通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

本实验的目的是利用基于电穿孔的方法，将带有有机荧光染料标记的DNA或蛋白质等生物分子导入活体微生物内部并进行可视化观察。该过程首先将电转感受态细胞与荧光标记的生物分子共同孵育，然后将其转移至电穿孔杯中。通过在电穿孔杯两端施加高电压，可在细胞壁和细胞膜上形成瞬时孔隙，从而促进生物分子扩散进入细胞内。

接下来，将细胞在富含营养的培养基中孵育，使其恢复，然后去除未被内化的过量生物分子。最后，将细胞转移至低荧光最小营养琼脂垫上，再覆盖一片玻璃盖玻片，形成玻璃-琼脂三明治结构。最终，利用全内反射荧光显微镜分析活细胞内标记生物分子的定位、扩散模式及动态特性。

当我们意识到活细胞成像技术的局限性时，首次提出了该方法。由于GFP等光致荧光蛋白存在快速荧光闪烁的问题，我们推断，若将带有有机荧光染料标记的生物分子导入活细胞，即可在活体微生物中实现标记。该荧光染料的主要优势在于其高亮度、光稳定性和小分子尺寸。

我们随后希望在更长时间尺度上追踪DNA或蛋白质在其天然环境中的定位与扩散过程，这将与许多重要的生物学过程相匹配。与显微注射等现有方法相比，这些技术的主要优势在于，它还可应用于尺寸小于典型显微注射针头直径的微生物。电穿孔的另一优势在于，可同时对大量细胞导入荧光生物分子，并并行观察这些细胞，从而使电穿孔成为一种特别高通量的技术。

尽管该方法可用于研究荧光标记生物分子在体内的扩散和动力学行为，但也可应用于其他情境，例如对未标记的电极生物分子进行分析，这些分子在被细胞内化后可例如触发生理反应。为细菌或酵母荧光显微镜制备琼脂糖垫时，首先准备一些2倍低荧光培养基，然后用实验室微波炉迅速熔化2%琼脂糖的蒸馏水溶液。将等体积的热琼脂糖溶液加入培养基中，并轻轻吹打混合。避免产生气泡，立即吸取约200微升琼脂糖混合物滴加到标准尺寸的显微镜盖玻片上。

将盖玻片在室温下静置一分钟，直至凝胶凝固；或者，将另一块已清洁的盖玻片覆盖在新制的凝胶垫上，从顶部轻轻施加压力，使卵玫瑰花结展平。使用低离子强度缓冲液配制的荧光生物分子储备液，取最多五微升加入至20微升感受态细菌或50微升感受态酵母细胞中。与细胞共同孵育的荧光生物分子的量与每个细胞内化摄入的生物分子量直接相关。

电穿孔后，将混合物置于冰上孵育最多10分钟。同时，选择电极间距合适的电穿孔杯并预冷于冰上。将细胞混合物转移至预冷的电穿孔杯中。

轻轻敲击电转杯数次，以去除溶液中的气泡。用纸巾擦去电转杯外壁的水分，然后将电转杯放入电穿孔仪中。在此步骤刚完成后，立即对细胞施加高压脉冲。

确认电穿孔仪上显示的时间常数在 4 至 6 毫秒之间。较低的时间常数通常是由于 qve 内存在过量盐分或气泡所致，这可能会降低甚至完全抑制生物分子进入细胞的摄取。较高的电压脉冲可改善细胞的载入效率，但也可能在电穿孔后立即影响细胞活力。

加入500 µL富集培养基，将细胞转移至新的1.5 mL离心管中。将细菌在37 °C或酵母在29 °C条件下孵育2至10分钟，使细胞膜恢复。在生物分子整合和生长恢复后，于4 °C预冷的离心机中以1分钟离心沉淀细胞，并弃去上清液。

将沉淀重悬于500微升缓冲液中，重复离心及去除上清、缓冲液重悬步骤三次。这些洗涤步骤将彻底清除细胞悬液中所有未内化的生物分子残留。

对于标记蛋白的内化，在进行额外纯化步骤时，需将细胞悬液用移液器转移至装有0.22微米膜过滤器的1.5毫升离心管中。通过离心将细胞与缓冲液分离，同时确保滤膜上方保留足够液体，以避免细胞干燥，弃去滤过液。在滤膜下方，向细胞中加入500微升新鲜PBS，重复离心后加入新鲜PBS的操作。

再重复两次。最后在 3,300 G 离心 1 分钟。为去除上一次的 PBS 洗涤液，加入 150 µL PBS 重悬细胞。

最后，取下先前制备的琼脂糖垫上的上层盖玻片。用移液器将10 µL细胞悬液逐滴加入琼脂糖垫上。在琼脂糖垫上方放置一张新清洗过的盖玻片后，夹心结构的细胞样品即可用于荧光显微镜观察。

应同时制备阴性对照，例如未进行电穿孔处理的对照组（已孵育标记的生物分子）或空细胞对照组（既未电穿孔也未孵育的细胞），这些对照需与所有加样样本平行处理。加样后的细胞可在任何合适的荧光显微镜上进行成像。宽场成像模式适用于细胞水平的成像与分析，而全内反射或高-低照明模式则更适合单分子观测与追踪。为防止生物分子发生过度光漂白，请确保在加载样本前，所有显微镜载物台上的激光照明均已关闭，或使用不透光滤光片进行遮挡。

此外，关闭 E-M-C-C-G 相机增益，以防止相机因过度曝光而受损。对于倒置显微镜系统，将 Aris 垫片夹心结构放置在显微镜载物台上，使覆盖细胞的一侧朝下，面向底部物镜。然后打开顶部卤素光源，在开启激光之前，先使用透射白光显微镜模式将细胞调至焦点，并在白光透射模式下拍摄细胞图像。

此照片将用作位置参考图，以关联同一视野中生物分子荧光区域与细胞实际位置之间的对应关系。进行活力检测时，应使用设定在最佳温度的物镜加热器，并在白光照明下每隔30分钟对同一视野采集连续图像，期间不得移动载物台；随后关闭顶部透射光照明，并将样品置于避光环境中，防止实验室其他环境光源的照射。然后打开CCD相机并开始数据采集。

在开启激光照射之前，开始记录荧光离子信号。完成荧光显微成像后，使用图像处理软件（如 Image J）打开所有照片，开始数据分析。通过点击“设置”按钮，并选择将参数应用到所有其他图像，对所有图像的基本图像参数（如亮度或对比度）进行归一化处理。方法一可定性判断细胞加载是否成功：在给定图像中，成功加载的细胞应明显比作为阴性对照的未电穿孔细胞更亮。

使用自由选择工具，以手绘多边形圈选出不同区域的荧光。通过从分析菜单中选择测量选项，比较所有相关多边形之间的荧光强度。重复此过程，可手动操作或使用自动化脚本，以提取每个样本及阴性对照中所有细胞的每个像素强度。

当电穿孔细胞被加载一种或多种荧光生物分子时，其平均发射强度将高于阴性对照样本的平均强度。为手动评估细胞活力，需统计完整分裂细胞占非分裂和受损细胞的百分比。在同一视野中，数据每隔30分钟记录一次，持续多个分裂周期，在这种情况下，通常难以直接计数每细胞内化生物分子的数量，特别是当生物分子扩散较快，或每个细胞被加载了五种以上标记生物分子时。

基于细胞的光漂白分析可用于评估在这些条件下每个细胞中标记生物分子的数量。使用手绘选择工具，勾勒出特定荧光细胞的轮廓，并提取和绘制由于光漂白效应导致的细胞荧光强度随时间变化的原始数据。荧光强度随时间变化的曲线呈指数下降趋势，而对于含有少于10个生物分子的细胞，应能清晰分辨出明显的阶梯状下降。

通过取时间序列图像中实验平缓尾端附近的原始荧光强度值的平均值，计算光漂白后的平均自发荧光，例如，可选取延时序列中最后50至100帧图像。在确定基线强度后，通过从原始荧光数据中减去基线自发荧光，计算时间依赖性的光漂白强度，随后对得到的光漂白强度数据进行分段，并手动或使用算法对每一步的高度进行量化。为了准确估算平均步长（该值对应于单个fluoro four分子漂白所产生的单分子荧光强度），应对多个总体呈现超过100步的细胞重复此过程。

最后，可通过将时间零点时减去背景值的细胞荧光强度除以该电穿孔方案的单分子荧光强度，计算出每个细胞内化分子的数量。通过调节电穿孔缓冲液中DNA探针的含量，可控制内化进入细菌或酵母细胞内的荧光标记DNA或蛋白质的量。

当生物大分子的内化速率较高时，可通过首先绘制荧光强度随时间变化的曲线，然后提取其指数时间常数，从而获得标记生物大分子的光漂白寿命，该参数可提供染料在体内的光稳定性信息。在掺入速率较低的情况下，对荧光强度进行量化可用来估算特定细胞内生物大分子的总数。电穿孔也可用于将蛋白质导入细菌或酵母中。

对于荧光标记蛋白，由于游离的荧光分子本身可被高效内化，因此必须从蛋白储备液中彻底去除所有过量的游离荧光分子以及非共价结合的荧光分子。最后，通过我们的方法也可将双标记分子内化，从而实现在活细胞中持续数秒的单分子FRET观测。

在进行该实验操作时，务必同时制备和分析对照样品，例如非电穿孔细胞（即与标记生物分子共同孵育但未进行电穿孔的细胞）或空白细胞（既未电穿孔也未与标记分子孵育的细胞）。这些对照有助于评估细胞的自发荧光水平以及洗涤步骤是否充分，从而判断电穿孔实验在实施后是否成功。该技术为生物物理学和三元生物学领域的研究人员开辟了新的研究途径，使其能够探究标记生物分子在活体微生物中的扩散行为及动态特性。

而这一时间尺度比使用GFPs等自荧光蛋白的时间长一到两个数量级。它将有机染料标记的灵活性引入体内，使单分子示踪实验在研究活细胞内及分子间动力学方面变得更加可行。