Name: 处理棉鼠的研究为溶瘤病毒的临床前评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 了解棉鼠安全捕捉与处理方法，通过富集管转移技术减少动物应激反应，提高临床前研究可靠性。该方法使用专用鼻锥进行麻醉诱导，适用于溶瘤病毒等生物医学研究的动物模型建立。

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Breanne Cuddington 获得了加拿大乳腺癌基金会的资助。本研究得到了癌症研究学会和加拿大癌症研究所（前身为加拿大乳腺癌研究联盟）的运营资助。我们感谢圣路易斯大学医学院的 Ann Tollefson 提供 LCRT 细胞，感谢 Kathleen Delaney 博士和 Marion Corrick 在棉鼠饲养和镇静方面的技术支持。

注意：所采用的实验方案已根据加拿大动物护理委员会指南，获得麦克马斯特大学机构动物研究伦理委员会的批准。实验在麦克马斯特大学中心动物设施中进行。

1. LCRT 细胞的培养
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 µg/ml 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养LCRT细胞。将细胞维持在37 °C、5% CO2 的T-150组织培养瓶中。当细胞形成90%融合的单层时进行传代（每2-3天一次，图1）。</li>
	<li>在细胞传代前10分钟，将1×磷酸盐缓冲液（PBS）、1×胰蛋白酶和培养基置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>吸除培养瓶中的培养基，并用5 ml 1× PBS冲洗细胞。</li>
	<li>冲洗后，吸除PBS，加入2 ml 1×胰蛋白酶孵育，直至细胞从培养瓶表面解离（约2分钟）。</li>
	<li>用8 ml培养基重悬细胞（总体积为10 ml细胞悬液），轻轻吹打数次以分散细胞团块。</li>
	<li>将1 ml细胞悬液接种至24 ml培养基中（T-150培养瓶总体积为25 ml），轻柔左右摇晃培养瓶混匀。将细胞继续在37 °C、5% CO2 条件下培养，直至下次传代。</li>
</ol>
2. 在 LCRT 细胞中评估病毒复制与细胞毒性
<ol>
	<li>病毒复制 
	注意：在内源性病毒启动子控制下表达荧光标记（如绿色荧光蛋白，GFP）的病毒构建体，可通过荧光酶标仪可视化病毒的感染与扩散过程。
	<ol>
		<li>将LCRT细胞接种至培养板中，预留一孔用于细胞计数。接种密度应使细胞在次日达到80–90%汇合度。使用浓度为105 个细胞/ml（每孔100 µl）的细胞悬液，在96孔平底板中培养一天后可达到所需汇合度。</li>
		<li>次日，在开始实验前，将1× PBS、1× 胰蛋白酶、完全培养基和无血清培养基置于37 °C水浴中预热10分钟。</li>
		<li>吸除计数孔中的培养基，并用5 ml 1× PBS轻轻晃动冲洗细胞表面。</li>
		<li>冲洗后，吸除PBS，加入2 ml 1× 胰蛋白酶孵育，直至细胞从培养瓶表面脱落（约2分钟）。</li>
		<li>使用血细胞计数板，将细胞重悬于适当体积的完全培养基中，使细胞密度处于可计数范围内。为确保计数准确，在接种血细胞计数板前，需通过反复吹打充分混匀细胞悬液。</li>
		<li>确定在目标感染复数（MOI）下所需的病毒储存液体积。 
		所需空斑形成单位（pfu）= 接种细胞数 × MOI（pfu/细胞） 
		所需病毒储存液体积 = 所需pfu / 病毒储存液滴度（pfu/ml）</li>
		<li>在离心管中用无血清培养基配制病毒感染液。在加入细胞前，通过涡旋或吹打充分混匀。</li>
		<li>在37 °C条件下感染细胞1小时，随后覆盖含DMEM + 1% FBS的维持培养基。</li>
		<li>感染后第1天和第2天扫描培养板，观察GFP荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒细胞毒性 
	注意：由于刃天青（resazurin）具有光敏感性，因此应在低光照条件下进行刃天青细胞毒性检测。应设置仅含培养基的孔，用于校正背景荧光。
	<ol>
		<li>用1× PBS配制5%（v/v）的刃天青溶液。通过移液充分混匀。</li>
		<li>吸除细胞中的培养基，加入5%刃天青溶液。设置一个仅含培养基的孔，用于校正背景荧光。</li>
		<li>在37 °C孵育30分钟，随后使用荧光酶标仪检测荧光信号（激发波长530 nm，发射波长595 nm）。</li>
		<li>相对于未感染对照组分析数据，并校正背景荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 饲养与操作
<ol>
	<li>饲养与饮食
	<ol>
		<li>将棉鼠单独饲养，以减少在聚碳酸酯鼠笼中的争斗行为，笼内铺有啮齿类动物垫料（1/8英寸玉米芯垫料），并放置一段不超过8英寸的PVC管和垫巢材料作为环境丰容物（图2）。</li>
		<li>使用可固定的金属丝篮置于笼子上方，用于放置啮齿类食物和饮水瓶。 
		注意：此种笼具设置有助于安全且便捷地捕捉动物，其中将丰容管紧靠笼子一端放置尤为关键。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操作
	<ol>
		<li>应在早晨处理棉鼠，避免在动物设施技术人员例行巡查前惊扰动物，以防其在实验前过度兴奋。</li>
		<li>在所有操作过程中，均应佩戴厚实的皮革手套以提供保护。</li>
		<li>由于动物通常停留在丰容管内，可在日常清洁时利用该管将其转移至新笼中。或者，可稍微打开笼盖，使操作者将手伸入笼内，随后通过抓握肩部上方皮肤并向下按压的方式固定动物。操作时需谨慎，避免用力过猛，以防动物咬伤舌头。</li>
		<li>应保持耐心并动作稳定，因为这些动物具有强烈的逃跑或对抗反应，会试图通过奔跑和跳跃逃离笼子。重要的是，切勿抓握动物尾巴进行操作，否则可能导致尾部脱套（degloving）。</li>
		<li>应优先通过诱捕其所在丰容管的方式进行捕捉，而非直接徒手操作。此举可显著减少受伤和逃逸事件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 捕获与麻醉
<ol>
	<li>捕获
	<ol>
		<li>所有操作过程中均需佩戴厚实的皮革手套以提供保护。</li>
		<li>使用一个带有通气孔和盖子的大型透明塑料容器、一个足以容纳该容器的麻醉诱导室，以及连接在气体输出管上的鼻罩（图3）。</li>
		<li>两人协作操作，以提高效率并减少动物暴露于吸入性麻醉剂异氟烷的时间。确保一名研究人员负责打开和重新盖上笼具的钢制盖板及诱导室的盖子（操作员 #1），其助手负责将动物从管中捕获并转移至诱导室（操作员 #2）。</li>
		<li>将笼具置于平坦表面上，取下外层盖子。轻轻抬起钢制饲料托盘，缓慢移动 enrichment 管，使其与笼具侧壁平行并紧贴后壁。如有必要，可在不打开笼具的前提下使用工具调整 enrichment 管位置，以避免惊扰动物（操作员 #1）。</li>
		<li>若动物受惊并离开管内，应给予足够时间使其放松，并再次回到管中（操作员 #1）。</li>
		<li>缓慢而有意识地抬起远离 enrichment 管一侧的钢制盖板边缘，保持另一端与笼具接触，形成足够容纳塑料容器的空间（操作员 #2）。</li>
		<li>以平稳快速的动作将塑料容器覆盖在 enrichment 管上方。保持容器与笼具侧壁接触，将动物困于管内。应尽快完成步骤 4.1.6 和 4.1.7（操作员 #2）。</li>
		<li>取下钢制饲料托盘，并将塑料容器盖交给操作员 #2（操作员 #1）。将塑料盖板从笼具侧边滑入容器之间，操作时需注意避免夹伤动物肢体。不要完全密封容器，以免增加下一步操作难度（操作员 #2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>确保容器保持封闭，将动物转移至诱导室。迅速将动物放入诱导室，并以连贯动作取下容器盖（操作员 #2）。打开并立即重新盖上诱导室盖（操作员 #1）。</li>
		<li>开启异氟烷气流至诱导室（5 L/min），观察动物是否出现嗜睡迹象；一旦出现，立即迅速将动物连同管和容器一起滑出诱导室，以利于气体流通。</li>
		<li>当大鼠完全麻醉后，将其转移至操作台面，并将鼻部和口部置入鼻罩中（图3）。判断大鼠完全麻醉的标准是其对用力捏足趾无反应。</li>
		<li>在动物眼部涂抹兽用凡士林眼膏，防止干燥和擦伤。此步骤至关重要，因为棉鼠眼球较大，若受伤易发生感染。</li>
		<li>密切监测并维持稳定的呼吸频率，确保在整个操作过程中动物鼻部始终紧贴鼻罩。根据需要适当调节异氟烷流量。每只动物所需的异氟烷剂量可能有所不同。</li>
		<li>操作结束后，将动物放回其笼具，并确认其恢复完全活动能力及胸骨卧姿。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于皮下肿瘤形成的 LCRT 细胞的制备
注意：一个 LCRT 细胞的 T-150 培养瓶（90% 汇合度）可收获约 2 × 107 个细胞。根据所需细胞总数确定所需的 T-150 培养瓶数量。建议额外接种若干培养瓶，以确保获得足够的细胞总数，并弥补制备过程中损失的细胞以及额外注射所需的细胞。在操作过程中应尽可能将细胞置于冰上，以延长细胞活性。
<ol>
	<li>收集细胞时，吸除培养瓶中的培养基，并用 5 ml 的 1× PBS 清洗细胞。</li>
	<li>吸除 PBS，加入 2 ml 的 1× 胰蛋白酶，孵育至细胞从培养瓶表面脱落（约 2 分钟）。</li>
	<li>用 8 ml 培养基重悬细胞（总体积为 10 ml 细胞悬液），轻轻吹打混匀以分散细胞团块。继续从其他培养瓶中收集细胞。</li>
	<li>将所有细胞悬液汇集至一个锥形管中，每 50 ml 锥形管约合并 4 个 T-150 培养瓶的细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 160 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用适当体积的 PBS 重悬细胞沉淀（每 T-150 培养瓶使用 10 ml PBS），使细胞密度处于血细胞计数板可计数范围内。为确保计数准确，在将细胞悬液加载至血细胞计数板前，需通过反复吹打充分混匀细胞悬液。</li>
	<li>计算细胞总数： 
	收获的细胞总数 = 细胞浓度（个/ml）× 重悬体积（ml）</li>
	<li>确定所有注射所需细胞悬液体积。每个实验额外准备 2–3 份剂量。每只小鼠皮下注射 5 × 105 个 LCRT 细胞，可在 3–4 天内形成可触及的肿瘤。 
	所需细胞总数 = 5 × 105 个细胞 × 总注射剂量数 
	所需细胞悬液体积（ml）= （所需细胞总数 × 各注射体积之和）/ 收获的细胞总数</li>
	<li>将所需体积的细胞悬液移入含有 PBS 的锥形管中，充分混匀。分装单次注射剂量（100 µl）至离心管中。注射过程中保持离心管置于冰上。</li>
</ol>
6. 注射
注意：操作需由两名研究人员共同完成，一人进行注射，另一人监测动物在麻醉期间的呼吸频率和总体状况。所有注射均使用胰岛素注射器（29 G x 1/2’，0.3 ml），且每只动物使用新的针头。
<ol>
	<li>皮下注射
	<ol>
		<li>抓取并麻醉动物（第4节）。</li>
		<li>使用电推剪剃除注射部位的毛发。棉鼠毛发浓密，需使用锋利的修剪器才能获得适合注射的平滑表面。用棉签蘸取70%乙醇清洁注射部位，并待其完全挥发后再进行下一步操作。</li>
		<li>将细胞缓慢而稳定地吸入注射器（29 G × 1/2’，0.3 ml）中。若存在气泡，应用力轻弹注射器使气泡上移。待气泡聚集至顶部后，推动活塞使液体升至针尖顶端。</li>
		<li>提起注射部位皮肤（称为“皮肤帐篷”法），针尖斜面向上刺入皮下。确保针头可在皮下自由移动，以避免将药物注入肌肉内。</li>
		<li>均匀而缓慢地推注注射器内容物。拔针时针尖斜面向下退出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>瘤内注射
	<ol>
		<li>抓取并麻醉动物（第4节）。</li>
		<li>用棉签蘸取70%乙醇清洁注射部位，并待其完全挥发后再进行下一步操作。</li>
		<li>将病毒接种物缓慢而稳定地吸入注射器（29 G × 1/2’，0.3 ml）中，操作时保持针头朝上。若存在气泡，应用力轻弹注射器使气泡上移。待气泡聚集至顶部后，推动活塞使液体升至针尖顶端。</li>
		<li>针尖斜面向上刺入肿瘤组织，同时以扇形方式缓慢移动针头，边注射边均匀而缓慢地推出注射器内容物；每次移动前部分回撤针头，以防止肿瘤组织撕裂。拔针时针尖斜面向下退出。 
		注：皮下LCRT肿瘤生长迅速，通常在5–7天内可达约100 mm3。此外，肿瘤表面常在数天内形成坏死和出血区域，需密切监测（图4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔注射
	<ol>
		<li>抓取并麻醉动物（第4节）。</li>
		<li>用棉签蘸取70%乙醇清洁注射部位，并待其完全挥发后再进行下一步操作。</li>
		<li>将药物缓慢而稳定地吸入注射器（29 G × 1/2’，0.3 ml）中。若存在气泡，应用力轻弹注射器使气泡上移。待气泡聚集至顶部后，推动活塞使液体升至针尖顶端。</li>
		<li>将针头插入腹部右下象限。回抽活塞，确认无血液或粪便被吸入，此现象提示针头位置错误。若发生此情况，应立即拔出针头并准备新的注射器。当针头位置正确后，均匀而缓慢地推注注射器内容物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 肿瘤切除与解剖
<ol>
	<li>在对动物实施安乐死后，使用70%乙醇清洁所有工具。</li>
	<li>采用理想的方法处死动物，CO2 建议吸入（2 L/min，持续5-10分钟）。检查动物体况是否存在任何异常。</li>
	<li>将动物置于解剖板上呈仰卧位，并用70%乙醇清洁动物体表。</li>
	<li>用镊子提起下腹部的皮肤，用剪刀剪开皮肤和肌肉，沿动物体中线从肛门至下巴做一纵行切口。</li>
	<li>沿肋骨侧缘向上做一侧向切口，并在胸骨处做一横向切口，剪开肋骨，以暴露心脏和肺。检查肺叶是否存在转移灶。 27,29.</li>
	<li>检查所有器官是否存在异常，记录颜色、大小和质地的任何变化。必要时使用手术刀切开器官，以检查内部组织。重点检查肝脏、肾脏、脾脏和胃肠道。</li>
	<li>检查淋巴结是否有转移和肿大 27,29.</li>
	<li>为采集肿瘤，使用镊子在肿瘤上下方的侧腹处做切口，以便将皮肤从身体上剥离。用镊子牢固夹住皮肤的同时，使用手术刀小心地在肿瘤与真皮之间进行切割，以分离肿瘤。图5).</li>
	<li>立即将肿瘤放入含有10%中性缓冲福尔马林的标记容器中。</li>
	<li>根据肿瘤大小，孵育时间设定为1-2天（≤ 2 mm，小肿瘤）或5-6天（&#62; 2 毫米，大型）用于在制备组织学分析切片前的固定（图6).</li>
</ol>

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</ol>

作者声明本研究不存在与之相关的财务利益冲突。

棉鼠具有高度兴奋性，并表现出强烈的逃跑反应。因此，应特别注意尽量减少动物遭受的不必要应激。所描述的笼具设置可实现对动物的安全且便捷的捕捉，其中丰富化管道的放置位置尤为关键。在设置笼具时，应确保丰富化管道符合规定的尺寸和形状要求，并正确地安装在笼内。同时，必须确保所有可能参与动物饲养管理的技术人员均了解该动物饲养的特定要求。采取这些预防措施可减少在实施操作前动物的烦躁情绪。此外，建议在早晨进行操作，以避免受到技术人员或动物设施工作人员的其他提前干预。在动物处于平静状态时开始操作，有助于顺利捕捉和处理动物。
强烈推荐使用巢材垫料。在自然环境中，这些啮齿类动物会用棉花筑巢，因此当允许它们在笼内自行筑巢时会更加舒适。巢穴还有助于动物捕捉，使得无需再依赖 enrichment 管来定位动物。在这种情况下，可直接从上方将塑料容器垂直放置在动物身上。随着实验的进行，这种方法尤为实用，因为大鼠可能会逐渐适应并躲避传统的捕捉方式。
在处理棉鼠时，研究人员保持冷静并进行有意识的动作至关重要。这些动物能够感知到不安情绪，并会对操作者表现出的情绪状态...

溶瘤病毒（OV）通过利用正常细胞与肿瘤细胞之间的生物化学差异，选择性地在肿瘤细胞中复制1,2。OV分为两类：一类无需突变即可实现选择性溶瘤，称为天然野生型病毒；另一类则需经过基因工程改造才能实现选择性溶瘤。特定肿瘤类型中所包含的突变组合，决定了OV相对于正常细胞的选择性生长优势的性质2。临床试验已证实了使用OV的安全性和治疗获益3-7。尽管溶瘤病毒治疗领域已取得进展，但临床前研究与临床结果之间仍存在差距，提示需要建立更佳的模型来评估OV的抗肿瘤疗效。
牛疱疹病毒1型（BHV-1）属于疱疹病毒科（Herpesviridae）中的α疱疹病毒亚科（Alphaherpesviridae）。BHV-1可引发牛呼吸道疾病综合征，临床表现多种多样，类似于严重感冒8,9。BHV-1利用与HSV-1相同的附着和进入受体，如硫酸乙酰肝素和nectin-110；然而，在nectin-2的位置上，BHV-1结合的是CD15510。BHV-1的宿主范围非常狭窄，无法有效进入并启动在正常或转化的小鼠细胞中的复制过程3,4,10，这使得传统小鼠模型的应用受到限制。BHV-1的溶瘤能力已在体外得到证实in vitro11,12。研究表明，BHV-1可在多种组织来源的人类肿瘤细胞中启动复制并导致其死亡，包括乳腺癌细胞及乳腺癌起始细胞11,12。然而，BHV-1的抗肿瘤能力必须在具有完整免疫系统的宿主环境中进行体内（in vivo）评估。
人腺病毒（Ad）已鉴定出 57 种血清型，通常在人类中引起呼吸道疾病。溶瘤型 Ad 载体的抗肿瘤效果已得到广泛评估，其中多种已进入临床试验13-15。尽管前期临床前研究数据令人鼓舞，但临床结果仍未达到预期。通常采用人肿瘤异种移植模型来研究 Ad 载体的抗肿瘤效果，但这些模型对病毒的免疫反应较弱16,17。此外，同源小鼠模型对 Ad 感染不敏感，因此利用这些模型评估宿主免疫反应并不可行17,18。
宿主免疫系统被认为是溶瘤病毒（OVs）诱导肿瘤细胞死亡的最主要机制19。在对肿瘤相关抗原（TAA）耐受与非耐受的模型之间，抗肿瘤反应存在差异，并可显著影响OV治疗的效果。HSV-1溶瘤病毒KM100（ICP0n212VP16in181420)20,21在小鼠多瘤病毒中T抗原乳腺癌模型中，可使80%荷瘤小鼠的肿瘤发生消退22。然而，在HER-2/neu模型中，KM100的抗肿瘤效果在同源小鼠中表现为20%的完全缓解，而在转基因的HER2耐受小鼠中仅表现为肿瘤停滞。这些数据共同强调了使用最能模拟人类免疫环境的动物模型对OV进行全面评估的重要性，以充分明确决定治疗成功的关键因素。
棉鼠（Sigmodon hispidus）原产于北美洲和南美洲，最常被用作呼吸道合胞病毒（RSV）感染的动物模型（如文献5所述）。棉鼠也用于抗牛疱疹病毒1型（BHV-1）疫苗的研究，因为其可重现与牛呼吸道疾病综合征相关的病理特征6,23。此外，BHV-1感染棉鼠具有免疫原性，可诱导持续的黏膜和全身免疫应答6,23-25。已从乳腺自发性纤维肉瘤和骨肉瘤中分别建立了细胞系（LCRT、CCRT 和 VCRT）26。由于棉鼠对腺病毒（Ad）感染易感，且其病理表现与人类相似，因此被用于评估溶瘤腺病毒载体的体内疗效27-29。在溶瘤病毒（OVs）的临床前疗效评估中，使用免疫缺陷模型不仅难以准确反映临床治疗反应，而且忽略了免疫系统在溶瘤病毒治疗中的作用30,31。因此，对于无法在常规小鼠模型中研究的溶瘤病毒（如BHV-1和Ad），采用同源性且对肿瘤耐受的棉鼠乳腺癌和骨肉瘤模型，是进行临床前疗效评估的相关且合适的模型体系。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;s 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>可使用任意品牌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1X 磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>可在实验室中制备，过滤除菌</td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>可使用任何品牌</td></tr><tr><td>100x 抗生素-抗真菌素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>可使用任何品牌</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Quality Biological 公司</td><td>110-001-101HI</td><td>可使用任何品牌</td></tr><tr><td>T-150cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-80</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>1X TypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板，平底</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td>可使用任意品牌，但必须经过组织培养处理</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>可使用替代试剂测定细胞活力</td></tr><tr><td>8640 Teklad 22/5 啮齿类动物饲料</td><td>Harlan&amp;nbsp;</td><td>8640</td><td></td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; 玉米芯动物垫料</td><td>Harlan</td><td>7092</td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare</td><td>-</td><td>由原生棉纤维浆制成，无尘且可高压灭菌</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>可使用任何品牌，必须无菌</td></tr><tr><td>异氟烷 USP，99.9%，吸入用麻醉剂</td><td>加拿大制药合作伙伴公司</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>可在实验室制备</td></tr><tr><td>10 % 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>NAPCO NapFlow 1200 II 级 A/B3 型生物安全柜（细胞培养罩）</td><td>NAPCO</td><td>所用模型目前不可用</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技精密加热水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>所用模型目前不可用&amp;nbsp;</td><td>可使用任何品牌</td></tr><tr><td colspan="4">[页眉]</td></tr><tr><td>Reichert Bright-line 血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>Typhoon Trio BioAnalyzer&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>所用模型目前不可用&amp;nbsp;</td><td>可使用任意荧光酶标仪</td></tr><tr><td>Tecan Safire&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 多功能微孔板读板机</td><td>Tecan</td><td>所用模型目前不可用&amp;nbsp;</td><td>可使用任何荧光酶标仪</td></tr><tr><td>Allegra 6R 台式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>台式麻醉机</td><td>VetEquip</td><td>所用模型目前不可用&amp;nbsp;</td><td>可使用任何品牌，但必须为便携式</td></tr><tr><td>Wahl 花生迷你修甲钳</td><td>Wahl</td><td></td><td>可使用任意品牌的微型剪刀</td></tr><tr><td>胰岛素注射器 29 G x 1/2'，0.3 mL</td><td>BD</td><td>329464</td><td>可使用任意品牌。建议使用胰岛素注射器，因其可使大鼠注射更简便&amp;rsquo;坚韧的皮肤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>棉签</td><td>MedPro</td><td>018-425</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>尖头解剖剪</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>可使用任意品牌</td></tr><tr><td>解剖组织镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>可使用任何品牌</td></tr></tbody></table>

在溶瘤病毒临床前评价研究中棉鼠的处理

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

溶瘤病毒是一种新型的抗癌疗法，能够靶向肿瘤细胞，同时保持健康细胞不受损伤。研究表明，该策略的成功实施需要宿主免疫系统的参与。因此，溶瘤病毒治疗应在具有完整免疫功能的动物模型中进行评估。此外，在免疫耐受动物模型中研究抗肿瘤疗法，可能更接近临床试验中观察到的结果。棉鼠常用于呼吸道病毒研究，同时也是研究溶瘤病毒治疗的理想模型，因为其同基因型的乳腺癌和骨肉瘤模型均已建立成熟。然而，目前尚缺乏关于如何正确处理这些高度敏感啮齿类动物的操作规范。本文所述的抓取与处理方法可最大限度地减少动物应激，从而有利于实验的开展。该技术的关键在于研究人员在操作过程中保持冷静，并及时完成各项步骤。最后，我们介绍了如何制备棉鼠乳腺肿瘤细胞以实现稳定可靠的皮下成瘤，以及如何进行瘤内和腹腔注射。这些方法可广泛应用于各类研究，进一步推动棉鼠作为抗肿瘤治疗相关临床前模型的发展与应用。

由于棉鼠具有极强的兴奋性，熟悉并采用优化的操作流程以减少动物应激反应，将有助于将其更顺利地应用于临床前动物模型。正确使用操作技术还可降低研究人员面临的风险。
使用棉鼠时必须保持冷静。棉鼠极易兴奋，会试图逃离笼子。使用 enrichment tube 和 nestlets 可以减少其逃跑行为。图2展示了有助于捕捉棉鼠的最佳笼具设置，包括 enrichment tube 的放置位置。此外，尽量在较小的房间内操作，以便于重新捕捉。一旦发生逃跑，应等待动物安静下来并保持静止，然后用透明捕捉容器将其盖住，或用手套覆盖，注意不要用力过猛。
与小鼠不同，棉鼠具有一个延长的吻部，因此需要使用不同的鼻部适配器来输送麻醉气体。图3展示了一种专为棉鼠设计的鼻罩，可实现异氟烷的高效输送。使用橡胶膜作为适配器可能会对棉鼠的鼻部造成损伤。
如果可能，应获取废弃动物（其他研究人员不需要的棉鼠或其他动物），在棉鼠身上进行注射技术练习之前...

棉鼠极易兴奋，并具有强烈的逃跑或对抗反应。本文介绍了一种优化的抓取方法，旨在减少动物应激反应，从而使棉鼠更适合作为临床前研究模型。

溶瘤病毒是一种新型抗癌疗法，能够靶向肿瘤细胞，同时保持健康细胞不受损伤。该策略要实现……

本实验的总体目标是展示一种安全处理和捕捉棉鼠的特定方法，旨在减少动物所承受的压力。该方法首先将一个丰富化管筒紧贴鼠笼的一端，并在上方放置一个可固定的钢制篮子。第二步，穿戴好适当的个人防护装备，然后让棉鼠自行爬入丰富化管筒中。然后将管子紧贴笼壁，迅速将捕获的动物转移到带有通气孔的塑料容器中，以便运送至麻醉诱导室。最后一步是为动物佩戴专为棉鼠吻部特制的特殊鼻罩，以实现完全镇静。最终，该捕获方法可用于安全地处理棉鼠，从而降低其应激反应并提高安全性。在使用这些高度敏感的啮齿类动物进行临床前研究时，由于文献中关于棉鼠的抓取、饲养和行为特征存在不一致之处，初次接触该方法的研究人员通常会遇到困难。对该方法进行可视化演示，对于补充书面描述、帮助研究人员应对与棉鼠操作相关的各种行为挑战至关重要。本次操作演示将由本实验室的研究生 Brianne Cuttington 和博士后研究员 Megan er 完成。为减少争斗行为，棉鼠应单独饲养于聚碳酸酯笼架中的笼内，垫料为八分之一英寸的玉米芯，另提供一段不超过八英寸的PVC管以及用于环境丰容的垫巢材料，以便安全、便捷地抓取动物。将富集管放置在笼子末端，然后在笼子上方放置一个可固定的陈旧篮子，篮子内装有啮齿类动物饲料和饮水瓶。现在准备一个带有通气孔和盖子的大号透明塑料容器，以及一个麻醉诱导室，其空间需足够容纳该容器，并能安装连接到气体输出软管的鼻锥。请注意，棉鼠的吻部较长，需要使用不同形状的鼻锥来输送麻醉气体，如本图所示的鼻锥，其设计专为适配棉鼠而优化，适用于成对操作。研究人员在操作的各个阶段均应佩戴厚实的皮革手套以进行防护。当两名研究人员准备就绪后，将动物笼子放置于平坦的表面上，并取下外层盖子。随后，当动物进入丰富化管内时，轻轻抬起钢制饲喂托盘，并缓慢移动该管，直至其与笼子两侧平行并紧贴笼子后壁。接下来，缓慢而谨慎地抬起钢制盖子中距离富集管最远的一侧边缘，同时保持另一端与笼子接触。由第二位研究人员留出足够空间以放入塑料容器。然后以平稳、迅速的动作，将塑料容器推至富集管顶部。保持容器与笼子侧面接触，将动物困在管内。抓取棉鼠时，耐心并保持手部稳定非常重要，因为这些动物具有强烈的逃跑或反抗反应，会通过奔跑和跳跃试图逃离笼子。如果动物逃脱，切勿通过尾巴进行抓取。由于可能发生脱套伤，请移除钢制进样托盘，并将塑料容器盖交给另一位研究人员。然后将塑料盖在笼子侧面与容器之间滑动，注意过程中避免夹到动物的附肢，在关闭容器时不要密封，但需确保容器保持关闭状态。将动物转运至诱导室。然后由一名研究人员迅速将动物放入室内，并以流畅的动作取下容器盖，同时另一名研究人员打开并立即更换诱导室的盖子。最后，在麻醉给药完成后，将大鼠放回笼中并进行监测，直至动物恢复完全活动能力及胸卧位。注入有活力的肿瘤细胞对于形成正确的肿瘤至关重要。在本图中，显示了可用于注射到棉签中的健康LCRT单层细胞。相比之下，这些LCRT细胞活力较低，不应用于注射。LCRT细胞形成的肿瘤生长迅速，因此常出现坏死中心。应密切监测肿瘤的形成，以避免发生溃疡。如果出现溃疡，应处死动物，以防止感染及可能由败血症导致的死亡。切除后保持肿瘤组织的完整性，将获得更能准确代表体内肿瘤状态的样本。例如，此处展示了一种切除技术，即使用手术刀和镊子将肿瘤从周围组织中仔细分离，如本图所示。这种切除技术可保持肿瘤致密且高度血管化的结构，对于分析影响肿瘤血管系统的治疗手段具有重要意义。与许多溶瘤病毒实验类似，在进行该操作时，重要的是要保持冷静，并缓慢而有条不紊地执行每一步骤，以避免刺激棉鼠。观看本视频后，您应能充分了解如何安全地捕捉和处理棉鼠。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

处理棉鼠的研究为溶瘤病毒的临床前评估

RNA干扰（RNAi）相较于基因敲除具有多种优势，已被广泛用作基因功能研究的工具。基于DNA载体的RNAi技术的发明使得长期且可诱导的基因沉默成为可能，同时也提高了基因沉默的可行性。 体内.

基于DNA载体的RNA干扰技术用于研究癌症中的基因功能

该视频展示了通过肝动脉注射进行溶瘤病毒的局部区域递送，作为肝细胞癌的一种治疗策略。这些病毒可在肿瘤细胞中选择性复制，诱导细胞裂解并释放肿瘤细胞相关抗原。此过程可触发免疫原性细胞死亡，从而诱导抗肿瘤免疫反应。...

通过肝动脉递送溶瘤病毒靶向肝脏肿瘤

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在大鼠模型中建立活性HIV感染

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向大鼠黑质注射病毒载体以建立神经退行性疾病模型

本方案描述了在大鼠进行学习与记忆任务时，如何暂时且远程地抑制离散脑区中神经元活动的方法。该方法结合了药理遗传学（仅由设计药物激活的设计受体）与一种行为范式（感觉预条件），旨在区分学习过程中的不同组分。...

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经动脉给予溶瘤病毒用于大鼠原位肝细胞癌的局部区域治疗

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