，其靶向模块化能力有限7。已有多种策略尝试解决这些问题8,9,10，但通常需要专门的知识和试剂才能实施。
为了解决这些问题，我们近期报道了一种制备单价、小尺寸且模块化的量子点（QDs）的“空间排阻”策略11。这些量子点被一条长链硫代磷酸酯DNA（ptDNA）聚合物包裹。ptDNA通过其聚合物上的硫代磷酸酯基团与量子点表面暴露的锌原子之间形成的多个Zn-S相互作用，结合到量子点表面。单条结合的聚合物通过空间位阻和静电排斥作用，阻止了额外等量聚合物的结合，同时并未显著增加颗粒的整体尺寸（约2 nm）。所有试剂均可商业获得，产物收率高，且纯化过程仅需脱盐步骤。标记完成后，包裹单条ptDNA的量子点（mQDs）可与携带靶向结构域（例如，苄基鸟嘌呤（BG）、苄基胞嘧啶或烷基卤化物）的互补DNA链结合。
这些功能可将磁性量子点（mQDs）特异性地靶向至SNAP、CLIP等酶标签 &amp;#38; HALO，且该蛋白与目标蛋白基因融合。本方案用于通过空间排阻法合成、靶向及活细胞成像mQDs。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;mQD 的生产&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>磷酸硫代DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(A*)x50-(ACTG)x5</td><td>IDT</td><td></td><td>大多数DNA合成公司</td></tr><tr><td>量子点：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QDots 525、585、605 &amp;和 625</td><td>Invitrogen</td><td>Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)</td><td>QD625的定制化量子点合成</td></tr><tr><td>QD610</td><td>Ocean Nanotech</td><td>QSP-610-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QD 610 lamda</td><td>Aldrich</td><td>731854</td><td></td></tr><tr><td>氯仿，99.8%</td><td>ACROS</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>四丁基溴化铵，98.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>426288</td><td></td></tr><tr><td>mPEG 巯基 [2,5,8,11,14,17,20-七氧杂二十二烷-22-硫醇]，分子量 354.5，纯度 95%</td><td>Polypure</td><td>11156-0695</td><td></td></tr><tr><td>造血干细胞&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;EG&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&amp;nbsp; [HS-(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;-(OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;-OCH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H]</td><td>ProChimia</td><td>TH 003-m11.n6-0.1</td><td></td></tr><tr><td>硼酸，99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，99.0%</td><td>ACROS</td><td>S/4845</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖</td><td>美国生物技术资源</td><td>G02PD-125</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;BG-DNA 制备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">胺基DNA</td></tr><tr><td>（CAGT）&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>大多数DNA合成公司</td></tr><tr><td>（CAGT）&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;(T)&lt;sub&gt;40&lt;/sub&gt;-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>大多数DNA合成公司</td></tr><tr><td>NHS-GLA-苄基鸟嘌呤</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>S9151</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8428</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>NAP5 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>C18 柱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;哺乳动物细胞培养 &amp;与成像&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>表达SNAP标签蛋白的细胞系</td><td>新英格兰生物科学公司</td><td>E9100S</td><td></td></tr><tr><td>McCoys 5A</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td></td><td>特定于U2OS细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td></td><td>特定于U2OS细胞培养</td></tr><tr><td>PBS</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek II 培养皿盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Matriplate 96孔板</td><td>布鲁克斯生命科学系统</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% 碱溶性酪蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>70955</td><td>并非所有酪蛋白都相同</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;（可选）DNA 合成试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5&amp;rsquo; C6 胺基修饰剂</td><td>Glen Research</td><td>10月6日</td><td></td></tr><tr><td>dA-硫代亚磷酰胺</td><td>格伦研究公司</td><td>10-700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;分析软件&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RyTrack.pro</td><td>http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>追踪器</td><td>http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单价量子点的制备与靶向

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

商用量子点（QDs）具有多价特性，而单价量子点的制备存在困难，这限制了其在生物学中的应用——在生物学研究中，生物分子的聚集和空间组织往往是研究的重点。本文介绍一种制备单价量子点（mQDs）的实验方案，该方法可在大多数生物研究实验室中通过将CdSe/ZnS核壳结构的QDs与特定长度的硫代磷酸酯DNA（ptDNA）简单混合即可完成。当一条ptDNA链包裹量子点后，其他DNA链便无法再结合到其表面。以这种方式制备mQDs可实现小规模与大规模生产，仅需商用试剂且步骤最少。这些mQDs可通过与互补的单链靶向DNA杂交，特异性地靶向生物学目标。我们通过将带有苄基鸟嘌呤基团的mQDs用于标记活体哺乳动物细胞上SNAP标记的Notch受体，展示了此类mQDs作为成像探针的应用。

量子点从有机相转移到水相是制备修饰量子点（mQDs）的关键步骤，但该过程可能因实验条件和量子点本身的特性而异。第1.1节中的相转移结果应如图3中前两个小瓶所示那样清晰。如果转移结果更接近第3个小瓶的情况，则应尝试更换条件重新进行实验。
一旦量子点（QDs）被带负电荷的DNA包被，它们在凝胶电泳中的迁移位置应与未包被的QDs分离。以未包被的QDs样品作为对照，加入质粒DNA（ptDNA）后应出现第二条迁移更快的条带，如图2B中第一块凝胶所示。当固定的条带完全消失并合并至可迁移条带时，表明mQDs已完全形成，如图2B中最后一块凝胶所示。如果您的mQD产物样品在凝胶上迁移为一条可与未包被QDs分离的单一清晰条带，则表明您的mQDs为单价态，可用于后续实验步骤。
细胞标记应针对您选择的靶标，并取决于蛋白表达水平和mQD浓度。对于任何特定应用，通常都需要对mQD浓度和mQD钝化条件进行经验性优化。图4B展示了使用浓度范围为0.5 nM至10 nM的mQD对表达SNAP标记Notch受体的U2OS细胞进行标记的结果。
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="显示SNAP、CLIP、HALO靶向蛋白质与DNA相互作用的化学反应示意图。" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. mQD的模块化靶向。 mQD与由多种靶向分子功能化的ssDNA杂交。连接苯甲基鸟嘌呤的DNA可将mQD靶向SNAP标记的融合蛋白。其他5’端修饰和DNA序列可实现mQD对多种其他生物分子的靶向。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="纳米颗粒PEG包被过程示意图，含DNA缠绕；相转移装置；化学说明。" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. mQDs的制备示意图。（A）有机相量子点（QDs）通过mPEG硫醇和TBAB处理转移至水相，随后用ptDNA包裹，并以羧基化PEG6烷基硫醇进行钝化。代表性透射电子显微镜（TEM）图像分别为有机相QD545、QD585和QD605。（B）上述第二步中量子点与ptDNA相互作用化学计量比的经验测定方法。通过密度测定法实证验证QD与ptDNA的化学计量比，使最终反应的化学计量比为1:1（QD:ptDNA）。初始ptDNA的摩尔数乘以QD:mQD的比值，并根据偶联后的实际体积进行调整，以计算出实现1:1偶联所需的ptDNA摩尔数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="量子点相转移过程；示意图显示成功/失败的转移及钝化分析。" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
	图3. mQDs制备的实验细节。（A）成功与失败相转移的代表性照片。量子点应在密度较高的有机相与密度较低的水相之间发生明显的转移。相分离不完全表明转移效果不佳。（B）ptDNA可被烷烃-PEG-硫醇取代。右侧凝胶数据代表了一个发生显著ptDNA从量子点表面被置换的反应，原因是过度钝化所致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img fo:content-width="6in" width="600" alt="SNAP-标签表达示意图；用 BG-DNA 标记，与量子点杂交。量子点分析结果。" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 在活细胞上标记 SNAP-标签蛋白。（A）示意图，展示 SNAP-标签受体的表达、结合及使用靶向 BG 的多价量子点（mQD）进行标记的过程。（B）在不同 mQD 浓度下，表达 SNAP-Notch-mCherry 构建体的细胞的代表性标记结果。使用 PEG12 钝化的 mQD 与 mCherry 共定位，表明实现了特异性标记。较低的标记密度（&lt;0.5 nM）通常更适用于单粒子追踪实验。比例尺为 10 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提供了利用特定长度的硫代磷酸酯DNA制备单价靶向量子点（mQDs）的详细步骤。DNA缠绕反应产率高，因此产物无需纯化。我们展示了如何利用SNAP标签将mQDs靶向至细胞表面受体，用于活细胞成像应用。

商业量子点（QDs）的多价特性以及制备单价量子点所面临的技术难题，限制了其在……中的应用

本实验的总体目标是提供一种简便且具有普适性的方案，用于制备单价量子点，以实现活细胞中靶向膜蛋白的单分子成像。该方法首先向量子点引入化学计量比的长链多磷酸寡核苷酸配体。这条长链DNA能够完全包裹量子点，阻止第二个DNA分子的结合，从而定量地、专一地生成单价量子点。分别进行。制备经苯并胍功能化且携带互补序列的DNA，用于靶向活细胞表面表达的SNAP标签膜蛋白。接着，依次用苯并胍、DNA处理表达SNAP标签膜蛋白的活细胞，随后加入单价量子点，实现对目标受体的选择性标记。最后一步是通过单分子荧光显微镜成像目标蛋白的分布及扩散轨迹。最终从活细胞中提取目标蛋白的实时动态时空信息，以揭示目标分子在体内的作用机制。这种合成单价量子点方法的主要优点在于其简单性和普遍可及性。与许多其他需要特殊技能或设备的方法不同，该方法相对直接易行。因此，该方法应适用于任何实验室和任何学科。Zeva 和我最初讨论如何将我们在 DNA 纳米粒子合成方面的专长结合起来，以更好地控制纳米粒子的反应活性时，便萌生了这一方法的构想。我们共同在一个周末完成了初步的原理验证实验。我们的首次实验已取得成功。在本视频中，我们使用单价量子点来研究活体哺乳动物细胞中 Notch 受体的单颗粒动力学。然而，这些单价量子点应可广泛适用于任何需要单颗粒示踪的研究。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为市售的量子点在几何结构或化学性质上并非完全相同，因此需要进行一定的优化。在相转移以及含磷 DNA 添加步骤中，若缺乏多步合成化学经验，实验人员可能会感到操作难度较大，此时对该方法的直观演示至关重要。首先，在一个5毫升的玻璃小瓶中，将200微升浓度为1微摩尔的有机相量子点溶液与400微升氯仿混合稀释。将上述量子点与400微升0.3摩尔的四丁基溴化铵氯仿溶液和36微升纯净的巯基苯乙醇（PEC thiol）混合液混合，振荡过夜。然后加入800微升0.2摩尔的氢氧化钠水溶液，振荡30秒。几分钟内即发生相转移，表现为有色颗粒转移到上层水相，而下层为密度更大的有机相。如果颗粒聚集在水相和有机相之间的第三相中，需延长与 pec 透析的时间。如果水相仍然澄清，则表明量子点未发生相转移。提高 pec 透析液的浓度以改善不良的相转移。接着，回收有色水相。然后使用 racon 离心柱将收集的量子点浓缩至一毫升。将浓缩的量子点溶液加入已用含30毫摩尔氯化钠的10毫摩尔Tris缓冲液预平衡的Cidex NEP 10层析柱中。在pH 8条件下，通过重力流用1.5毫升洗脱缓冲液洗脱量子点。随后在350纳米处通过吸收光谱法测定量子点的浓度。为制备单价靶向量子点，需购买或合成磷酸化八聚DNA，然后在含有30毫摩尔氯化钠、pH为8的10毫摩尔Tris缓冲液中配制1毫升100阿摩尔的量子点溶液。接着，在剧烈搅拌下，将500微升100纳摩尔的磷酸化IO八聚DNA溶液逐滴加入水相量子点中，持续1分钟。将混合物继续搅拌或置于摇床中反应额外九小时。取约10微升量子点混合物用于分析型琼脂糖凝胶电泳。同时，取等量浓度的未结合量子点水相样品。然后加入约2 µL的6×上样缓冲液以增加溶液密度。将这两个样品在含有溴化钠的0.8%（重量/体积）琼脂糖凝胶中，以150 V电压电泳15分钟。结果应显示未结合的对照条带在靠近加样孔的位置形成一条单一条带，而结合了量子点的样品条带则出现两条带。利用两条带的相对强度计算未结合的量子点比例。然后根据该比例计算所需额外添加的100纳摩尔磷酸化八聚DNA溶液的体积，以使DNA分子数量与量子点数量相匹配。使用计算出的体积重复该步骤一次，或继续重复直至凝胶上结合的量子点形成单一一条带，表明所有量子点均已完全结合。接下来，向偶联的单价靶向量子点中加入 100 µL 10 mM 羧基-PEG6-烷烃硫醇，并振荡 10 分钟。为去除过量的烷烃-PEG醇，将 0.5 mL 量子点溶液加入已用洗脱缓冲液预平衡的 ACE Fitex Knap 5 柱中。然后使用一毫升洗脱缓冲液通过重力流收集单价靶向量子点。使用离心浓缩柱对收集的量子点进行浓缩。这些单价靶向量子点可在4°C下保存数月。在进行成像实验前，使用酪蛋白或牛血清白蛋白等试剂对量子点进行处理，并将表达SNAP-tag蛋白的细胞接种于全内反射荧光或高质量的玻璃表面。在本实验中，我们使用表达 SNAP 标记的 Notch1 受体的 U2 OS 细胞系，以及高质量的玻璃表面。细胞贴壁后，移除生长培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。随后，在室温下用含有苯甲酰基鸟嘌呤 DNA（benzoyl guine DNA）的 PBS 或细胞培养基孵育细胞 10 至 30 分钟，该试剂的配制方法详见文本方案。经苯甲酰鸟嘌呤 DNA（benzo Guin DNA）孵育后，仔细用 PBS 或细胞培养基洗涤细胞，然后加入单价量子点（monovalent quantum dots）孵育约 5 至 10 分钟。洗去未结合的单价量子点，将细胞重新置于适合成像和培养的缓冲液或培养基中进行成像。由于单价量子点的亮度较高，可使用草坪显微镜在成像活细胞基底面的同时，以高帧率在草坪上采集细胞图像。当量子点被带负电荷的DNA包被后，在凝胶电泳中应与未包被的量子点分离，可使用一份未包被的量子点作为对照。加入磷酸化八聚DNA（Phosphol IO eight DN）后，应出现第二条迁移更快的条带。单价量子点完全形成的表现为不动条带消失，并合并至可动条带中。如果单价量子点产物的等分试样迁移形成一条可与未包被量子点分离的单一条带，则表明量子点确实为单价态，可用于后续实验步骤。图中展示了使用不同浓度的单价量子点对表达Snap-Notch M Cherry构建体的细胞进行标记的代表性结果。经PEG12钝化的单价量子点与M Cherry共定位，表明实现了特异性标记。对于单粒子示踪，通常更倾向于使用较低的标记密度。观看本视频后，您应能充分理解如何合成一种具有高亮度、模块化、单价且可靶向的荧光纳米粒子。一旦掌握该技术，可在两天内完成单价量子点的制备，并在一小时内完成活细胞标记。需注意的是，使用市售的起始试剂，我们即可制备出具有优异光物理性质的单价量子点，适用于长时间的单粒子追踪实验。通过该实验步骤，可将其他蛋白质与Snap标签融合，以标记并追踪其在活细胞中的分子动态。量子点操作过程中极易产生粉尘，因此进行该实验时，务必佩戴护目镜、手套并穿上实验服。

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