高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本实验的总体目标是可重复地从干细胞中获得高质量的视网膜色素上皮（RPE）。首先将可诱导的多能干细胞培养至汇合状态，实现这一目标；第二步，更换培养基以诱导细胞向RPE方向分化。

接下来，将RPE细胞从培养皿中的其他已分化细胞中分离出来，然后扩增培养，直至获得足够数量的细胞。最终，可通过观察培养细胞的深色色素沉着和鹅卵石样形态，确认RPE细胞已达到终末分化阶段。与现有的自发分化等方法相比，该技术的主要优势在于添加特定因子能够加速分化过程，缩短时间，并提高RPE细胞的产量。

迄今为止，已有数千只啮齿类动物通过使用源自iPS细胞的RPE细胞治愈了多种视网膜退行性疾病。然而，若要将这一方法高效且有效地转化为临床人类疾病的治疗手段，建立完善且可重复的标准化方案至关重要，这些方案必须能够为我们提供高质量、高数量的RPE细胞。该方法的可视化展示极为重要，因为在任何给定时间内，仅能有一人在生物安全柜内的显微镜下操作，这使得分离步骤难以被观察。接下来，我实验室的研究技术员Mitchell Prince将演示与该程序的数字培养方面相关的实验方案：为引导干细胞分化为RPE细胞进行培养，需将目标干细胞系接种于六孔板中每孔含2×10⁶个细胞的鼠胚胎饲养层细胞上，待细胞集落达到汇合状态后，改为每日更换分化培养基。

添加烟酰胺的培养基。三周后，开始在饲养液中加入活性物质或IDE，以促进视网膜色素上皮（RPE）的分化。两周后，换回分化培养基，并单独使用烟酰胺，停止每日饲养。

一旦培养基中的 pH 指示剂在换液后第二天停止变为黄色，立即将培养物放回培养箱，直至出现足够大、可切割并移除的色素细胞小孔。为分离色素小孔，接下来用一种无异源成分且模拟天然细胞环境的基质对 24 孔板的孔进行包被。接着，根据需要，向 24 孔板的多个孔中加入分化培养基。

在细胞培养超净台中，使用解剖显微镜和手术刀片将原始培养板底部每个有色素的眼状结构切成两至六块，用锐利的镊子夹取有色素的部分，然后将一至两块有色素的组织转移至每个孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三至五天，直至细胞贴壁，随后开始每周更换培养基三次。

在分化培养基中培养细胞三到四周，每周三次继续换液并传代。视网状上皮细胞（RPE）情况，加入200 µL预热至37°C的无胰酶细胞解离液，以使细胞脱离。

5 到 8 分钟后，用新鲜的分化培养基终止反应，然后用 200 微升移液器将培养物重悬为单细胞悬液，收集细胞数较少的克隆。接着，将解离后的克隆转移至 15 毫升离心管中，离心沉淀细胞。将每管细胞沉淀重悬于 3 毫升分化培养基中，随后将克隆分别接种至矩阵编码的六孔板的各个孔中，每孔额外添加 3 毫升分化培养基。

然后将细胞培养一至两周，直至细胞融合度达到约90%，再用一毫升解离溶液将细胞解离，方法如前所述。此次使用1000微升移液器重悬细胞，将单细胞悬液转移至50毫升锥形管中。

然后再次离心细胞，将沉淀重悬于18毫升的分化培养基中，最后将细胞接种至基质包被的培养容器中，以在最少的传代次数内获得最大数量的目标细胞，用于后续下游分析。在诱导性多能干细胞系培养5至7周后，开始出现色素化的克隆。这些克隆在培养维持期间可继续生长数周。

当它们达到足够大小后，可进行手动切除。仔细切除以避免混入非视网膜色素上皮（RPE）细胞，可极大促进获得纯度足够的RPE细胞培养物。若技术操作得当，掌握该技术后可在8至12周内获得大量RPE细胞。

在进行该操作时，重要的是要注意在配制培养基和喂养细胞过程中避免污染培养物。观看本视频后，我们希望你们中的许多人能够从诱导多能干细胞（IPS）中大量制备出高质量的视网膜色素上皮（RPE）细胞。希望这将有助于加快从实验室到临床的转化进程，为目前无法治疗的视网膜变性及新生血管性疾病患者提供基于细胞的治疗方案。