利用SPOT肽阵列分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶的特异性

以下实验的总体目标是研究蛋白质赖氨酸甲基转移酶（protein lysine methyl transferases，PKMTs）的底物特异性。该目标通过鉴定一个初始底物，并制备包含该底物在不同位置进行单个氨基酸替换的多种变异体的肽阵列来实现。第二步，将肽阵列与PKMT在放射性甲基供体存在下孵育，从而通过放射性标记转移至相应肽点来检测肽的甲基化。

接下来，将芯片暴露于X射线胶片并进行定量分析，以确定每种肽段上的甲基化活性。为了定义PKMT的特异性谱型，实验结果可揭示底物肽段中哪些氨基酸对PKMT介导的甲基化至关重要。该技术相较于现有方法（如单个肽段的甲基化检测）的主要优势在于，可在一次实验中以成本效益较高的方式同时检测多种不同的肽段。

该方法有助于解答蛋白质赖氨酸甲基化领域的关键问题，例如鉴定先前未知的新型 PK mtss 底物。因此，该方法可为 PK mts 的特异性提供深入见解。此外，该方法还可应用于其他体系，如蛋白激酶、其他蛋白质甲基转移酶、转移酶或修饰转移酶。

当我了解到利用多肽斑点合成法可以以合理成本制备大规模定制多肽阵列时，首次产生了本方法的构想。开始该实验前，使用 Multi Pep Spotter 软件设计用于合成的多肽序列，以单字母编码输入多肽序列，每个字母代表特定的氨基酸。随后，将氨基聚乙二醇功能化的斑点膜在 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中预溶胀 10 分钟。完成后，将湿润的膜置于斑点合成仪框架上，确保无气泡或皱褶。

在开始合成程序前，将膜完全干燥至少10分钟。用100%乙醇洗涤膜三次，以与膜上的游离氨基形成酰胺键。通过向氨基酸衍生物中加入二异丙基碳二亚胺（DIC）和乙基羟基氨基乙酸酯，活化进入的氨基酸的羧基。

活化后，使用可编程机器人将所需体积的活化氨基酸点样到氨基PEG功能化的膜上。重复上一步骤三次，以确保第一个活化氨基酸的充分偶联。将膜孵育20分钟后，用DMF洗涤，以去除未偶联的氨基酸，并在干燥后封闭游离的氨基基团。

用DMF洗涤膜四次，然后在DMF中加入20%哌啶孵育20分钟，以去除FM保护基团。洗涤并干燥膜后，重复点样和F MOC去除步骤，直至获得目标肽链长度。在最后一次F MOC基团脱保护后，用DMF和100%乙醇洗涤膜。

然后用含0.02%溴酚蓝的DMF溶液处理膜，至少五分钟，直至膜完全变为蓝色。洗涤并干燥膜后，将其从合成仪中取出，放入耐化学腐蚀的盒子中。加入20至25毫升侧链D保护基去除混合液进行处理，该混合液含有95%三氯乙酸，用于裂解侧链保护基，同时加入捕获试剂以防止氨基酸侧链被修饰。

确保深层保护混合液完全覆盖膜后，彻底封闭盒子，并在孵育后轻轻振荡孵育一至两小时。用20至25毫升二氯甲烷洗涤膜六次，每次两分钟。用100%乙醇洗涤两次后，将膜置于干燥器中过夜干燥。

接下来，将肽阵列膜置于密封的塑料袋中，加入不含酶但含有放射性标记甲基基团的相应甲基化缓冲液，预孵育10分钟。弃去预孵育缓冲液后，将膜在8毫升含有相应PKMT的甲基化缓冲液中孵育1至2小时。随后，将甲基化缓冲液倒入放射性废物容器中弃去，并用20毫升含有100毫摩尔碳酸氢铵和1% STS的缓冲液洗涤肽阵列5次，每次5分钟，以去除结合的蛋白质。将最后一次洗涤缓冲液倒入放射性废物容器后，将膜在10毫升扩增溶液中孵育5分钟。

然后将扩增溶液弃置于有机溶剂的放射性废物容器中。将肽阵列密封在塑料袋中，并放入自显影暗盒内。在暗室中将自显影胶片放置于肽阵列上。

然后小心关闭暗盒。在–80摄氏度条件下曝光胶片后，进行显影以分析结果。最后，使用不同的曝光时间多次采集图像，以避免强甲基化肽底物信号过饱和。

此处展示了一个使用 NSD1 对肽阵列进行甲基化反应的示例。横轴代表肽的序列，纵轴显示实验结果。被修饰的氨基酸表示为经 NSD1 甲基化修饰；该结果表明 NSD1 特异性作用于 H3K36，并识别目标赖氨酸两侧的三至四个氨基酸残基。此处展示了三次 NSD1 肽阵列实验的整合结果。

约85%的肽段显示的标准偏差小于±20%，超过97%的肽段显示的标准偏差小于±30%。计算得到的区分因子数据显示，NSD1在-2位点偏好芳香族残基，在-1和+2位点偏好疏水性残基，而在+1位点则偏好精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。

通过搜索人类蛋白质组数据库，可以找到潜在的新型肽底物。其中一些肽与ome发生强烈甲基化反应，证实其为新型NSD1肽底物。在尝试该实验流程时，重要的是要牢记使用最合适的初始底物，并遵循本实验方案。

还可以通过体外及细胞内对应蛋白质的甲基化等其他方法，来验证蛋白质是否可被接受为底物，尤其是在该技术建立之后。该技术为蛋白质赖氨酸甲基转移酶领域的研究人员提供了途径，用以确定多种PK甲基转移酶的底物特异性，并鉴定出多个新的底物，从而有助于理解PK甲基转移酶的重要生物学功能。

请注意，在肽合成过程中使用放射性物质和有机溶剂可能存在风险，进行该操作时必须始终采取适当的防护措施。