活体成像观察小鼠背柱 crush 损伤后轴突与小胶质细胞及巨噬细胞的相互作用

本实验的总体目标是观察损伤脊髓中微胶质细胞、单核细胞及其他细胞类型之间的运动与相互作用。该目标通过以下步骤实现：首先构建骨髓嵌合小鼠，使其脑内常驻微胶质细胞或骨髓来源的巨噬细胞表达荧光标记；第二步是在脊髓背柱制造压伤损伤模型。

然后重新打开动物体腔并固定脊髓。对于多光子成像，最后一步是在损伤区域内获取单张图像或延时录像。最终，图像分析可显示细胞的运动以及细胞与周围基质之间的相互作用。与传统的细胞培养和固定组织等技术相比，该技术的主要优势在于能够在活体动物的天然复杂环境中对细胞进行成像。

进行此手术时，使用嵌合体或双转基因动物。参见文本方案，了解如何在诱导麻醉后标记常驻细胞或骨髓来源细胞，并以每分钟约60至100次呼吸的呼吸频率，用1%至2%的异氟烷维持麻醉。现在，涂抹眼膏，并通过脚趾夹捏测试确认动物已达到外科麻醉平面。

首先剃除目标脊髓区域的毛发，然后用聚维酮碘和70%酒精棉球擦拭皮肤以清洁，为动物铺巾并开孔以暴露手术部位。接着将高压灭菌的器械摆放在无菌铺巾上，其中包括一把4号镊子，其齿尖间距固定为1毫米，并在距尖端1毫米处有标记。

现在可以使用虹膜剪在中线处切开皮肤，暴露肌肉组织。在解剖显微镜下继续进行手术操作。沿中线切开背部肌肉在其附着于背侧脊柱突起处的部位，以暴露脊柱。

这一步骤包括切开斜方肌和背阔肌的韧带。接着，去除横突与背侧突之间的小型旋转肌，以暴露需要切除的特定椎骨椎板。此处已暴露第10胸椎（T10）。

接着，将RO持钳器尖端插入操作上下方的间隙中。然后轻轻上提，确保尖端已牢固就位且未插入过深。随后闭合RO持钳器以去除椎板。

现在，移除残留椎骨的所有较小部分，从而扩大开口。使用30号针头，在硬脑膜上穿刺两个相距一毫米的孔，以作为固定镊子的进入点。然后将固定镊子以90度角穿过硬脑膜插入，保持镊齿上的标记位于硬脑膜上方。

现在，用镊子夹闭10秒。重复此挤压操作两次，每次10秒，然后移除镊子。接下来，将一块可吸收明胶压缩海绵用生理盐水浸湿，并覆盖于损伤部位。

使用4号线、合成非尼龙连续缝合线将肌肉层缝合于明胶海绵之上。然后使用5毫米伤口夹固定皮肤。最后，皮下注射490微升生理盐水中含10微升布比卡因的溶液，剂量为每千克1毫克。

然后，向臀肌注射5微升丁丙诺啡，剂量为每公斤体重100微克。术后，保持动物体温并持续监测，直至其恢复意识。如需重新打开动物进行成像，按前述方法诱导麻醉，随后根据制造商的说明拆除伤口夹。

如有必要，对切口周围的区域使用脱毛产品。随后，用聚维酮碘和70%酒精进行额外的擦洗。现在，沿原切口重新切开皮肤。

用镊子拆除剩余缝线，并根据需要使用剪刀分离肌肉。在解剖显微镜下，用剪刀于椎骨横突处制作用于脊髓夹持器的口袋，位置分别位于椎板切除节段的上一个节段和下一个节段。将脊髓稳定器的夹子插入每个椎骨周围，并拧紧夹子。

调整钳子，使脊髓与成像平台平行，并确保组织稳定。如果观察到呼吸伪影，应调整钳子以尽量减少移动。然后用盖子覆盖钳子和对苯二甲醛。

接下来用镊子小心地移除凝胶泡沫，尽可能清除干净。同时，清除可能存在于脑膜上的任何增厚的瘢痕组织。

一旦清除所有凝胶泡沫，用生理盐水覆盖脊髓。如果发现出血，使用明胶海绵止血。必要时，可在电凝过程中使用电凝。

注意不要触碰脊髓，并用生理盐水和明胶海绵保持其湿润。现在创建一个用于容纳浸没液的围堰，使用氰基丙烯酸酯粘合剂密封皮肤和组织。然后在两个夹具之间用牙科丙烯酸树脂构建一个围堰。

让孔充分固化。固化后，向孔中加入人工脑脊液。在这些步骤中持续监测是否出血。

此时，可选择将荧光血管染料注入小鼠尾静脉。为了在成像过程中突出显示血管，可使用分子量大于70千道尔顿的荧光DExT链、量子点或荧光标记的凝集素。成像过程中，应在显微镜载物台上通过控温环境将小鼠体温维持在37摄氏度。确保制备成功最关键的步骤是：脊髓组织干净、无出血，并且无可见的呼吸运动伪影。

成像过程中需定期通过监测动物呼吸频率来检查麻醉水平，呼吸频率应维持在每分钟 60 至 100 次之间。通过调节异氟烷浓度来调整麻醉深度。成像结束后，将动物送回手术区域，取下脊柱夹具，并将丙烯酸材料从皮肤上剥离。

随后可以关闭小鼠以备后续成像，如同初次手术结束时的操作，或在损伤后第5天实施安乐死。镊子插入部位仍然可见，但由于炎症引起的继发性损伤，病灶已开始增大。病灶远端的轴突已从最初的损伤部位回缩。

同时，大量表达CX3CR1的细胞（小胶质细胞或巨噬细胞）涌入压迫损伤区域及其周围。为了明确这些细胞在损伤微环境中的行为，首先采用辐射嵌合体模型：将CX3CR1阳性GFP小鼠的骨髓前体细胞替换为无荧光的供体细胞，从而使仅有GFP阳性的中枢神经系统常驻小胶质细胞可见；其次，将无荧光小鼠的骨髓前体细胞替换为来自CX3CR1阳性GFP小鼠的骨髓细胞，以观察骨髓来源的细胞。

损伤前，检测到的骨髓来源的GFP阳性细胞主要位于血管周围，据报道，这些细胞在挤压损伤后会持续从骨髓中得到补充。损伤周围血管内侧的CX3C1阳性GFP细胞数量增加。此外，病灶中心充满了浸润的CX3CR1阳性GFP巨噬细胞。

利用该技术，可使用不同的转基因动物来标记其他荧光细胞群体，以鉴定这些细胞在脊髓内以及其他疾病模型中的相互作用。