Name: 神经元的3-D成像和分析感染在体内与弓形虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学习弓形虫感染神经元的三维成像与分析方法，利用共聚焦显微镜观察160微米厚脑切片中寄生虫与宿主神经元的空间关系，为神经感染研究提供可靠技术。

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感谢Koshy实验室全体成员的有益讨论。感谢亚利桑那大学神经科学系的Patty Jansma及其团队在成像方面的建议和帮助。同时感谢Porreca实验室提供Vibratome设备的使用。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH NS065116，A.A.K.）的资助。

注意：小鼠在亚利桑那大学的温度和湿度受控环境中饲养，采用12小时反转光照/黑暗循环，可自由获取食物和水&#160;ad libitum。实验均在亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会的指导方针及批准下进行。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦。Cre报告小鼠品系背景为C57BL/611，可商业获得。
1. 小鼠感染
注意：以下所述的小鼠感染Toxoplasma gondii的方法已在先前发表的研究中使用过10–12。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>培养 弓形虫 在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（cDMEM）的杜尔贝科高糖改良伊格尔培养基（DMEM）中，于5% CO₂培养箱内的T-25培养瓶中培养的人包皮成纤维细胞（HFFs）中的菌株2 孵育至寄生虫形成较大的寄生泡。</li>
	<li>用注射器释放寄生虫：从培养瓶底部刮取细胞，将所得溶液在培养瓶内通过连接3 ml注射器的25号针头推注2次，然后将全部溶液转移至连接27号针头的5 ml注射器筒内，该针头已倒置放入15 ml锥形管中。将活塞连接至注射器，推动活塞将寄生虫溶液注入锥形管内。</li>
	<li>将管子在300 × g下离心10分钟。吸除上清液，然后将沉淀重悬于4–6 ml无菌USP级1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（储存液）中。</li>
	<li>用10 µl原液加载血细胞计数板，静置5-10分钟使寄生虫沉降，然后计数中央大方格的四个角和中心五个中方格内的寄生虫数量。</li>
	<li>将寄生虫用1×PBS稀释至适当的接种浓度（100K/200 µl），然后以200 µl总体积通过腹腔注射（i.p.）接种小鼠。 
	注意：本实验中，小鼠接种了 100K 型 III（CEP）13 200 µl 1x PBS 中的速殖子。用其他弓形虫株感染小鼠时，可能需要根据毒力水平调整接种物浓度。</li>
</ol>
2. 灌注与脑组织采集
注意：本实验方案在感染后21天（dpi）进行，因为此时小鼠脑内包囊数量达到峰值，但也可使用其他时间点。包囊的大小、数量、位置以及是否存在取决于多种因素，包括小鼠品系、弓形虫株型以及接种量7,14–17。研究人员需根据自身所用的小鼠和Toxoplasma株系 individually 确定合适的接种量。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>准备所有手术取材工具（图1).</li>
	<li>为每只小鼠准备并置于冰上：一支装有0.9%氯化钠（NaCl）+ 10 U/ml肝素溶于1×无菌USP级PBS的20 ml注射器（肝素/生理盐水）；一支装有4%多聚甲醛（PFA）的20 ml注射器；一个含有15 ml 4% PFA的闪烁瓶。对于多只小鼠，准备一个烧杯，装入所有小鼠所需每种溶液的总量，然后为每次灌流分别抽取一支新的、装满溶液的注射器。</li>
	<li>用 24 mg/ml 的氯胺酮/赛拉嗪混合液，按每 25 g 体重 200 µl 的剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉 &amp;#38; 4.8 mg/ml）于实验当日。通过脚趾夹捏反射监测小鼠的麻醉水平，只有当小鼠对用力夹捏脚趾无反应时，方可继续后续操作。 
	注意：只要在开始实验方案前达到适当的麻醉水平，也可使用其他麻醉方法。</li>
	<li>将小鼠置于覆盖的泡沫平台上，呈仰卧位。用针固定四肢的足部，然后用70%乙醇（EtOH）喷洒胸部和腹部图2A可在小鼠身下放置数张无菌纸巾，以吸收灌注过程中溢出的液体。</li>
	<li>用镊子提起胸骨下方的皮肤，然后用剪刀做切口。向后拉皮肤以暴露胸部（图2B).</li>
	<li>抬起剑突，在膈肌下方做腹部切口，暴露肝脏，并钝性分离肝脏与膈肌。在左侧和右侧的膈肌及肋骨底部各做一切口。将左右切口沿肋骨向上延伸约1/2至2/3处，然后将肋骨向后翻折，以打开胸腔图 2C). 
	注意：进行此操作时需小心，避免切割任何器官或主要血管，否则将影响灌注质量。</li>
	<li>经心脏灌注10-20 ml肝素/生理盐水，随后灌注10-20 ml 4%多聚甲醛。 
	注意：如果灌注操作正确，肝脏将由红色变为棕黄色（图 2D）。如果操作不当，血管将会可见（图 2E).</li>
	<li>将小鼠翻转至腹部朝上，重新固定四肢，然后用70%乙醇喷洒头部和颈部。从颈部基部提起皮肤并做一切口。去除皮肤以暴露颅骨图 2F）。在肩部水平处切断头部。去除颅骨，轻柔取出脑组织，并将其放入装有4% PFA的闪烁瓶中（图 2G-H). 
	注意：如果灌注良好，大脑将呈现白色，且无可见的血管图 2I）。如果脑组织灌注不良，血管将会可见（图 2J).</li>
	<li>将含有脑组织的闪烁瓶置于4% PFA中，4 °C避光过夜。用非USP级1x PBS冲洗脑组织，转移至装有预冷1x PBS的新闪烁瓶中。将脑组织置于1x PBS中，4 °C避光保存。 
	注意：使用在1×PBS中保存长达一个月的脑片已成功实现透明化和成像，但最好在灌注后数日内完成脑组织切片，因为长期保存于1×PBS中会逆转PFA的固定效果，可能导致成像质量次优。部分在1×PBS中保存一个月或更长时间的脑片在成像时已观察到自发荧光增强和图像模糊程度增加的现象。</li>
</ol>
3. 脑切片
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>从1×PBS中取出脑组织，放入脑切片矩阵（图3A），以便对脑组织进行更精确且均匀的切割。如有需要，切除小脑和嗅球，然后将脑组织沿冠状面切成2至3个部分。 
	注意：脑组织的修剪和切割可不使用脑切片矩阵完成。冠状面切割的片数取决于所用振动切片机（Vibratome）的切片间距。脑组织可按任意方向切片，但矢状面和冠状面切片最常用于神经解剖学鉴定。</li>
	<li>使用氰基丙烯酸酯将每个脑组织切片固定在样本安装块上，并在脑组织切片后方固定一小块5%琼脂糖凝胶以提供支撑（图3B）。 
	注意：可采用其他支撑方式，但若无支撑，振动切片机在切割时可能推动脑组织，导致切片不均匀。</li>
	<li>使用振动切片机将组织切成160 µm厚的切片（该厚度对应成像所用物镜的工作距离），切片机速度设为4，振幅设为9。 
	注意：可根据所使用的具体仪器调整速度和振幅参数，以获得均匀平滑的切片。若参数设置不当，可能导致切片厚度不均、组织撕裂或出现振颤痕迹。</li>
	<li>若切片将在一周内进行透明化处理，请将其收集至装有新鲜冷1×PBS的闪烁瓶中。若切片在一周内不进行透明化处理，则应将其放入装有冷冻保护液的1.5 ml微量离心管中，并于-20 °C保存。</li>
</ol>
4. 脑组织切片的光学透明化
注意：本方案已对先前发表的方法8进行了修改。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>配制25%、50%、75%和90%（体积分数）的甘油溶液，溶剂为1×PBS + 2% Tween-20（Gl/PBST）。</li>
	<li>从1× PBS中取出组织切片，若组织保存于冷冻保护剂中，则先用1× PBS漂洗，再转移至含有10 ml 25% Gl/PBST的闪烁瓶中。将闪烁瓶置于摇床，在4 °C避光条件下孵育12小时。</li>
	<li>确认所有组织切片均已沉至离心管底部。吸除25% Gl/PBST，保留刚好足以覆盖切片的液体，然后向管中加入10 ml 50% Gl/PBST，置于摇床中，在4 °C避光孵育12小时。随后对75% Gl/PBST和90% Gl/PBST重复此步骤。将切片在90% Gl/PBST中孵育24小时，以达到最大程度的透明化。在透明化过程中，可观察到逐渐发生的光学透明现象图4). 
	注意：如果在切片沉降至小管底部后立即更换溶液，此过程可加快。在75% &amp;#38; 90% 溶液中，切片不会完全沉至管底，而是悬浮在中间。</li>
</ol>
5. 脑组织切片的封片
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>将一块1.5号盖玻片切割成5块以制作间隔垫片。使用直尺和金刚石笔沿图5A中所示虚线划痕并折断盖玻片。弃去中心部分，将4个外围部分排列在普通载玻片上形成一个窗口，然后在接缝处涂上透明指甲油，将间隔垫片各部分按正确构型粘附在载玻片上（图5B）。 
	注意：该间隔垫片用于在载玻片与盖玻片之间为透明化组织切片的封片提供必要空间。可根据需要以不同方式切割盖玻片以形成任意尺寸的窗口。预切割的泡沫间隔垫片也可商业购买。为确保指甲油完全干燥，建议至少在封片前一天制备带间隔垫片的载玻片。</li>
	<li>使用剪去尖端的塑料转移移液管将切片转移至载玻片上。确保用90%甘油/PBST填充周围区域。小心地将盖玻片覆盖在切片上，避免引入气泡。可用无绒擦拭纸吸除多余的甘油/PBST。</li>
	<li>立即使用共聚焦显微镜对含有RFP+Toxoplasma gondii包囊的GFP+神经元进行成像（图7A-B），随后将载玻片平放并避光保存于4 °C。 
	注意：也可选择用密封剂完全封闭载玻片四周，以便后续储存和成像。使用透明指甲油密封载玻片为可选步骤；若将来需从载玻片上取下切片进行进一步处理，则可能增加移除盖玻片的难度。</li>
</ol>
6. 成像
注意：可使用任何能够获取高分辨率z轴层扫图像的显微镜。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>在10X物镜下初步找到焦平面后，切换至20X物镜，扫描切片以识别位于GFP+细胞内的包囊。将感兴趣区域（ROI）置于视野中央。</li>
	<li>切换至40X物镜，上下调节焦距，完整观察整个感兴趣区域，确保整个细胞及包囊均清晰可见。 
	注意：图像使用配备40X/1.30 Oil DIC M27物镜的共聚焦显微镜获取。</li>
	<li>使用已安装的成像软件，获取包含整个细胞及其包囊的z轴层扫图像（z-stack）。用于获取图像的平均参数设置见图6。 
	注意：具体参数可能需要根据各研究者所用组织切片及显微镜性能进行调整。</li>
	<li>通过将投影层数设置为1，获得z轴层扫图像的最大投影图像；将投影层数设置为64，获得完整的旋转视图。 
	注意：也可使用其他软件包来生成z轴层扫图像的最大投影、旋转视图及其他可视化图像。</li>
	<li>使用图像分析软件对图像进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li>
<li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+transmission%2C+diagnosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li>
<li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine%2C+even+after+extensive+parasite+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246(2013).</li>
<li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li>
<li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii%3A+a+histological%2C+immunocytochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li>
<li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain%3A+A+Confocal+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroparasitology%22%5BJournal%5D)">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li>
<li>Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li>
<li>Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li>
<li>Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li>
<li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li>
<li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%2C+bradyzoites%2C+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.</li>
<li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Alzheimers+Dis+Other+Demen%22%5BJournal%5D)">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li>
<li>Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis%3A+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925(2011).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li>
<li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+agents+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li>
<li>Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴于其他胞内病原体（如HIV、狂犬病病毒和沙眼衣原体）感染宿主细胞所引起的细胞变化已被证实与疾病结局相关18,19，我们开发了一种技术，可用于研究中枢神经系统宿主细胞与弓形虫（Toxoplasma）之间发生的密切相互作用。本文所述方法通过实现对慢性感染神经元的高效成像，达成了这一目标。在该方法建立之前，此类成像工作耗时较长、成本高昂，或根本无法实现。
我们现在可以利用该技术来回答有关的基礎科學問題 弓形虫-神经元相互作用，例如寄生虫是否靶向特定的神经元区域？这在不同情况下是否存在差异？ 弓形虫 菌株？囊肿所处的细胞区域与细胞其他部分是否存在差异即 同一神经元的受感染与未受感染树突是否具有相同数量的树突棘？受感染神经元之间共享哪些细胞特征？回答这些问题对于理解其机制至关重要 弓形虫 感染会改变中枢神经系统，包括行为层面的变化。
为了获得最佳的成像效果，确保组织被切成厚度均匀的切片至关重要。如果切片厚度不均，盖玻片将无法...

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

本方法的总体目标是获得被专性细胞内寄生虫Toxoplasma gondii感染的单个神经元的高分辨率三维图像。
Toxoplasma 常被认为是世界上最成功的寄生虫之一，因其具有广泛的中间宿主范围，包括人类和啮齿类动物。在人类和啮齿类动物中，通过摄入被污染的食物或水而发生急性感染后，Toxoplasma 能够通过从快速增殖形态（速殖子）转变为缓慢增殖并形成包囊的形态（缓殖子），在中枢神经系统（CNS）中建立持续性感染。在免疫功能正常的个体中，这种潜伏性中枢神经系统感染通常被认为是相对无症状的；但在免疫功能低下者（如艾滋病患者或器官移植受者）中，寄生虫的复发可导致致命的弓形虫脑炎1,2。此外，最近的研究表明，Toxoplasma 的潜伏感染可引起啮齿类动物的行为改变3,4，但其机制尚不清楚。
令人惊讶的是，尽管这些数据强调了中枢神经系统（CNS）的重要性弓形虫 相互作用，但关于这种关系的研究仍十分有限，尤其是在细胞和分子层面。对脑-寄生虫相互作用的简单方面进行研究的能力，在一定程度上受到技术限制的制约。例如，证明神经元是包囊持续存在的细胞的大多数研究均依赖于电子显微镜（EM）完成5,6尽管电子显微镜（EM）具有高分辨率，但其操作耗时、劳动强度大且成本高昂。近年来，免疫荧光（IF）检测已与共聚焦显微镜结合使用，以验证电子显微镜所得结果。7IF检测在技术上易于操作且相对经济，但利用这些技术来理解包囊与感染神经元之间的空间关系需要进行连续切片重建，这一过程耗时较长、技术难度高，并可能导致宝贵信息的丢失。因此，我们开发了一种可用于中枢神经系统弓形虫病小鼠模型的方法，能够在无需电镜或免疫组织化学（IHC）的情况下对感染的神经元整体进行成像。通过建立此类技术，我们得以以相对快速且经济的方式初步探究感染细胞与包囊之间的细胞水平关系。
我们开发的方法结合了利用共聚焦显微镜对厚脑切片进行光学透明化和成像的较新技术8 使用一个标记系统 体内 已注入寄生虫蛋白的细胞9,10在此系统中，我们感染了Cre报告小鼠，该小鼠仅在Cre介导的重组后表达绿色荧光蛋白（GFP）11 与 弓形虫 表达红色荧光蛋白（RFP）并可向宿主细胞注射 Cre 重组酶的菌株9这种组合使我们能够在中枢神经系统感染建立后收获感染小鼠的脑组织，制备厚脑切片，并通过检测红色荧光蛋白（RFP）快速识别出需要成像的相关区域+ 囊肿。需要注意的是，宿主细胞中GFP的表达完全依赖于寄生虫注入Cre，而非感染本身，因此部分GFP+ 细胞不含寄生虫10由于本实验方案的目标是能够对完整感染的神经元进行成像，因此仅关注 GFP+ 也含有RFP的神经元+ 囊肿，但该方案也可用于成像GFP+/RFP- 神经元
脑组织感染后，将其取出并切片，通过甘油透明化处理使切片透明化。随后利用共聚焦显微镜对切片的适当区域进行成像，从而前所未有地完整观察到被感染的宿主细胞及包囊内的寄生虫。本文中，我们提供了一套完整的方案，用于识别、光学透明化处理以及成像被感染的神经元。

<table><tbody><tr><td>1000系列振动切片系统</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>其他振动切片机亦可兼容</td></tr><tr><td>甘油</td><td>费希尔科技公司</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>费希尔科技公司</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>优质载玻片</td><td>费希尔科技公司</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>金刚石划痕笔</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; 盐酸氯胺酮注射液，USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; 注射用赛拉嗪 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td>拇指镊；侧弯尖头剪刀（双尖）；双尖剪刀；Kelly 止血钳；Mayo 剪刀；微型刮匙。</td></tr><tr><td>人包皮成纤维细胞（HFF 细胞）</td><td></td><td></td><td>这些细胞来源于人包皮的原代细胞。&amp;nbsp; 我们自行制备，也可从外部供应商购买。</td></tr><tr><td>杜尔贝科高糖改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 倾斜颈培养瓶</td><td>费希尔科技公司</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，1×，不含钙和镁</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，10×，USP 无菌超纯级</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>小鼠脑切片模具</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>费希尔科技公司</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>来源于猪肠黏膜的肝素钠盐</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>费希尔科技公司</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 一次性闪烁瓶</td><td>费希尔科技公司</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，95%，190 proof</td><td>本单位提供</td><td>17212945</td><td>该产品由本单位库存提供。&amp;nbsp; 其他公司产品亦可兼容。</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td></td><td></td><td>其他品牌亦可兼容</td></tr><tr><td>10 ml 带鲁尔锁扣注射器</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>其他注射器亦可兼容</td></tr><tr><td>三通阀</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可兼容</td></tr><tr><td>皮下注射针头</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可兼容——用于固定小鼠</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可兼容</td></tr><tr><td>25 G × 12&quot; 管路，安全采血套装，带鲁尔接头</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>其他品牌亦可兼容</td></tr></tbody></table>

受感染神经元的三维成像与分析 体内 与 弓形虫（toxoplasma gondii）

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii 是一种专性胞内寄生虫，宿主范围广泛，包括人类和啮齿类动物。在人类和啮齿类动物中，Toxoplasma 可在大脑中建立终生持续性感染。尽管这种脑部感染在大多数免疫功能健全的个体中无症状，但在发育中的胎儿或免疫功能低下者（如获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者）中，该寄生虫对脑组织的亲嗜性和持续存在可导致严重的神经系统疾病。因此，显然脑组织与Toxoplasma之间的相互作用对于Toxoplasma所致的症状性疾病的产生至关重要；然而，我们对中枢神经系统（CNS）细胞与该寄生虫之间的细胞或分子相互作用仍知之甚少。在中枢神经系统弓形虫病的小鼠模型中，已知神经元是寄生虫持续存在的细胞类型，这一发现已有30多年历史，但关于通常被感染的是神经元的哪一部分（胞体、树突或轴突），以及不同菌株之间这种细胞关系是否发生变化，目前可用的信息仍然很少。部分原因在于从动物体内成像和可视化完整感染神经元存在困难。此类图像通常需要通过电子显微镜或免疫染色后的共聚焦显微镜对组织进行连续切片并拼接。通过结合多种技术，本文所述方法可利用厚切片（160 µm）识别并成像含有包囊的完整细胞，从而无需免疫染色、电子显微镜、连续切片及拼接，即可实现对单个慢性感染神经元的三维可视化与分析。利用该技术，我们可开始深入理解寄生虫与感染神经元之间的细胞层面关系。

图7 包含来自两个不同160 µm厚切片的两个含囊肿的GFP+神经元的代表性图像，以及用于图7B的囊肿到胞体距离的代表性测量结果。图7A和B表明，该新方案能够实现对感染神经元整体的可视化。图7C显示，利用此成像技术，现在可以量化囊肿与胞体之间的距离（Imaris 7.7）。图7D是图7B的完整旋转视图。以这种方式可视化z轴堆叠图像，可验证细胞及囊肿被完整捕获。图7E是一个三维旋转视频，展示如何使用Imaris 7.7软件对7D图像进行分析，以测量囊肿到胞体的距离，测量方式可为中点到中点或边缘到边缘。尽管图中所示的测量是通过囊肿与胞体之间的一条直线完成的，但也可生成沿GFP+突起实际路径至胞体的距离测量结果（数据未显示）。
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通过本方案，我们能够对感染了弓形虫（Toxoplasma gondii）的小鼠脑组织切片（厚度达160 µm）进行成像，从而实现对包囊化寄生虫与感染神经元之间空间关系的可视化和分析。

受感染神经元的三维成像与分析 体内 与 弓形虫（Toxoplasma gondii）

刚地弓形虫是一种专性胞内寄生虫，具有广泛的宿主范围，包括人类和啮齿类动物。在人类和啮齿类动物中，刚地弓形虫……

本实验的总体目标是完整可视化感染了弓形虫囊肿的神经元。首先通过腹腔注射的方式，将表达M樱桃荧光蛋白并经基因工程改造、可向宿主细胞注入CRE重组酶的寄生虫接种至Cree报告小鼠体内。待中枢神经系统感染建立后，第二步进行经心灌注，依次使用肝素化生理盐水和4%多聚甲醛。接下来，取出脑组织，移除并弃去嗅球和小脑，将剩余的脑组织切成两半，然后将每半切成160微米厚的切片。最后一步是用梯度浓度的甘油-PBS-Tween溶液对切片进行透明处理，并将其贴附到载玻片上，用于共聚焦显微镜成像。最终，可使用支持三维重建与分析的软件对图像进行分析，该方法可用于展示包囊与感染神经元之间的细胞关系。与现有的连续切片、染色及厚组织切片重建等方法相比，该技术的主要优势在于无需进行染色和重建步骤，而这两个步骤在技术上往往较为困难且耗时。本次实验操作将由本实验室的研究专家 Carla Cabral 进行演示。开始操作时，将感染了弓形虫（Toxoplasma Gandhi）的小鼠脑组织置于脑组织切片模具中，以实现精确且均匀的切割，随后切除小脑和嗅球。然后将脑组织切成两个冠状切片。用Sano acrl将每个脑切片固定在样本安装块上。随后，在脑切片后方固定一小块5% Aros凝胶以提供支撑。使用振动切片机将组织切成160微米厚的固定切片，切片机参数设置为速度4、振幅9。随后，若组织切片将在一周内进行透明化处理，则将其转移至装有新鲜预冷1×PBS的闪烁瓶中；若切片不计划在一周内透明化处理，则将其放入装有冷冻保护液的1.5毫升微量离心管中，并在-20摄氏度下保存。现在配制25%、50%、75%和90%（体积比）的甘油溶液，溶剂为1×PBS，另含2%二甲基亚砜，置于20°C保存。接着，将组织切片从1×PBS中取出；若切片保存在冷冻保护液中，则先用1×PBS漂洗，再转移至含有10毫升25%甘油PBST的闪烁瓶中。盖好瓶盖，将闪烁瓶置于摇床上。盖上小瓶以避免光照，并在4°C下孵育12小时。12小时后，确认所有切片均已沉至小瓶底部。吸除25%甘油PBST溶液，仅保留足以覆盖切片的少量液体。然后配制含有10毫升50%甘油PBST的离心管。将离心管置于摇床上，避光并在4°C下孵育12小时。对75%甘油PBST和90%甘油PBST重复此步骤，此时组织切片将悬浮于离心管中部。将切片置于90%甘油PBST中24小时，以达到最大透明化效果。接下来，使用直尺和尖头金刚笔将一块1.5号盖玻片切割成五块，丢弃中心部分，将四周的四块放置在普通载玻片上，形成一个窗口状间隔垫片。然后将透明指甲油涂抹在接缝处，以将间隔片的各部分按正确配置粘附到载玻片上。接着，使用剪去尖端的塑料移液管将切片转移至载玻片上。务必用90%甘油PBST填充周围区域。然后小心地将盖玻片覆盖在切片上，注意避免产生气泡。可用无绒擦拭纸吸去多余的甘油 PBST。之后，使用共聚焦显微镜观察表达 GFP 的神经元中包含表达 RFP 的弓形虫（Toxoplasma gondii）囊肿的样本。完成后，将载玻片平放并避光保存于 4 摄氏度环境中。图中显示的是包含 RFP 阳性包囊的 GFP 阳性神经元的最大投影图像。这是一个细胞的三维旋转视频。该图像展示了利用虹膜生成的直接线性测量法，测定包囊边缘与细胞体边缘之间距离的结果。在此示例中，测得的距离为149微米，此处为IMS生成的三维视频，展示了囊肿与细胞体之间的中点到中点以及边缘到边缘的测量。一旦掌握，若严格按照本方案操作，该技术可在四到五天内完成。还可进行其他分析，例如统计感染树突与未感染树突之间棒状结构的数量，以回答囊肿是否破坏神经元正常功能等问题。

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