Name: 检测和DNA损伤分析小鼠骨骼肌原位使用TUNEL法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学习使用TUNEL标记法检测小鼠骨骼肌DNA断裂与细胞死亡。该方法通过荧光标记和半自动化分析，为肌肉生物学研究提供快速、特异且可靠的定量工具。

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本工作由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）资助项目 RO1-NS065895 和 NIH-NINDS 资助项目 5-F31-NS076250-02 支持。
感谢约翰斯·霍普金斯大学医学院显微镜中心提供冷冻切片机的使用。

注意：本方案中所述的所有动物实验操作均按照相关指南中的建议进行 实验动物护理和使用的指南 美国国立卫生研究院26该方案（MO13M391）已获约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。
1. 新生小鼠的处死、解剖与固定
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 处死一只新生小鼠。</li>
	<li>立即在膝关节上方切断后肢。出生后约 7 天内，腿骨足够柔软，可使用大型实验剪刀或锋利刀片切断，并随后在冷冻切片机上进行切片。</li>
	<li>将后肢放入含有 10&#160;ml 冰冷的 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）的 15&#160;ml 管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将后肢浸入多聚甲醛中固定 4–24&#160;小时。胚胎组织仅需数小时固定即可。
	<ol>
		<li>避免固定时间超过 24&#160;小时，因为这可能会降低 TUNEL 检测效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将后肢浸入蔗糖溶液中进行冷冻保护。
	<ol>
		<li>在同一个 15&#160;ml 管中，将多聚甲醛更换为 PBS 配制的 10% 蔗糖溶液，4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>更换为 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液，4 °C 过夜孵育，或直至后肢沉降至管底。若蔗糖溶液已通过无菌滤膜过滤，组织可在 30% 蔗糖溶液中保存更长时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织包埋
<ol>
	<li>将包埋模具用包埋剂填充至一半高度。</li>
	<li>将后肢置于包埋剂上方，切面尽可能靠近模具的一侧壁。在模具外壁标记后肢的方向。
	<ol>
		<li>可将多个后肢包埋在同一块包埋剂中并进行切片。但重要的是确保所有后肢在包埋块中彼此平行定向，以便沿肢体轴向获得相同水平的切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用包埋剂覆盖后肢。若在倾倒包埋剂过程中后肢发生移位，可用钝头镊子或牙签重新调整其方向。</li>
	<li>在室温下让包埋剂充分渗透组织，至少 15&#160;min。</li>
	<li>将模具直接置于干冰上，或置于盛有异戊烷的干冰中，以冻结包埋剂。务必始终保持模具水平，避免包埋组织发生位移。</li>
	<li>将冷冻的模具在 -80 °C 下保存，直至准备切片，可保存数月。</li>
</ol>
3. 包埋肢体的冷冻切片
<ol>
	<li>将冷冻切片机腔室温度设置为 -20 °C，样品温度设置为 -18 °C；根据需要适当降低样品温度。</li>
	<li>将组织块在冷冻切片机腔室内平衡至少 30&#160;min。正确的组织块温度对切片质量至关重要。</li>
	<li>以 10 μm 或更薄的厚度切取横切面切片。较厚的切片将无法被TUNEL试剂完全渗透。使用冷冻切片机推荐的防卷板、刀片及刀片角度（通常为 5°）。</li>
	<li>将切片收集到室温下的明胶或Vectabond包被的载玻片上。立即放入置于干冰上的玻片盒中。将玻片盒放置在靠近冷冻切片机、便于操作的单独容器内，并用干冰保存。
	<ol>
		<li>沿肢体长轴切取连续横切面切片，间隔 100–200 μm。在每个连续切片水平收集至少 3 张相邻切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用商用试剂盒对后肢切片进行TUNEL检测（所有步骤均在室温下进行，除非另有说明）
<ol>
	<li>将载有组织切片的玻片于室温下解冻，并干燥过夜或整个周末。</li>
	<li>通过将玻片浸入 PBS 中 2&#160;次，每次&#160;10&#160;分钟，进行切片复水（使用 Coplin 染色缸）。用实验室擦拭纸擦干，尽可能去除切片周围的液体。</li>
	<li>对切片进行通透处理
	<ol>
		<li>可选用非蛋白水解型皂苷类商用试剂，或使用含 0.5% Tween20 和 0.05% Triton X100 的 PBS 溶液。</li>
		<li>将玻片放入湿化室中。简易湿化室可使用带紧密盖子的空移液器吸头盒，在盒底加入适量水以覆盖底部即可。</li>
		<li>用移液器吸取足量试剂滴加至玻片上，以完全覆盖切片区域（50 μl 可满足新生小鼠肢体组织切片的需求）。避免直接将试剂滴在切片上，以免反复操作导致切片从玻片脱落。</li>
		<li>使用钝头镊子将一小块长方形 Parafilm 膜覆盖在切片上，以使试剂均匀铺展并完全覆盖切片。若 Parafilm 膜下产生气泡，应轻轻揭起，擦干后重新放置。</li>
		<li>将玻片置于加盖的湿化室中，与通透试剂共同孵育 1&#160;小时。若发现切片开始从玻片脱落，可将通透时间缩短至 30&#160;分钟。</li>
		<li>在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤玻片 2&#160;次，每次&#160;5&#160;分钟。Parafilm 膜会浮至液面，可将其移除并丢弃。</li>
		<li>用实验室擦拭纸尽可能吸干切片周围的液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TdT 介导的 DNA 断裂末端标记
	<ol>
		<li>按照试剂盒说明书配制 1x TdT 标记缓冲液，用移液器吸取足量缓冲液滴加至玻片上以覆盖组织切片（50 μl 可满足新生小鼠肢体组织切片的需求），在湿化室中孵育 5&#160;分钟。也可将玻片浸入 Coplin 染色缸中的 TdT 标记缓冲液内进行处理。</li>
		<li>根据试剂盒说明书配制 TdT 标记反应混合液。试剂盒中包含钴、镁和锰阳离子；其中锰阳离子在多种组织（包括骨骼肌、神经系统组织、肝脏、皮肤和骨组织）中均表现出良好效果。</li>
		<li>作为阳性对照，可在 TdT 标记混合液中加入 DNase（试剂盒中标注为“nuclease”）。或者，根据试剂盒说明，用含 DNase 的核酸酶缓冲液在 37 °C 下预处理阳性对照切片 1&#160;小时。应将 DNase 溶液及经 DNase 处理的切片与其他实验组切片分开存放，以防交叉污染。</li>
		<li>作为阴性对照，应在标记混合液中省略 TdT 酶。</li>
		<li>用实验室擦拭纸尽可能去除玻片上的 TdT 标记缓冲液，然后滴加 TdT 标记混合液（每张切片 50 μl），覆盖新的 Parafilm 膜，置于湿化室中 37 °C 孵育 1&#160;小时。</li>
		<li>根据试剂盒说明书配制 1x 终止缓冲液。用实验室擦拭纸去除玻片上的 TdT 标记混合液，加入 200–300 μl 终止缓冲液以覆盖组织切片，在湿化室中孵育 5&#160;分钟。也可将玻片浸入 Coplin 染色缸中的终止缓冲液中进行处理。</li>
		<li>在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤玻片 2&#160;次，每次&#160;2&#160;分钟。用实验室擦拭纸尽可能去除玻片上的 PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光标记
	<ol>
		<li>根据试剂盒说明书配制荧光素标记溶液，用于在 DNA 断裂位点标记 dNTP。将溶液滴加至玻片上（每张切片 50 μl），覆盖新的 Parafilm 膜，在湿化室中孵育 20&#160;分钟。</li>
		<li>在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤玻片 2&#160;分钟。用实验室擦拭纸尽可能去除玻片上的 PBS。</li>
		<li>将 Hoechst 33258 核染料用 PBS 稀释至 1 μg/ml，滴加至玻片上（100–200 μl 即可完全覆盖切片），在湿化室中孵育 5&#160;分钟。</li>
		<li>在 PBS 中洗涤 3 次，每次 5&#160;分钟。</li>
		<li>使用抗荧光淬灭封片剂加盖盖玻片，并用指甲油密封边缘。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数字图像采集
<ol>
	<li>使用配备 DAPI、FITC 和 Texas Red 滤光片（或等效滤光片）的传统荧光显微镜采集图像。采用较高倍率的物镜（20X 或 40X）确认标记是否成功，并观察细胞核（完整或碎片化）是否被标记。定量分析 TUNEL 阳性点状信号时，10X 物镜已足够。</li>
	<li>分别采集 Hoechst 染色、TUNEL 染色和自发荧光信号的图像，作为三个独立的伪彩通道，并合并为一幅图像。若 TUNEL 荧光标记为绿色，则在红色滤光通道中成像自发荧光信号，反之亦然。
	<ol>
		<li>保持各玻片之间的成像参数一致，以便后续进行阈值设定和定量分析。对每个滤光通道，预设并记录曝光时间、增益和 binning 参数（建议不使用 binning）；请勿使用自动曝光或自动增益设置。</li>
		<li>通过反复试验确定最佳的曝光时间和增益设置，以充分捕捉所有染色玻片中荧光强度的动态范围。确保所采集图像中无饱和像素，否则将影响定量结果的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集目标肌群的完整图像。这可能需要获取多张图像并通过“拼接”方式组合成完整视图。</li>
</ol>
6. 图像分析
<ol>
	<li>使用市售的图像分析程序分析TUNEL染色的数字图像。本文展示了使用商业软件的分析方法。此外，也可使用美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费软件ImageJ进行TUNEL染色分析。</li>
	<li>对与TUNEL染色切片相邻的组织切片进行苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色，并使用常规明场显微镜拍摄整张切片的数字图像。将此H&amp;#38;E图像结合解剖学图谱5,18,19，用于勾画需定量的解剖结构。</li>
	<li>关闭TUNEL通道，借助Hoechst染色和自发荧光通道的信号，手动勾画待定量区域的轮廓。将所勾画区域转换为掩膜（即一组待分析的像素坐标集合）。</li>
	<li>打开TUNEL通道。在图像分析程序中使用强度阈值功能，设定下限阈值以排除所有自发荧光信号。</li>
	<li>将相同的阈值设置应用于研究中所有图像，并将阈值筛选结果转换为掩膜。</li>
	<li>对每张图像，合并肌肉区域掩膜与TUNEL掩膜。新生成的组合掩膜将仅表示限定肌肉区域内存在的TUNEL信号。</li>
	<li>对组合掩膜进行定量分析，以确定限定肌肉区域内TUNEL信号的物体数量及物体面积。可使用ImageJ中的“粒子分析器”（Particle Analyzer）功能完成此步骤。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

本文介绍了一种检测和定量分析小鼠骨骼肌中与DNA损伤相关的细胞凋亡的方法。该操作流程包括组织采集、TUNEL染色、数字图像获取以及图像分析。实验需要常规组织学耗材和工具，并需使用特定的商用TUNEL试剂盒。所需的主要大型设备包括冷冻切片机、配备数字成像功能的落射荧光显微镜，以及用于图像分析的计算机系统。
实验人员应注意潜在的陷阱。组织自发荧光是荧光成像中的一个主要问题。在未灌注的动物中，残留的红细胞会产生较强的自发荧光信号。内皮细胞也可能具有显著的自发荧光。因此，必须确认未将自发荧光误判为TUNEL阳性信号。这一评估可通过在无荧光染料的通道中采集图像来实现，用于与TUNEL阳性通道进行比较，必要时进行背景扣除。通过这种方式，基于荧光的TUNEL方法优于基于比色法的明场显微技术，后者无法提供背景染色的内部对照。
组织固定对TUNEL标记的成功具有显著影响。最好将多聚甲醛固定时间缩短至最低限度，不超过24&#160;hr。胚胎和新生组织所需的固定时间应明显短于24&#160;hr。
<p class="jove_conte...

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将dUTP连接到双链和单链DNA断裂的3’末端的技术12,23。Gavrieli 等人et al.1,12,24在20多年前首次报道了用于检测细胞凋亡和DNA损伤的TUNEL方法。此后，该方法已在不同组织样本制备中得到评估和优化7,23,27,40。TUNEL已被用于研究缺血诱导的神经元6,14,29和心肌细胞43,44死亡、兴奋性毒性神经元死亡30,31，以及作为关节炎治疗中的生物标志物39。此外，TUNEL还被用作多种人类癌症中的预后因子和肿瘤细胞标志物2,3,15,32,37,38,42。
检测DNA损伤和细胞死亡的替代方法虽然存在，但均存在技术挑战和局限性。Southern印迹法可用于定量整体组织裂解液中的DNA损伤7,9-11，但该方法无法提供细胞水平的分辨率，且难以实现准确定量。彗星实验是一种基于细胞的替代方法，需从细胞中提取保存完好的细胞核4,20,28,36。尽管彗星实验在培养的分离细胞中效果良好，但从骨骼肌组织中制备完整细胞核则困难得多8,21。与Southern印迹法类似，彗星实验也无法从整体肌肉组织匀浆中提供特定细胞类型的信息。TUNEL法的另一种替代方案是使用针对单链DNA的抗体进行免疫组织化学检测25,33,41，或使用针对参与DNA损伤应答和细胞死亡通路的蛋白（例如 p53、H2AX和caspases）的抗体13,17,22,40。这类基于抗体的方法需要对抗体进行充分表征，并具备优异的抗体特异性，才能获得较高的信噪比。即使存在特异性抗体，也可能需要通过抗原修复程序对靶蛋白进行变性处理34,35。正如本文所述，在肌肉组织中进行抗原修复会导致自发荧光过高，无法接受。与这些替代方法不同，TUNEL法能够实现高信号、低背景的DNA损伤检测，具有优异的特异性，可通过简单的阳性和阴性对照进行验证，组织穿透性良好，无需抗原修复，且具备细胞水平的分辨率。此外，TUNEL法完成实验约需4小时，而替代方法通常需要过夜孵育。
我们在脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中研究骨骼肌细胞死亡10 由 Hsieh-Li 及同事生成16为了定量肌肉中的凋亡细胞，我们建立了一种组织制备、染色和定量方法，该方法在不同发育时间点的小鼠不同骨骼肌群中均表现出良好的稳定性和适用性。我们采用市售的TUNEL标记试剂盒和市售图像分析软件。此外，我们还成功地将TUNEL检测与脊髓组织的免疫荧光染色相结合使用。10.
本文所述方法适用于希望评估骨骼肌组织病理学、疾病机制、衰老机制以及发育过程（产前和产后）中细胞死亡的研究人员。&#160;机制&#160;的、机制&#160;的TUNEL技术特别适用于研究DNA损伤与修复以及细胞死亡，尤其在仅部分细胞受影响且需要细胞水平分辨率的模型系统中。
本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法。同时介绍了一种半自动化的TUNEL信号定量分析方法。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>本实验所述步骤中，4%溶液由粉末新鲜配制。可使用任意供应商提供的多聚甲醛。配制好的甲醛溶液应保存在4 &amp;deg;C，且不可在过期后使用（有效期最长数月）。多聚甲醛为致癌物，经吸入或皮肤接触具有毒性。操作多聚甲醛时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中规定的防护措施。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>用于组织冷冻前的冷冻保护。可使用任意供应商提供的蔗糖。</td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>冷冻切片的包埋介质。</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>本实验所用为Leica CM3050S冷冻切片机。任何能够切割10 &amp;mu;m切片的冷冻切片机均可使用。</td></tr><tr><td>载玻片，25 × 75 × 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>可使用任意供应商提供的载玻片。</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>明胶用于促进组织切片在载玻片上的附着。明胶包被载玻片的制备方法：将2.75 g明胶和0.275 g铬矾溶于500 ml蒸馏水中，加热至60 &amp;deg;C，将载玻片浸入数秒后取出晾干。可使用任意供应商提供的明胶。也可直接购买预包被明胶的载玻片。</td></tr><tr><td>十二水合硫酸铬钾（铬矾）</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>铬矾添加至明胶溶液中以增强组织在载玻片上的附着能力。其为可能的致癌物，经吸入或皮肤接触具有毒性。操作铬矾时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中规定的防护措施。</td></tr><tr><td>Vectabond组织粘附试剂</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>可选底物，用于增强组织在载玻片上的附着；也可使用明胶包被的载玻片替代。</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>用于组织通透的去垢剂。可使用任意供应商提供的Tween20。</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>用于组织通透的去垢剂。可使用任意供应商提供的Triton X100。</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT 荧光 &lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 凋亡检测试剂盒</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>基于荧光的TUNEL标记商用试剂盒。</td></tr><tr><td>DNase/核酸酶</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>（随试剂盒提供）</td></tr><tr><td>DNase/核酸酶缓冲液</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>（随试剂盒提供）</td></tr><tr><td>10×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>配制1× PBS用于洗涤和稀释。可使用任意供应商提供的PBS。</td></tr><tr><td>无DNase水</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>可使用任意供应商提供的水。</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>细胞核染料。可使用任意蓝色荧光细胞核染料。Hoechst为DNA结合染料，疑似致癌物，操作时应佩戴防护装备以减少皮肤接触。</td></tr><tr><td>Parafilm M封口膜</td><td>multiple</td><td>807</td><td>可使用其他疏水性膜或盖玻片。可从多个供应商处获得。</td></tr><tr><td>配备数字相机的荧光显微镜</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>&amp;nbsp;--</td><td>任何能够分别在红、绿、蓝通道中数字采集荧光信号的荧光显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>Vectashield抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>可使用任意供应商提供的抗荧光淬灭封片剂。</td></tr><tr><td>盖玻片，1号厚度</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>可使用任意供应商提供的盖玻片。22 × 22 mm的最小尺寸足以覆盖新生小鼠腿部切片。</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>用于密封盖玻片。可使用任意供应商（包括普通零售商）提供的指甲油。避免使用带有颜色或添加剂的指甲油，以免在荧光成像过程中产生光反射。</td></tr></tbody></table>

小鼠骨骼肌中dna损伤的检测与分析 原位 使用tunel法

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）脱氧尿苷三磷酸（dUTP）缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将标记的dUTP共价连接到细胞中双链和单链DNA断裂的3’末端的方法。该方法是一种可靠且有用的原位检测DNA损伤和细胞死亡的技术。in situ。本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法，同时还介绍了一种半自动化的TUNEL信号定量方法。组织固有的正常结构特征及组织处理条件会影响TdT酶对DNA进行高效标记的能力；组织处理过程还可能引入非特异性自发荧光，干扰TUNEL信号的检测。因此，必须通过实验确定合适的组织处理和TUNEL标记方法，以获得最佳的信噪比，便于后续定量分析。本文所述的基于荧光的检测方法可通过数字通道减除法排除自发荧光信号。若配合恰当的组织处理技术和对照设置，TUNEL检测是一种相对快速、可重复且定量的组织中凋亡检测方法。该方法可用于确认DNA损伤和细胞凋亡作为病理机制的存在，识别受影响的细胞类型，并评估体内治疗干预的效果。in vivo。

染色成功时，TUNEL阳性信号应足够明亮，可通过设定强度阈值将其与自发荧光区分开来。在低倍镜下，骨骼肌中的TUNEL阳性信号可能呈现为明亮而不规则的碎片（图1A）。然而，若涉及的细胞死亡类型为凋亡，则在高倍镜下应观察到部分具有典型凋亡形态的TUNEL阳性结构（图1B）。阳性对照（添加DNase）应显示丰富的TUNEL阳性信号，且在切片的所有组织中均匀分布（图1C）。阴性对照（反应中省略TdT酶）应仅显示低强度背景信号和自发荧光信号（图1D）。在整条腿的切片中，皮肤可作为内部阳性对照，因为该组织具有较高的正常凋亡率（图1A）。
红细胞、骨组织和内皮细胞可能会产生显著的自发荧光信号（图2）。建议在未进行荧光标记的情况下，分别在独立通道中对每个切片成像，以确保不会将自发荧光误判为TUNEL阳性信号。真正的TUNEL阳性信号强度应远高于自发荧光，因此可通过设定图像强度阈值将其分离（<str...

本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法。同时介绍了一种TUNEL标记的半自动化分析方法。

小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析 原位 使用TUNEL法

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）脱氧尿苷三磷酸（dUTP）缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将dUTP共价...

本实验的总体目标是在C two中检测DNA断裂和细胞死亡。首先对组织切片进行通透处理，以允许TUNEL试剂进入细胞核。随后，利用TdT酶将dNTPs共价连接到这些细胞中DNA断裂的3'末端。然后，dUTP 用荧光探针进行标记。最终，通过检测组织切片中的 TUNEL 阳性信号来定量，反映细胞中 DNA 断裂的相对频率。该技术相较于现有的方法（如 Southern 印迹或免疫组织化学）主要优势在于其相对快速、特异性强，并且能够有效消除背景噪声和自发荧光干扰。首先，在15毫升离心管中用含4%多聚甲醛的PBS固定分离的后肢，4°C条件下固定4至最多24小时。若组织为胚胎来源，则仅需固定2小时。固定完成后，将溶液更换为10%蔗糖溶液以对组织进行冷冻保护，并在4°C条件下过夜孵育。第二天，将溶液更换为无菌过滤的 30% 蔗糖溶液，继续孵育过夜，直至后肢沉入管底。包埋时，必须确保后肢完全浸没在包埋介质中。包埋模具可直接置于干冰上，或置于盛有异戊烷的干冰容器中，以冻结介质。进行冷冻切片时，切取的组织块应产生厚度为10微米或更薄的切片，较厚的切片无法被TUNEL标记试剂充分渗透。将这些薄切片收集到明胶或Vector Bond包被的玻璃载片上，并在室温下保存。迅速将载玻片转移至干冰中保存。首先将一张冷冻组织切片在室温下解冻，并使其干燥16至64小时。待载玻片达到室温后，将切片置于盛有PBS的连接罐中再水化10分钟。重复此再水化步骤一次，然后用实验室擦拭纸小心擦干载玻片，注意不要扰动组织切片以实现通透。将载玻片放入湿盒中，用移液器吸取50 µL非蛋白水解皂苷类商用试剂，加至组织切片上。切勿将试剂直接滴加到组织切片上，以免导致切片脱落或受损。然后在切片上覆盖一小片Parafilm膜，以使试剂均匀铺展。如果产生气泡，需重新覆盖封口膜。将载玻片孵育1小时后，再继续孵育1小时。用PBS洗涤两次，每次5分钟，去除试剂，并小心吸干。接下来，使用市售试剂盒通过TDT标记DNA断裂。首先，配制一份XTDT缓冲液，并将其移液至切片上。然后将载玻片置于湿化室中孵育五分钟。其次，根据试剂盒说明书或阳性对照切片的要求配制TDT标记混合液。将DNA加入TDT标记混合液中。对于阴性对照切片，应在混合液中省略TDT酶。现在使用擦拭纸尽可能去除玻片上的缓冲液，并加入50微升标记混合液即可。再次用对二甲苯均匀铺展溶液，避免产生气泡。将载玻片在37摄氏度的孵育 chamber 中孵育一小时。第三步，根据试剂盒说明书配制1×终止缓冲液。用实验室擦拭纸去除标记混合液后，加入2至300微升终止混合液，以完全覆盖组织切片。然后将载玻片在孵育 chamber 中孵育 5 分钟。此步骤中不使用封口膜。为去除终止缓冲液，使用 PBS 进行两次、每次两分钟的洗涤。现在用移液器吸取50微升新配制的荧光素标记溶液。在载玻片上施加perfil，并在避光条件下于孵育 chamber 中孵育20分钟。用PBS单次洗涤2分钟以去除标记溶液，同时在洗涤过程中稀释一些hooks。3 3, 2, 5 8 至每毫升 PBS 含一微克。洗涤后，将切片覆盖在 1 至 200 微升稀释的钩溶液中。然后将载玻片在避光条件下孵育五分钟，以去除用于染色的钩，接着用 PBS 进行三次每次五分钟的洗涤。然后用实验室擦拭纸小心擦干载玻片，并加盖盖玻片用于成像。使用 dpi、fitzy 和 Texas red 滤光片对切片进行成像，将钩状染色、通道染色以及自发荧光信号分别分离至单幅图像中的三个伪彩通道。所有载玻片应采用相同的成像设置，以确保标准化并便于相互比较。解剖学参考成像时，请勿使用任何自动曝光或增益设置。在图像分析软件中，使用相邻后肢切片的明场染色（H&E）图像作为参考。关闭隧道通道。然后使用其他通道手动勾画出需要量化的肌肉区域轮廓。将勾画的区域转换为掩膜。接着重新打开通道，调整最低强度阈值以排除自发荧光信号。在研究分析的所有切片中使用相同的阈值限制。接下来，将阈值像素转换为掩膜。在每张图像中，合并肌肉区域掩膜与阈值通道掩膜。这将在已追踪的肌肉区域内生成隧道信号的图像表征。现在对合并的掩膜进行定量分析，以确定隧道阳性物体的数量以及肌肉内隧道信号的总像素面积。将这些数值用于统计分析。隧道阳性物体在低倍镜下可能表现为骨骼肌中明亮的不规则碎片。然而，在高倍镜下，如果涉及的细胞死亡类型为凋亡，则应观察到部分具有典型凋亡形态的隧道阳性物体。加入DNA的阳性对照应显示丰富的隧道阳性信号，均匀分布于所有组织中。在该部分中，未添加TDT酶的阴性对照应呈现低强度背景，仅显示自发荧光。根据所述实验方案，发现在制备的高肢节段中，红细胞、骨组织和内皮细胞对自发荧光信号有所贡献。真正的TUNEL阳性信号强度要高得多，可通过像素强度阈值将其与自发荧光信号分离。另一种分离TUNEL信号的方法是将红色自发荧光通道从TUNEL通道中进行数字减除。利用该技术，对脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中的骨骼肌细胞死亡进行了评估。TUNEL标记显示，出生五天的SMA小鼠比对照组含有更多的凋亡细胞。通过对TUNEL染色进行定量分析，该观察结果在后肢多个肌群中均显示出统计学显著性。一旦掌握，该隧道技术可在约四小时内完成，以获得可靠的定量结果。

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生物学

检测和DNA损伤分析小鼠骨骼肌原位使用TUNEL法

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利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内...

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

学习使用TUNEL标记法检测小鼠骨骼肌DNA断裂与细胞死亡。该方法通过荧光标记和半自动化分析，为肌肉生物学研究提供快速、特异且可靠的定量工具。

小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析原位使用TUNEL法

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小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析 原位 使用TUNEL法

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