轴突的相互作用与小胶质细胞和巨噬细胞在小鼠背柱破碎损伤活体成像
2014年11月23日
双光子活体成像可用于研究背柱创伤性脊髓挤压伤的骨髓嵌合动物在其天然组织环境中脊髓中不同细胞类型之间的相互作用。
该程序的总体目标是观察受伤脊髓中小胶质细胞、单核细胞和其他细胞类型之间的运动和相互作用。这是通过首先创建骨髓嵌合小鼠来实现的，这些小鼠将具有用荧光标记标记的常驻小胶质细胞或骨髓衍生的巨噬细胞。第二步是在脊髓中产生背柱挤压伤。
然后重新打开动物并稳定脊髓对于多光子成像，最后一步是在病灶内拍摄单张图像或延时电影。最终，图像分析显示了细胞运动和细胞与周围底物的相互作用。与传统技术（如细胞培养和固定组织）相比，该技术的主要优点是可以在活体动物的自然复杂环境中对细胞进行成像。
对于这种手术，使用嵌合或双转基因动物。请参阅文本方案，了解如何在诱导麻醉后标记常驻或骨髓来源的细胞，用 1 至 2% ISO 氟维持其呼吸频率约为每分钟 60 至 100 次呼吸。现在，涂抹眼药膏并通过捏住脚趾确认手术麻醉平面。
为手术做准备，首先剃掉目标脊髓区域，然后用聚维酮碘和 70% 酒精磨砂膏将皮肤擦拭干净，披上动物并打个洞以进入手术部位。然后将高压灭菌器工具放在无菌窗帘上。这包括一个四号镊子，该镊子固定在尖齿之间 1 毫米处，并在距尖端 1 毫米处有标记。
现在可以使用虹膜剪刀在中线打开皮肤，露出肌肉组织。在解剖显微镜下进行手术。沿中线，切开它们附着在背椎突上的背部肌肉，目的是露出脊柱。
这涉及切断背阔肌的斜方肌和韧带。接下来，去除横突和背突之间的旋转肌，露出要去除的特定椎骨的椎板。这里 T 10 暴露出来。
继续将 RO 陪审员提示插入流程上方和下方的空白处。然后轻轻抬起，确保吸头牢固就位且不会太深。然后关闭 RO 陪审员以去除薄板。
现在，去除剩余椎骨的所有较小部分，从而扩大开口。使用 30 号针头，在硬脑膜上戳两个相距 1 毫米的孔，作为固定镊子的入口。然后将固定镊子以 90 度角插入硬脑膜，将标记保持在硬脑膜上方的尖齿上。
现在，捏合镊子 10 秒钟。再挤压 10 秒两次，然后取下镊子。接下来，将一块可吸收的明胶、压缩海绵浸泡在盐水中，并用它覆盖受伤部位。
使用四号合成非尼龙跑步缝合线闭合明胶海绵上的肌肉。然后使用 5 毫米的伤口夹固定皮肤。皮下注射 10 微升布比卡因和 490 微升生理盐水，每公斤 1 毫克，完成手术。
然后将 5 微升丁丙诺啡注射到臀肌中，每公斤 100 微克。术。温暖动物并监测它，直到它恢复意识。要重新打开动物进行成像，请像以前一样诱导麻醉，然后根据制造商和说明取下伤口夹。
如有必要，将脱毛产品涂抹在切口周围区域。这一次，用聚维酮碘和 70% 酒精进行额外的磨砂膏。现在，沿着之前的切口重新打开皮肤。
拆下剩余的缝合线，根据需要用剪刀用镊子打开肌肉。在解剖显微镜下，用剪刀沿着椎骨的横突为脊髓夹制作口袋，椎板切除术上方一层，椎板切除术下方一层。将脊髓稳定器的夹子插入每个椎骨周围并拧紧夹子。
调整夹子，使脊髓与成像平台平行，组织稳定。如果看到呼吸伪影，请调整夹子以尽量减少移动。然后盖上夹具和副纸。
接下来，用镊子小心地去除凝胶泡沫。尽可能多地去除。此外，去除脑膜上可能存在的任何厚疤痕组织。
去除所有凝胶泡沫后，用生理盐水覆盖脊髓。如果发现出血，请使用明胶海绵止血。如有必要，在烧灼期间使用烧灼。
小心不要触摸脊髓，并用生理盐水和凝胶泡沫覆盖脊髓。现在创建一个井来容纳浸液，用氰基丙烯酸酯粘合剂密封皮肤和组织。然后在两个夹子之间建立一个牙科丙烯酸井。
让井有时间固化。固化后，用人工 CSF 填充孔。在这些步骤中，请继续监测出血情况。
此时，可选择将荧光血管模具注射到尾静脉中。为了在成像过程中突出显示血管，请使用 70 道尔顿量子点以上的荧光 DExT 链或荧光标记的凝集素。在成像过程中，将鼠标保持在 37 摄氏度的受控环境中 在显微镜载物台上，成功准备的最关键步骤是确保脊髓清洁、不出血，并且没有可见的呼吸伪影。
在成像过程中，通过监测动物的呼吸定期检查麻醉水平，呼吸应在每分钟 60 到 100 次呼吸之间。通过调整 ISO 氟水平来纠正麻醉。成像后，将动物放回手术部位，取下脊柱夹并将丙烯酸从皮肤上拉出。
然后可以在初始手术结束时关闭小鼠以进行后续成像，或者在受伤后 5 天安乐死。产钳插入部位仍然可见，但由于炎症引起的继发性损伤，病变已经开始变大。病变末端的轴突已从损伤的初始部位缩回。
同时，可以看到大量 CX 三个 C 1 阳性细胞，小胶质细胞或巨噬细胞浸润到挤压病灶内部和周围，以识别这些细胞在病灶微环境中的行为，首先使用辐射嵌合体模型。CX 3 CR 1 阳性 GFP 小鼠的骨髓祖细胞被非荧光供体细胞取代，因此只能看到 GFP 阳性 CNS 驻留小胶质细胞。其次，将非荧光小鼠中的骨髓祖细胞替换为来自 CX 3 CR 1 阳性 GFP 小鼠的骨髓细胞，以查看骨髓来源的细胞。
在受伤前，唯一检测到的骨髓来源的 GFP 阳性细胞主要是血管旁细胞，据报道，这些细胞在挤压伤后不断从骨髓中被替换。CX 3 C 1 阳性 GFP 细胞沿病变周围血管内部增加。此外，病变中心充满了浸润的 CX 3 CR 1 阳性 GFP 巨噬细胞。
使用这种技术，可以使用不同的转基因动物来标记其他荧光细胞群，以识别它们在脊髓内和其他疾病模型中的相互作用。
概述
本研究利用两光子活体成像技术来探索活体动物模型中脊髓内各种细胞类型之间的相互作用。具体而言，它集中研究了创伤性脊髓损伤环境下小胶质细胞和单核细胞的动态变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 活体成像
背景
- 两光子成像允许实时观察细胞相互作用。
- 使用骨髓嵌合小鼠来区分驻留细胞和骨髓来源的细胞。
- 创伤性脊髓损伤为研究复杂环境中的细胞反应提供了一个模型。
- 这种方法通过保留天然组织结构相比传统技术具有优势。
研究目的
- 观察受伤脊髓中小胶质细胞和单核细胞的移动和相互作用。
- 评估受伤后活体生物的细胞行为。
- 增强对神经炎症反应中细胞动力学的理解。
使用的方法
- 创建带荧光标记细胞的骨髓嵌合小鼠。
- 在脊髓中诱导背柱压碎损伤。
- 多光子成像以捕捉细胞相互作用和运动。
- 在受控条件下进行术后监测和成像。
主要结果
- 成功实时可视化小胶质细胞和单核细胞的相互作用。
- 证明了损伤部位内的细胞运动。
- 突出了活体成像相对于传统方法的优势。
- 提供了对脊髓损伤后细胞反应的见解。
结论
- 两光子成像是研究体内细胞动力学的强大工具。
- 该研究增强了对脊髓损伤中神经炎症过程的理解。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索治疗干预。
常见问题
Executive Industry Relevance
This intravital imaging approach enables real-time visualization of immune cell dynamics in traumatic spinal cord injury, providing mechanistic insights into neuroinflammatory processes. By distinguishing microglia from macrophages in vivo, the method supports target validation and de-risking of immunomodulatory strategies in preclinical CNS disease models. The technique enhances predictive confidence in early discovery by capturing cellular interactions within a physiologically relevant lesion microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial and macrophage infiltration and interaction patterns following dorsal column crush injury.
- Operational Value: Uses bone marrow chimeric models to isolate CNS-resident microglia from bone marrow-derived macrophages for specific target interrogation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing cellular responses in a living system, reducing reliance on artificial culture systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved data on cellular movement and interaction within the lesion site.
- Operational Value: Establishes a reproducible imaging platform for longitudinal tracking of immune cell dynamics post-injury.
- Assay Readiness: Enables standardized visualization of CX3CR1-positive cell populations as a biomarker of inflammatory activation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models secondary injury progression and inflammatory cell infiltration relevant to human spinal cord pathology.
- Operational Value: Facilitates longitudinal imaging sessions to assess therapeutic impact on cellular dynamics over days to weeks.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target engagement with preclinical efficacy evaluation through consistent phenotypic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the neuroinflammation discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling mechanistic follow-up in preclinical models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune cell involvement in spinal cord injury via direct observation of microglial and macrophage behavior.
- Screening: Delivers quantitative imaging outputs such as cell velocity, infiltration density, and interaction frequency for compound screening.
- Analytics: Provides spatiotemporal datasets enabling statistical comparison of cellular phenotypes across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by tracking CX3CR1-positive cell dynamics as a correlate of neuroinflammatory response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable intravital imaging capability applicable across multiple CNS disease models beyond spinal cord injury.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by revealing mechanistic insights into neuroimmune interactions in situ.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized surgical preparation, stabilization, and imaging protocols.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in immunomodulator mechanisms of action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS-targeted therapies based on validated target engagement in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, two-photon microscopy, and bone marrow chimera generation.
- Depends on specialized instrumentation including tunable lasers, spinal cord stabilizers, and temperature-controlled imaging stages.
- Necessitates cross-functional coordination between surgical, imaging, and animal care teams for consistent lesion preparation.
- Involves adaptation considerations when applying the model to other neuronal injury or neurodegenerative contexts.
- Limited by postoperative survival windows and technical challenges in maintaining spinal cord stability during longitudinal imaging.
