小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析 原位 使用TUNEL法

本实验的总体目标是在C two中检测DNA断裂和细胞死亡。首先对组织切片进行通透处理，以允许TUNEL试剂进入细胞核。随后，利用TdT酶将dNTPs共价连接到这些细胞中DNA断裂的3'末端。

然后，dUTP 用荧光探针进行标记。最终，通过检测组织切片中的 TUNEL 阳性信号来定量，反映细胞中 DNA 断裂的相对频率。该技术相较于现有的方法（如 Southern 印迹或免疫组织化学）主要优势在于其相对快速、特异性强，并且能够有效消除背景噪声和自发荧光干扰。

首先，在15毫升离心管中用含4%多聚甲醛的PBS固定分离的后肢，4°C条件下固定4至最多24小时。若组织为胚胎来源，则仅需固定2小时。固定完成后，将溶液更换为10%蔗糖溶液以对组织进行冷冻保护，并在4°C条件下过夜孵育。

第二天，将溶液更换为无菌过滤的 30% 蔗糖溶液，继续孵育过夜，直至后肢沉入管底。包埋时，必须确保后肢完全浸没在包埋介质中。包埋模具可直接置于干冰上，或置于盛有异戊烷的干冰容器中，以冻结介质。

进行冷冻切片时，切取的组织块应产生厚度为10微米或更薄的切片，较厚的切片无法被TUNEL标记试剂充分渗透。将这些薄切片收集到明胶或Vector Bond包被的玻璃载片上，并在室温下保存。

迅速将载玻片转移至干冰中保存。首先将一张冷冻组织切片在室温下解冻，并使其干燥16至64小时。待载玻片达到室温后，将切片置于盛有PBS的连接罐中再水化10分钟。

重复此再水化步骤一次，然后用实验室擦拭纸小心擦干载玻片，注意不要扰动组织切片以实现通透。将载玻片放入湿盒中，用移液器吸取50 µL非蛋白水解皂苷类商用试剂，加至组织切片上。切勿将试剂直接滴加到组织切片上，以免导致切片脱落或受损。然后在切片上覆盖一小片Parafilm膜，以使试剂均匀铺展。

如果产生气泡，需重新覆盖封口膜。将载玻片孵育1小时后，再继续孵育1小时。用PBS洗涤两次，每次5分钟，去除试剂，并小心吸干。

接下来，使用市售试剂盒通过TDT标记DNA断裂。首先，配制一份XTDT缓冲液，并将其移液至切片上。然后将载玻片置于湿化室中孵育五分钟。

其次，根据试剂盒说明书或阳性对照切片的要求配制TDT标记混合液。将DNA加入TDT标记混合液中。对于阴性对照切片，应在混合液中省略TDT酶。

现在使用擦拭纸尽可能去除玻片上的缓冲液，并加入50微升标记混合液即可。再次用对二甲苯均匀铺展溶液，避免产生气泡。

将载玻片在37摄氏度的孵育 chamber 中孵育一小时。第三步，根据试剂盒说明书配制1×终止缓冲液。用实验室擦拭纸去除标记混合液后，加入2至300微升终止混合液，以完全覆盖组织切片。

然后将载玻片在孵育 chamber 中孵育 5 分钟。此步骤中不使用封口膜。为去除终止缓冲液，使用 PBS 进行两次、每次两分钟的洗涤。

现在用移液器吸取50微升新配制的荧光素标记溶液。在载玻片上施加perfil，并在避光条件下于孵育 chamber 中孵育20分钟。用PBS单次洗涤2分钟以去除标记溶液，同时在洗涤过程中稀释一些hooks。

3 3, 2, 5 8 至每毫升 PBS 含一微克。洗涤后，将切片覆盖在 1 至 200 微升稀释的钩溶液中。然后将载玻片在避光条件下孵育五分钟，以去除用于染色的钩，接着用 PBS 进行三次每次五分钟的洗涤。

然后用实验室擦拭纸小心擦干载玻片，并加盖盖玻片用于成像。使用 dpi、fitzy 和 Texas red 滤光片对切片进行成像，将钩状染色、通道染色以及自发荧光信号分别分离至单幅图像中的三个伪彩通道。所有载玻片应采用相同的成像设置，以确保标准化并便于相互比较。

解剖学参考成像时，请勿使用任何自动曝光或增益设置。在图像分析软件中，使用相邻后肢切片的明场染色（H&E）图像作为参考。关闭隧道通道。

然后使用其他通道手动勾画出需要量化的肌肉区域轮廓。将勾画的区域转换为掩膜。接着重新打开通道，调整最低强度阈值以排除自发荧光信号。

在研究分析的所有切片中使用相同的阈值限制。接下来，将阈值像素转换为掩膜。在每张图像中，合并肌肉区域掩膜与阈值通道掩膜。

这将在已追踪的肌肉区域内生成隧道信号的图像表征。现在对合并的掩膜进行定量分析，以确定隧道阳性物体的数量以及肌肉内隧道信号的总像素面积。将这些数值用于统计分析。

隧道阳性物体在低倍镜下可能表现为骨骼肌中明亮的不规则碎片。然而，在高倍镜下，如果涉及的细胞死亡类型为凋亡，则应观察到部分具有典型凋亡形态的隧道阳性物体。加入DNA的阳性对照应显示丰富的隧道阳性信号，均匀分布于所有组织中。

在该部分中，未添加TDT酶的阴性对照应呈现低强度背景，仅显示自发荧光。根据所述实验方案，发现在制备的高肢节段中，红细胞、骨组织和内皮细胞对自发荧光信号有所贡献。

真正的TUNEL阳性信号强度要高得多，可通过像素强度阈值将其与自发荧光信号分离。另一种分离TUNEL信号的方法是将红色自发荧光通道从TUNEL通道中进行数字减除。

利用该技术，对脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中的骨骼肌细胞死亡进行了评估。TUNEL标记显示，出生五天的SMA小鼠比对照组含有更多的凋亡细胞。通过对TUNEL染色进行定量分析，该观察结果在后肢多个肌群中均显示出统计学显著性。

一旦掌握，该隧道技术可在约四小时内完成，以获得可靠的定量结果。