Name: 蛋白赖氨酸甲基转移使用SPOT肽阵列特异性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解使用SPOT肽阵列分析蛋白赖氨酸甲基转移酶底物特异性的方法。该技术可同时检测多种肽段变体，帮助研究人员高效鉴定关键氨基酸位点并解析PKMT的生物学功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了 DFG 资助项目 JE 252/7 的支持。

1. 肽阵列的制备
<ol>
	<li>肽序列的编程
	<ol>
		<li>使用 MultiPep Spotter 软件设计用于合成的肽序列。以单字母代码输入肽序列。 
		肽 1：T A R K S T G G K A</li>
		<li>通过特定命令（.replace, A）生成丙氨酸或精氨酸扫描文库，以筛选识别特定底物所必需的关键氨基酸。例如，在以下示例中，第一行为野生型序列，从第二行开始，肽中的每个氨基酸依次被替换为丙氨酸。 
		replace, A 
		T-A-R-K-S-T-G 
		A-A-R-K-S-T-G 
		T-A-R-K-S-T-G 
		T-A-A-K-S-T-G 
		T-A-R-A-S-T-G 
		T-A-R-K-A-T-G 
		T-A-R-K-S-A-G 
		T-A-R-K-S-T-A</li>
		<li>使用类似的命令（.replace R, .replace N 等），如 1.1.2 所述，对所有天然存在的氨基酸残基（可选择性排除半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，因为这些残基易被氧化且有时导致合成产率降低）进行操作，以&#160;合成肽阵列，用于确定酶的共识底物序列基序。 
		注：如图 4A所示，横轴表示给定的肽序列，纵轴表示被选中用于替换命令的氨基酸。与 1.1.2 中所示序列类似，纵轴上的 A 表示丙氨酸（Ala）依次替换图 4A第一行中给定序列的每个位置。同样地，第二&#160;行中精氨酸依次替换每个氨基酸，其余氨基酸依此类推。通过系统地将所提供肽底物序列中的每个残基替换为其他所有天然存在的氨基酸残基，合成完整的肽阵列文库，这有助于理解每个位置上各个残基的影响。</li>
		<li>或者，可通过合成包含目标肽以及阳性和阴性甲基化对照（即已知可甲基化或已知不可甲基化的肽）的肽文库，轻松验证已知或预测肽底物的甲基化情况。通过将假定的目标赖氨酸替换为丙氨酸来合成肽，以确认目标赖氨酸的甲基化，如下所示，通过手动编程实现。 
		野生型肽：S T G G K P R Q F L 
		突变肽：S T G G A P R Q F L 
		注：该软件还内置脚本，可用于创建多种文库，例如通过设定期望的移码来绘制序列以定位相互作用所需的关键氨基酸的表位定位文库。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜、氨基酸及试剂的准备
	<ol>
		<li>将 SPOT 膜在 DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中预溶胀 10 分钟，然后将湿润的膜置于 SPOT 合成仪框架上，确保无气泡或皱褶。</li>
		<li>用 100% 乙醇洗涤膜三次。在开始合成程序前，将膜完全干燥至少 10 分钟。</li>
		<li>同时，将市售的 Fmoc 保护氨基酸溶于 NMP 中，新鲜配制 0.5 M 的工作浓度，并按照表 1所述配制活化剂和碱液。</li>
		<li>确保 SPOT 合成仪的所有废液容器均已清空，并用 DMF、乙醇和哌啶重新填充溶剂储液罐。 
		注：此时仪器已准备好进行合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一个氨基酸的点样
	<ol>
		<li>为了与膜上的游离氨基形成酰胺键，通过向氨基酸衍生物中加入活化剂（N,N’-二异丙基碳二亚胺）和碱溶液（乙氧基羟基氰乙酸酯）来活化 incoming 氨基酸的羧基。</li>
		<li>使用可编程机器人将活化后的氨基酸按所需体积点样到氨基-PEG 功能化的膜上。 
		注：由此，氨基酸的 C-末端与膜的氨基发生偶联。</li>
		<li>重复此步骤三次，以确保第一个活化氨基酸的偶联更充分。将膜孵育 20 分钟，然后用 DMF 洗涤以去除未偶联的氨基酸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>非点样区域空余位点的封闭 
	注：在所有肽的 C-末端第一个氨基酸与膜的氨基偶联后，点样区域之间的氨基以及部分点样区域内的氨基未与氨基酸形成键合。
	<ol>
		<li>通过用封闭液（20% 乙酸酐的 DMF 溶液）孵育 5 分钟，封闭这些游离的氨基。 
		注：这可避免在后续循环中氨基酸与膜直接偶联，而非与生长中的肽链偶联。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除 Fmoc 保护基
	<ol>
		<li>封闭后，用 DMF 洗涤膜 4 次，然后用 20% 哌啶的 DMF 溶液孵育 20 分钟，以去除 Fmoc 保护基。 
		注：此步骤导致氨基保护基 Fmoc 的去除，称为去保护。</li>
		<li>随后，用 DMF 洗涤两次，乙醇洗涤两次，并让其干燥。 
		注：此时膜已准备好进行下一个氨基酸的偶联。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肽链延伸 
	注：每个氨基酸的添加称为一个循环。除第一个氨基酸的偶联外，每个循环均始于已偶联氨基酸的 Fmoc 基团的去保护，随后是 incoming 氨基酸的活化羧基与生长中肽链氨基的偶联。
	<ol>
		<li>重复步骤 1.3 和 1.5，直至达到所需的肽链长度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色 
	注：在最后一个循环结束后，使用溴酚蓝对肽阵列进行染色，以确认肽的成功合成。溴酚蓝可与肽的游离氨基结合。染色后，肽点呈现浅蓝色，但斑点强度因肽序列而异。该染色可用于确认哌啶是否完全去除，因为在哌啶存在时溴酚蓝无法染色肽。此外，该步骤也有助于标记肽阵列以便后续使用。
	<ol>
		<li>在最后一次合成循环中完成 Fmoc 去保护后，用 DMF 和 100% 乙醇洗涤膜。然后，用溴酚蓝（DMF 中含 0.02% 溴酚蓝）处理膜至少 5 分钟，直至膜完全变为蓝色。</li>
		<li>随后，用 DMF 和乙醇洗涤，再干燥 10 分钟。现在将膜从合成仪中取出，并手动进行侧链去保护（第 1.8 节）。如有需要，可拍摄膜图像以记录肽合成结果（图 2）。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>侧链去保护
	<ol>
		<li>用 20 至 25 ml 的侧链去保护混合液处理膜，该混合液由 95% 三氟乙酸（TFA）组成，用于裂解侧链保护基团，另含 2.5% 水和 2.5% 三异丙基硅烷作为清除剂，以保护氨基酸侧链在此步骤中不被修饰。取足够体积的去保护混合液，确保其完全覆盖膜，并置于密闭的耐化学腐蚀盒中，轻轻振荡孵育 1 至 2 小时。</li>
		<li>用 20–25 ml 的二氯甲烷（DCM）洗涤膜六次，每次 2 分钟，最后用 100% 乙醇洗涤两次，并在干燥器中干燥过夜。 
		注：现在膜可用于实验。肽阵列合成的示意图见图 1。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质表达与纯化
<ol>
	<li>PKMTs 的 GST 融合蛋白表达
	<ol>
		<li>使用标准技术，将编码全长 PKMT 或其催化结构域的基因克隆至细菌表达载体（如 pGEX-6p2）中，以表达为 GST 融合蛋白。</li>
		<li>通过热激法或其他方法，将含有目标 PKMT 插入片段的载体转入 BL21 或 BL21 Codon Plus E. coli 细胞中。</li>
		<li>在表达当天，准备 30 ml 的 Luria-Bertani（LB）培养基作为预培养物，并在 37 °C 下持续振荡培养 7 至 8 小时。</li>
		<li>随后，将 10 ml 预培养物转移至含有 1 L LB 培养基的 2 L 带挡板摇瓶中，在 37 °C 下持续振荡培养，直至菌液在 600 nm 处达到预定的光密度。 
		注：虽然每种蛋白均可优化条件，但我们通常在 OD600nm 约为 0.8 时进行诱导。诱导温度需针对每种蛋白单独优化，部分蛋白在 22 °C 下表达良好，而另一些则在较高温度下表现更佳。</li>
		<li>将细胞在诱导温度下预平衡 15 分钟，然后加入 1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）进行诱导，并在诱导温度下继续培养 10–12 小时。</li>
		<li>之后，于 5,000 × g 离心 15 分钟收集细胞，用 30 ml STE 缓冲液（10 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl 和 0.1 mM EDTA）洗涤沉淀，并于 -20 °C 保存以供后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白纯化&#160;
	<ol>
		<li>解冻细胞沉淀，加入 30 ml 超声破碎缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM DTT 和 5% 甘油）重悬，通过超声破碎处理。 
		注：该缓冲液需根据具体蛋白进行优化。</li>
		<li>将细胞裂解物在 22,000 × g 下离心 1 小时，收集上清液并过柱，柱中装有 600 µl 谷胱甘肽 Sepharose 4B 树脂。</li>
		<li>先用 50 ml 超声破碎缓冲液洗涤柱子，再用 100 ml 高盐缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、500 mM NaCl、1 mM DTT 和 5% 甘油）洗涤，以去除非特异性结合的蛋白；随后用含 40 mM 谷胱甘肽的 5 ml 高盐缓冲液洗脱结合的蛋白。</li>
		<li>将洗脱的蛋白在 2 L 低甘油透析缓冲液（20 mM Tris pH 7.4、100 mM KCl、0.5 mM DTT 和 10% 甘油）中透析 2 小时，随后在 20 mM Tris pH 7.4、100 mM KCl、0.5 mM DTT 和 70% 甘油中继续透析 8 小时或过夜。确保所有纯化缓冲液均预冷至 4 °C，并在低温环境中进行蛋白纯化操作，以避免蛋白变性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肽阵列甲基化
<ol>
	<li>肽阵列的预孵育
	<ol>
		<li>为避免浪费酶和昂贵的放射性标记AdoMet，可在适当大小的盒子或塑料袋中进行肽阵列甲基化。将肽阵列膜置于密封塑料袋中，加入相应的甲基化缓冲液（不含酶和标记的[methyl-3H]-AdoMet），预孵育10分钟。缓冲液体积取决于阵列大小，例如，全特异性谱肽阵列使用8 ml甲基化缓冲液。针对每种酶优化AdoMet的用量和浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肽阵列的甲基化
	<ol>
		<li>弃去预孵育缓冲液，将膜转移至含有相应PKMT和标记[methyl-3H]-AdoMet的8 ml甲基化缓冲液中，孵育1至2小时。 
		注意：甲基化反应所需的酶量取决于特定PKMT的活性，我们通常以50 nM的终浓度开始筛选实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肽阵列的洗涤
	<ol>
		<li>随后将甲基化缓冲液弃入放射性废物容器中，并用20 ml含100 mM碳酸氢铵和1% SDS的缓冲液洗涤肽阵列5次，每次5分钟，以去除结合的蛋白质。每次洗涤后的缓冲液均应弃入放射性废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>放射性信号的检测
	<ol>
		<li>洗涤后，将膜置于10 ml扩增液（NAMP100V）中孵育5分钟&#160;。</li>
		<li>然后将扩增液倒入有机溶剂类放射性废物容器中，将肽阵列密封于塑料袋内，并放入放射自显影盒中。</li>
		<li>在暗室中将放射自显影胶片置于肽阵列上，小心闭合胶片盒，并在-80 °C下曝光适当时间。随后显影胶片以分析结果。对强甲基化的肽底物，应使用不同的曝光时间多次成像，以避免信号饱和。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据处理与分析
<ol>
	<li>斑点强度的密度分析
	<ol>
		<li>使用常规扫描仪扫描膜，并通过密度测定法分析斑点强度。可使用免费软件 ImageJ 或商业软件进行分析。 
		注：我们使用 Phoretix 软件完成此任务。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不同膜实验结果的归一化与平均处理
	<ol>
		<li>肽阵列甲基化实验至少重复三次。对每次实验的扫描信号强度进行背景扣除，并将参考底物的活性设为 1.0，进行归一化处理。对各个斑点的数据取平均值，并以均值 ± 标准差的形式报告结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析与展示
	<ol>
		<li>使用灰度或彩色方案，以二维图形式绘制数据，表示相对活性水平。可使用 Excel 或 Sigmaplot 软件完成，如图所示。同时，绘制重复实验标准差分布图，以评估数据质量。</li>
		<li>为定量比较并展示蛋白赖氨酸甲基转移酶（PKMT）对底物肽中每个残基识别的精确性，可通过区分因子 D16,17 计算其在位置 x 对特定氨基酸 i 的相对偏好程度： 
		DX;i = &#60; Vj≠i&#62;/Vi - 1 
		其中 vi 表示在位置 x 携带氨基酸 i 的肽变体的甲基化速率，&#60;vj≠i&#62; 表示在位置 x 携带其他任意不同氨基酸 j≠i 的全部 19 种肽（包括野生型序列）甲基化速率的平均值。 
		注：该定义的区分因子依赖于背景水平。若在某一位置仅有一种残基被接受，且背景为 3%，则可得到 32.3 的区分因子。若在某一位置无偏好性，则区分因子为 0。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li>
<li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep%3A+thinking+outside+the+histone+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li>
<li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li>
<li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhosphoSite%3A+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li>
<li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li>
<li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li>
<li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li>
<li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+arrays+on+cellulose+support%3A+SPOT+synthesis%2C+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li>
<li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li>
<li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li>
<li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li>
<li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+application+of+peptide+arrays%3A+quo+vadis+SPOT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+EuropeanJournal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li>
<li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).</li>
<li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li>
<li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7%2F9+protein+lysine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).</li>
<li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).</li>
<li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scansite+2.0%3A+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li>
<li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+%28CDR%29%3A+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li>
<li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+synthesis%3A+observations+and+optimizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Res%22%5BJournal%5D)">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li>
<li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li>
<li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li>
<li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述的SPOT合成是一种用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用位点以及研究肽修饰酶底物识别的有力方法。然而，SPOT合成仍存在某些局限性，因为尽管已有报道表明通过SPOT方法合成的肽纯度超过90%21，但在每次实验中都难以确认其实际纯度。因此，必须通过其他方法对结果进行验证，例如使用蛋白质结构域或采用标准方法合成的纯化肽。此外，SPOT芯片的另一主要缺点是大多数情况下无法重复使用同一张芯片进行多个实验。
为了提高使用稳定性较低的氨基酸（如受保护的精氨酸）进行合成的效率，建议每进行5个循环就重新制备一次。在酶促反应或蛋白质结合研究中，常常观察到肽点的边缘信号强度高于中心区域（“环状斑点效应”）。这种效应可能是由于肽点中心区域肽的密度较高所致，可通过降低肽合成规模来解决22。如遇其他肽合成问题，应参考仪器操作手册或联系厂商技术服务。若未观察到甲基化现象，应在膜上添加阳性对照肽（即已知可被所研究酶甲基化的肽）。
除了SPOT芯片外，还可使用高密度肽微阵列23</su...

在过去的二十年中，多项研究证明了翻译后修饰（PTM）在细胞发育以及癌症等多种疾病中的重要性。近年来，蛋白质赖氨酸甲基化作为一种关键的翻译后修饰受到广泛关注。最初发现组蛋白赖氨酸甲基化是一种重要的染色质标记，后续研究进一步表明，多种非组蛋白也可发生赖氨酸甲基化1-4。甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸逐级转移至赖氨酸残基的ε-氨基上，这一过程由一类称为蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）的酶催化，人类基因组中包含超过60种此类蛋白。PKMTs最初被发现是能够甲基化特定赖氨酸残基的组蛋白修饰酶，但后续研究证实它们也可甲基化多种非组蛋白5。迄今为止，已在不同蛋白质上鉴定了约5000个赖氨酸甲基化位点6，但负责这些修饰的具体酶类往往尚未明确。其中一个原因是大多数PKMTs的底物特异性尚未得到系统研究。因此，不断有新的PKMTs底物被发现。对PKMTs底物特异性的认识不足，限制了对其生物学功能和作用机制的理解。为了深入研究某种PKMT的底物特异性，需要测量并比较大量仅在一个或少数几个氨基酸上存在差异的肽段底物的甲基化速率，这一过程最适合通过肽阵列技术来实现。基于所得的特异性谱型，可进一步识别出PKMTs的潜在底物，并开展后续研究。
多肽阵列是广泛用于抗体、多肽修饰酶的生化分析以及蛋白质-蛋白质相互作用位点（抗体-抗原、受体-配体）定位的研究工具7-9。此类应用通常需要合成数百条多肽。目前已有多种多肽合成方法，其中基于树脂的多肽合成应用十分普遍，但其通量较低且成本相对较高。Frank 及其同事提出的 SPOT 合成法解决了上述问题10。SPOT 合成法能够并行合成数百条多肽，平均成本低于树脂合成法。在纤维素膜上合成的多肽可直接用于多种实验，也可从膜上切割下来作为游离多肽用于溶液中的检测，或用于制备多肽微阵列10-13。
SPOT合成是固相肽合成的一种变体，采用纤维素膜作为固相载体，并使用标准的Fmoc化学方法10-13。因此，肽链的合成从C端开始，向N端延伸，这与核糖体中的生物合成方向相反。纤维素膜经过功能化处理，用于固定第一个活化的氨基酸（图1）。SPOT方法基于自动化移液系统，将活化的氨基酸以溶剂液滴的形式依次递送至膜上特定位置的点位。液滴被释放到多孔膜上后形成圆形湿润区域，随后作为肽合成中化学反应的开放式反应器。点位的大小由液滴体积和膜的吸液能力决定，多个点位可排列成阵列。合成规模与点位大小及膜的负载能力相关。通过调节点位大小，可控制点位之间的间距和阵列密度。纤维素膜作为肽合成中的固相载体具有多种优势：成本低廉、耐受肽合成中使用的化学试剂、在水溶液中稳定且易于操作。此外，其亲水性使其适用于多种生物检测系统。SPOT合成可根据所需肽的数量手动或自动化进行（适用于数千种肽）。我们的应用中使用的是德国科隆Intavis公司生产的全自动SPOT合成仪，该仪器支持不同数量和长度的肽合成。通常线性肽的长度为15至20个氨基酸，此外也可通过逐步合成制备最长达42个氨基酸的肽14,15。然而，随着氨基酸数量的增加，整体偶联产率会降低，从而影响肽的质量。由于每个点位产生的肽量较少，产物通常难以纯化，单个肽的质量也难以准确评估。因此，SPOT肽阵列所得结果需通过以下方式验证：使用标准方法大规模合成相应肽，经纯化并按照肽合成标准进行分析；或合成包含目标肽序列的蛋白质。尽管如此，我们发现SPOT合成具有高度可靠性，结果通常可重复。SPOT合成不仅限于蛋白源性氨基酸，还可使用多种 commercially available 的修饰氨基酸，从而可在侧链保护基团最终裂解前后对肽进行修饰，并可引入磷酸化、甲基化或乙酰化的氨基酸11。
通过SPOT方法合成的固定化肽库可直接用于多种生物学和生物化学检测。我们采用包含300至400个肽的肽芯片来研究PKMTs的底物特异性。在酶促修饰过程中，将肽芯片与相应的PKMT及标记的[methyl-3H]-AdoMet在适当的缓冲液中共同孵育。通过放射自显影技术检测AdoMet上的放射性标记甲基基团向肽底物的酶促转移情况，从而分析相应底物的甲基化水平（图3）。该方法可同时研究不同肽底物的甲基化。此方法的一个重要优势在于，所有肽均处于竞争性甲基化状态，因此在甲基化动力学的线性阶段，每种肽的相对甲基化水平与酶对该肽底物的催化速率常数除以解离常数（kcat/KD）成正比。因此，每个点中掺入的放射性信号量直接反映了酶对特定肽的催化活性。根据肽芯片甲基化实验的结果，可定义PKMT的特异性谱型，并据此预测新的底物。肽芯片可在肽水平上快速且经济高效地验证新底物的甲基化。为此，制备的芯片应包含预测的新底物肽，以及在目标位点用丙氨酸（Ala）取代赖氨酸（Lys）的突变肽，同时包括阳性和阴性对照肽。最终，可将新发现的底物以蛋白质形式表达，并构建目标赖氨酸突变为丙氨酸的突变体，进而在蛋白质水平上确认其甲基化。根据实验结果，后续可开展生物学研究，探讨这些新鉴定蛋白质底物甲基化的潜在功能。

<table><tbody><tr><td>乙醇 abs 梯度级 HPLC</td><td>霍尼韦尔</td><td>10299901</td><td>易燃</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;二甲基甲酰胺 肽合成</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>哌啶 &amp;ge;99% 用于多肽合成</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>易燃、有毒、腐蚀性</td></tr><tr><td>Oxyma Pure（乙基（羟基亚氨基）氰基乙酸酯）</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;二异丙基碳二亚胺 purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>易燃、有毒、腐蚀性</td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>易燃、有毒、腐蚀性</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>二氯甲烷 &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>致癌的</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;N-甲基-2-吡咯烷酮</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>衍生化纤维素膜</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠颗粒</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>有毒，易燃</td></tr><tr><td>MultiPep 合成仪</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM 高性能胶片</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix 软件</td><td>TotalLab</td><td>无</td><td></td></tr></tbody></table>

利用spot肽阵列分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶的特异性

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

赖氨酸甲基化是一种新出现的翻译后修饰，已在多种组蛋白和非组蛋白上被发现，在细胞发育及多种疾病中发挥关键作用。目前已在不同蛋白质上鉴定了约5000个赖氨酸甲基化位点，这些修饰由数十种蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMT）催化形成。这表明每种PKMT可甲基化多种蛋白质，但迄今为止，其中许多酶仅发现一到两个底物。为解决这一问题，我们引入了基于肽阵列的PKMT底物特异性分析方法。肽阵列是表征PKMT特异性的有力工具，因为可在同一阵列上测试多种不同序列底肽的甲基化情况。我们使用Intavis SPOT合成仪在纤维素膜上合成了肽阵列，并分析了多种PKMT的特异性。根据实验结果，我们为其中多种酶鉴定了新的底物。例如，通过肽阵列研究NSD1发现，该酶甲基化H4的K44位点，而非此前报道的H4K20位点；此外，H1.5K168是其高度优先的底物，而非先前已知的H3K36。因此，肽阵列是生化表征PKMT的有力工具。

多肽阵列已成功用于生化表征蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMT）的特异性，并通过该方法鉴定出多个新的组蛋白及非组蛋白底物5,16-19。确定一种PKMT（或任何酶）正确的底物谱是理解其分子机制和细胞功能的关键步骤。
作为肽段SPOT阵列甲基化方法应用的一个示例，我们描述了NSD1 PKMT特异性分析的结果19。在本研究之前，该酶被报道可甲基化多个底物，包括组蛋白H3的K36位点和组蛋白H4的K20位点，以及NF-κB家族转录因子p65的K218和K221位点。图4A展示了一个使用NSD1进行肽阵列甲基化反应的示例。在该实验中，基于H3（31-49）序列合成了一个大型肽阵列，其中包含了原始序列中每个氨基酸位置所有可能的单个氨基酸替换，以检测每个氨基酸对NSD1结合和甲基化的重要性。总共合成了380种肽段（20种可能的氨基酸 × 18个残基，加上每行中的一个原始H3序列）。横轴表示肽段的序列，纵轴表示在相应肽段中被替换的氨基酸。例如，第17行第4列的斑点在其第三位含有苏氨酸，取代了野生型序列中存在的甘氨酸（<st...

通过SPOT方法合成的多肽阵列可用于分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）的底物特异性，并确定PKMTs的底物谱，从而理解其生物学功能。本实验方案描述了如何合成多肽阵列，使用PKMTs进行甲基化反应，并对结果进行分析。

利用SPOT肽阵列分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶的特异性

赖氨酸甲基化是一种新近发现的翻译后修饰，已在多种组蛋白和非组蛋白上被鉴定，其在其中发挥……

以下实验的总体目标是研究蛋白质赖氨酸甲基转移酶（protein lysine methyl transferases，PKMTs）的底物特异性。该目标通过鉴定一个初始底物，并制备包含该底物在不同位置进行单个氨基酸替换的多种变异体的肽阵列来实现。第二步，将肽阵列与PKMT在放射性甲基供体存在下孵育，从而通过放射性标记转移至相应肽点来检测肽的甲基化。接下来，将芯片暴露于X射线胶片并进行定量分析，以确定每种肽段上的甲基化活性。为了定义PKMT的特异性谱型，实验结果可揭示底物肽段中哪些氨基酸对PKMT介导的甲基化至关重要。该技术相较于现有方法（如单个肽段的甲基化检测）的主要优势在于，可在一次实验中以成本效益较高的方式同时检测多种不同的肽段。该方法有助于解答蛋白质赖氨酸甲基化领域的关键问题，例如鉴定先前未知的新型 PK mtss 底物。因此，该方法可为 PK mts 的特异性提供深入见解。此外，该方法还可应用于其他体系，如蛋白激酶、其他蛋白质甲基转移酶、转移酶或修饰转移酶。当我了解到利用多肽斑点合成法可以以合理成本制备大规模定制多肽阵列时，首次产生了本方法的构想。开始该实验前，使用 Multi Pep Spotter 软件设计用于合成的多肽序列，以单字母编码输入多肽序列，每个字母代表特定的氨基酸。随后，将氨基聚乙二醇功能化的斑点膜在 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中预溶胀 10 分钟。完成后，将湿润的膜置于斑点合成仪框架上，确保无气泡或皱褶。在开始合成程序前，将膜完全干燥至少10分钟。用100%乙醇洗涤膜三次，以与膜上的游离氨基形成酰胺键。通过向氨基酸衍生物中加入二异丙基碳二亚胺（DIC）和乙基羟基氨基乙酸酯，活化进入的氨基酸的羧基。活化后，使用可编程机器人将所需体积的活化氨基酸点样到氨基PEG功能化的膜上。重复上一步骤三次，以确保第一个活化氨基酸的充分偶联。将膜孵育20分钟后，用DMF洗涤，以去除未偶联的氨基酸，并在干燥后封闭游离的氨基基团。用DMF洗涤膜四次，然后在DMF中加入20%哌啶孵育20分钟，以去除FM保护基团。洗涤并干燥膜后，重复点样和F MOC去除步骤，直至获得目标肽链长度。在最后一次F MOC基团脱保护后，用DMF和100%乙醇洗涤膜。然后用含0.02%溴酚蓝的DMF溶液处理膜，至少五分钟，直至膜完全变为蓝色。洗涤并干燥膜后，将其从合成仪中取出，放入耐化学腐蚀的盒子中。加入20至25毫升侧链D保护基去除混合液进行处理，该混合液含有95%三氯乙酸，用于裂解侧链保护基，同时加入捕获试剂以防止氨基酸侧链被修饰。确保深层保护混合液完全覆盖膜后，彻底封闭盒子，并在孵育后轻轻振荡孵育一至两小时。用20至25毫升二氯甲烷洗涤膜六次，每次两分钟。用100%乙醇洗涤两次后，将膜置于干燥器中过夜干燥。接下来，将肽阵列膜置于密封的塑料袋中，加入不含酶但含有放射性标记甲基基团的相应甲基化缓冲液，预孵育10分钟。弃去预孵育缓冲液后，将膜在8毫升含有相应PKMT的甲基化缓冲液中孵育1至2小时。随后，将甲基化缓冲液倒入放射性废物容器中弃去，并用20毫升含有100毫摩尔碳酸氢铵和1% STS的缓冲液洗涤肽阵列5次，每次5分钟，以去除结合的蛋白质。将最后一次洗涤缓冲液倒入放射性废物容器后，将膜在10毫升扩增溶液中孵育5分钟。然后将扩增溶液弃置于有机溶剂的放射性废物容器中。将肽阵列密封在塑料袋中，并放入自显影暗盒内。在暗室中将自显影胶片放置于肽阵列上。然后小心关闭暗盒。在–80摄氏度条件下曝光胶片后，进行显影以分析结果。最后，使用不同的曝光时间多次采集图像，以避免强甲基化肽底物信号过饱和。此处展示了一个使用 NSD1 对肽阵列进行甲基化反应的示例。横轴代表肽的序列，纵轴显示实验结果。被修饰的氨基酸表示为经 NSD1 甲基化修饰；该结果表明 NSD1 特异性作用于 H3K36，并识别目标赖氨酸两侧的三至四个氨基酸残基。此处展示了三次 NSD1 肽阵列实验的整合结果。约85%的肽段显示的标准偏差小于±20%，超过97%的肽段显示的标准偏差小于±30%。计算得到的区分因子数据显示，NSD1在-2位点偏好芳香族残基，在-1和+2位点偏好疏水性残基，而在+1位点则偏好精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。通过搜索人类蛋白质组数据库，可以找到潜在的新型肽底物。其中一些肽与ome发生强烈甲基化反应，证实其为新型NSD1肽底物。在尝试该实验流程时，重要的是要牢记使用最合适的初始底物，并遵循本实验方案。还可以通过体外及细胞内对应蛋白质的甲基化等其他方法，来验证蛋白质是否可被接受为底物，尤其是在该技术建立之后。该技术为蛋白质赖氨酸甲基转移酶领域的研究人员提供了途径，用以确定多种PK甲基转移酶的底物特异性，并鉴定出多个新的底物，从而有助于理解PK甲基转移酶的重要生物学功能。请注意，在肽合成过程中使用放射性物质和有机溶剂可能存在风险，进行该操作时必须始终采取适当的防护措施。

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

蛋白赖氨酸甲基转移使用SPOT肽阵列特异性分析

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

我们介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离质谱结合还原性甲基化化学方法来定量分析赖氨酸甲基化变化的技术。...

MassSQUIRM 定量检测赖氨酸去甲基化酶活性的应用

本视频展示了一种应用多肽微阵列技术来分析识别组蛋白多肽上翻译后修饰（PTM）的抗体特异性的方法。将含有已知PTM组合的固定化荧光染料标记组蛋白多肽的微阵列芯片与靶向PTM特异性抗体孵育。该过程有助于确定抗体对靶标PTM的特异性及其与非靶标PTM之间潜在的交叉反应性。...

一种用于抗体特异性分析的多肽微阵列技术

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

多肽阵列筛选是一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点的高通量检测方法。该方法可实现对目标蛋白质多种相互作用的定位，也可用于发现靶向该蛋白质的抑制剂作用位点。本文中，我们描述了一种多肽阵列筛选与分析的实验方案。...

利用肽阵列鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点

本文描述了将肽微阵列技术应用于识别组蛋白及其翻译后修饰的抗体特异性分析的方法。...

利用肽微阵列分析组蛋白抗体特异性

本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）测定粗鼠组织提取物中蛋白酶特异性的实验方案。...

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定小鼠组织提取物中蛋白酶特异性的方法：调控pH值以诱导特异性改变

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

本文介绍了一种基于加热灭活的样品制备方法，用于保护内源性肽段以避免死后降解，随后采用同位素标记结合液相色谱-质谱法（LC-MS）进行相对定量。...

用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

本文描述了一种神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学方案，用于表征人诱导多能干细胞来源神经元中动态的溶酶体微环境。该方法可在活体人神经元中以优异的细胞内空间分辨率，准确量化溶酶体膜蛋白以及与溶酶体稳定或 transiently...

利用邻近标记蛋白质组学表征神经元溶酶体相互作用组

了解使用SPOT肽阵列分析蛋白赖氨酸甲基转移酶底物特异性的方法。该技术可同时检测多种肽段变体，帮助研究人员高效鉴定关键氨基酸位点并解析PKMT的生物学功能。

利用SPOT肽阵列分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶的特异性

探索更多视频