一个体外急性脑片的少突胶质细胞定向T细胞攻击模式
February 5th, 2015
为了解决炎症性脱髓鞘疾病皮质病变中脱髓鞘和神经元凋亡的机制，使用了不同的动物模型。我们在这里描述了一种离体方法，通过在脑切片上使用少突胶质细胞特异性 CD8 + T 细胞，导致少突胶质细胞和神经元死亡。讨论了该模型的潜在应用和局限性。
该程序的总体目标是研究离体 CD 8 T 细胞的少突胶质细胞定向攻击。这是通过首先从小鼠的脾脏中分离 CD 8 T 细胞来实现的。第二步是准备急性脑切片。
然后将脑切片与活化的 CD 8 T 细胞孵育长达 6 小时，然后进行冷冻保存和组织学研究。最终，免疫荧光显微镜可用于研究 T 细胞的位置以及少突胶质细胞的凋亡。与现有技术（如实验性自身免疫性脑脊髓炎，一种轻度硬化症的动物模型）相比，这种方法的主要优点是神经元损伤。
CD 8 后可以详细研究 8 介导的少突胶质细胞攻击。这种方法可以帮助回答神经免疫学领域的关键问题，例如组织中的免疫细胞运输，或神经元和少突胶质细胞的退化。演示该程序的是我实验室的研究生 Alexander Hamman，在准备脑切片前 5 天刺激 OT one T 细胞激活细胞。
首先，按照视力方案去除几只 O OT one 转基因小鼠的脾脏。将脾脏收集在新鲜制备的补充培养基中。接下来，通过 70 微米过滤器捣碎脾脏来制备单细胞悬液，然后在 4 摄氏度下以 300 Gs 离心悬浮液 5 分钟。
离心后，倒出上清液，将细胞重悬于 5 ml 氯化铵钾缓冲液中。让细胞在 4 摄氏度的缓冲液中孵育 5 分钟，以裂解红细胞。然后通过在 4 摄氏度下加入 10 毫升补充培养基来结束反应。
接下来，像以前一样通过旋转细胞来再次收集细胞。然后收集沉淀的细胞，复苏，将它们悬浮在培养基中，并在已知其密度时对其进行计数。以每孔 3000 万个细胞的速度将细胞转移到 12 孔板中。
然后添加含有 OVA 和白细胞介素 2 的培养基，并将细胞孵育 4 天。四天后，以每毫升 500 单位的浓度添加更多白细胞介素 2。然后将细胞孵育另一天。
现在使用 CD 8 阳性 T 细胞分离试剂盒，从培养细胞中纯化 O OT one T 细胞。简要。使用抗体混合物去除非 CD 8 阳性细胞，并使用磁柱分离。在此过程中，在冰上制备样品，并确保反应仅涉及单个细胞，这样色谱柱就不会堵塞。
然后对细胞进行计数。对于这个实验。有 8 到 10 周龄的转基因小鼠，O-D-C-O-V-A，小鼠和年龄和性别匹配的 C 57 黑色六对照。
像往常一样，将小鼠安置在无病原体的环境中，可以自由获得食物和水。麻醉小鼠后，使用后爪捏评估麻醉水平，然后立即对其进行安乐死。现在将鼠标放置在腹侧并消毒头皮并将其斩首。
接下来，快速切开头皮，打开颅骨，挖出大脑。用胶水将大脑固定到位，然后将其转移到振动板上。然后在盘子里装满冰冷的生理盐水。
准备好后，切成 300 微米的薄片。将切片转移到装有 A CSF 的 12 或 24 孔板的各个孔中。然后小心地向每个切片中加入五十万个 OT 一 T 细胞。
五十万个活化细胞个性化提供良好的细胞细胞相互作用。一旦细胞，细胞就开始迁移到切片中。同时，细胞数量不会太高而不会诱导过度反应，因此单细胞计数是可行的。
加载所有孔后，在孵育后将共培养物孵育长达 8 小时，收获切片并将其包埋在 OCT 化合物中。然后将包埋的切片冷冻在液氮中，并储存在零下 20 摄氏度以用于进一步的组织学研究。在脑切片与少突胶质细胞定向的 CD 8 阳性 T 细胞孵育后，少突胶质细胞发生凋亡。
神经元也经历了细胞凋亡。细胞凋亡的最早迹象是在孵育 3 小时后看到的，并且在 8 小时时变得强烈。暴露于 OT one T 细胞的 O-D-C-O-V-A 细胞比任何其他情况都更明显。
按照此程序，可以应用其他方法来回答有关 T 细胞迁移行为或离子通道参与您自己的实验室上睑下垂的问题。看完这个视频，你应该对如何制备急性脑切片以及如何将它们与 T 细胞共培养有一个很好的了解。
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概述
本研究使用一种带有少突胶质细胞特异性CD8 + T细胞的离体模型来调查皮质病变中脱髓鞘和神经元凋亡的机制。该方法允许在受控环境中检查少突胶质细胞和神经元的死亡。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 神经退行性疾病
背景
- 脱髓鞘是炎症性脱髓鞘疾病的一个关键特征。
- CD8 + T细胞在影响少突胶质细胞的免疫反应中起作用。
- 了解这些相互作用可以为治疗策略提供信息。
- 现有的模型可能无法完全复制这些疾病条件下观察到的神经元损伤。
研究目的
- 探索CD8 + T细胞攻击少突胶质细胞的离体效应。
- 在受控环境中评估由此引起的神经元凋亡。
- 讨论该模型的潜在应用和局限性。
使用的方法
- 从小鼠脾脏中分离CD8 + T细胞。
- 为实验准备急性脑切片。
- 将脑切片与活化的CD8 + T细胞孵育最多六小时。
- 利用免疫荧光显微镜分析T细胞位置和少突胶质细胞凋亡。
主要结果
- 证明了T细胞暴露后少突胶质细胞和神经元的死亡。
- 突出了该模型相对于传统方法的优势。
- 提供了免疫介导的神经元损伤动态的见解。
- 确定了将研究结果转化为体内条件的潜在局限性。
结论
- 该离体模型有效地模拟了T细胞介导的少突胶质细胞损伤。
- 需要进一步的研究来探索治疗干预。
- 这种方法可以增强对脱髓鞘疾病的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This ex vivo model enables mechanistic de-risking of oligodendrocyte-targeted immunotherapies by isolating CD8+ T-cell-mediated neuronal damage in acute brain slices. It supports target validation in neuroinflammatory discovery by providing quantitative, time-resolved readouts of oligodendrocyte and neuron apoptosis. The approach improves predictive confidence in early discovery by decoupling direct oligodendrocyte effects from secondary neurodegeneration in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding oligodendrocyte-specific CD8+ T-cell attack mechanisms in grey matter lesions.
- Operational Value: Enables biological de-risking by isolating collateral neuronal death as a direct consequence of oligodendrocyte-directed immune activity.
- Scientific Value: Supports predictive confidence through time-resolved apoptosis measurements (onset at 3 hours, robust at 8 hours) in O-D-C-O-V-A versus control conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices with myelin and neurons) for downstream immunomodulator screening.
- Operational Value: Addresses assay standardization via defined incubation periods (up to 8 hours) and reproducible apoptotic readouts using immunofluorescence microscopy.
- Scientific Value: Highlights screening readiness through quantifiable oligodendrocyte and neuron apoptosis as dependent variables for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by modeling cortical and subcortical grey matter lesion pathology in inflammatory demyelinating disorders.
- Operational Value: Describes translational continuity from ex vivo mechanism elucidation to preclinical model refinement for demyelinating disease therapeutics.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by enabling mechanistic dissection of immune-mediated neuronal damage timelines.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within the discovery continuum from target validation through lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of oligodendrocyte-directed T-cell mechanisms and pathway clarification of immune-mediated neurodegeneration.
- Screening: Describes assay readiness through standardized brain slice preparation and quantitative apoptosis readouts enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Highlights measurements of oligodendrocyte and neuron apoptosis via immunofluorescence microscopy as key outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by modeling grey matter lesion pathology relevant to demyelinating disease progression.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for iterative target validation across immunomodulator candidates in neuroinflammatory discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in oligodendrocyte-neuron crosstalk during immune attack.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of acute brain slice co-culture with defined T-cell dosing (0.5 million cells/slice).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by isolating collateral neurodegeneration mechanisms early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on time-resolved apoptosis data in disease-relevant grey matter systems.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroimmunology, brain slice preparation, and immunofluorescence microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include vibratome, cryostat, fluorescence microscopy, and T-cell isolation kits.
- Cross-team standardization requirements for slice viability, T-cell activation protocols, and apoptosis quantification thresholds.
- Adaptation considerations across model systems including transgenic versus wild-type strains and humanized immune cell co-cultures.
- Practical limitations supported by source material include ex vivo constraint limiting long-term dynamic studies and potential variability in slice quality affecting reproducibility.
