Name: 白色念珠菌生物膜发展在医学上，国外相关机构在小鼠皮下型号其次是生物发光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解利用生物发光成像技术在小鼠皮下模型中监测白色念珠菌生物膜形成的方法。该技术通过荧光素酶表达菌株实现活体无创检测，为抗真菌治疗研究提供高效工具。

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本工作得到了鲁汶大学（KU Leuven）PF项目“IMIR”、佛兰德研究基金会（FWO）细菌与真菌生物膜生物学及生态学研究团体（FWO: WO.026.11N）以及FWO项目G.0804.11的资助。SK谨此感谢鲁汶大学提供的PDMK 11/089博士后资助及佛兰德研究基金会提供的博士后奖学金。我们感谢Nico Vangoethem在图表制备过程中提供的帮助。我们感谢Celia Lobo Romero在技术方面提供的支持。 体内 实验步骤

注意：所有动物实验均经鲁汶大学（KU Leuven）伦理委员会批准（项目编号 090/2013）。动物饲养和管理须遵循鲁汶大学动物护理指南。
1. C. albicans 生长
<ol>
	<li>在动物实验开始前 24 小时，通过加入 10 g 颗粒状酵母提取物、20 g 细菌学蛋白胨和 15 g 颗粒状琼脂制备 YPD 平板。用 Milli-Q 水定容至 900 ml 并进行高压灭菌。</li>
	<li>加入 50 ml 无菌的 40% 葡萄糖溶液，充分混匀后倒入培养皿中。让琼脂平板冷却并凝固。 
	注意：本研究中使用两种菌株，分别为野生型 C. albicans SC5314 –gLuc 阴性菌株 （以下简称 WT）和 C. albicans SKCA23 菌株，后者是通过将 Clp10::Act1p-gLUC59 质粒22转化至野生型 C. albicans SC5314 而获得的。该菌株（命名为 SKCA23-ACTgLuc）中，gLuc 在 ACT1（肌动蛋白）启动子的调控下与内源性 PGA59 基因融合（该启动子在酵母态及菌丝态真菌生长阶段均具有活性）。该菌株可向比利时鲁汶大学（KU Leuven）Patrick Van Dijck 教授实验室申请获取。Clp10::Act1p-gLUC59 质粒22由法国巴黎巴斯德研究所（Institute Pasteur）C. d’Enfert 教授慷慨赠送。</li>
	<li>将两种菌株均以甘油保存液形式保存，并置于 -80 °C 冻存。</li>
	<li>每次实验前，将菌株划线接种至 YPD 平板上，在 37 °C 条件下过夜培养。</li>
</ol>
2. 导管部件的准备
<ol>
	<li>实验前确定所需导管的数量。每只小鼠最多可植入6段导管（动物左侧3段，右侧3段）（图2A）。</li>
	<li>动物手术前24小时，在生物安全柜内打开含有三腔导管的包装。使用无菌镊子移除所有不必要的部件，并用无菌手术刀切除与导管相连的部分。将尺子置于塑料包装下，根据尺子刻度精确切割1 cm长的聚氨酯导管段（图1）。 
	注意：需要特别说明的是，此类导管片段不具磷光性，因此适用于生物发光成像（BLI）18,19。</li>
	<li>将最多15段已切割的导管（步骤2.2）放入2 ml微量离心管中。每次需额外准备3段导管，用于在黏附期结束后计数设备上附着的Candida细胞数量。</li>
	<li>向导管中加入约1.8 ml的100%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>剧烈涡旋振荡，并额外添加100–200 μl的100% FBS，确保所有导管段完全被血清覆盖。</li>
	<li>在37 °C条件下孵育过夜。</li>
</ol>
3. 动物与免疫系统的抑制
<ol>
	<li>将雌性BALB/c小鼠（约8周龄）饲养在 individually ventilated filter top cages 中，自由摄取标准食物和水，ad libitum。</li>
	<li>在动物手术前24小时，通过在饮水中添加地塞米松（0.4 mg/L）以启动免疫抑制。为避免宿主发生任何细菌污染，可在饮水中补充抗生素，e.g.，氨苄青霉素钠粉末（0.5 g/L）。</li>
	<li>在整个实验期间（最长6天）维持动物的免疫抑制状态。</li>
</ol>
4. 离体白色念珠菌 FBS包被的聚氨酯基底上的黏附作用
<ol>
	<li>将每个涂有血清的导管片段转移至新的1.5 ml微量离心管中。</li>
	<li>刮取在YPD平板上培养的C. albicans细胞（步骤1），并将其悬浮于1 ml PBS中。</li>
	<li>在另一微量离心管中将Candida细胞按1:100稀释。取10 μl稀释后的样品加入细胞计数板，计数至少16个小方格。</li>
	<li>将Candida细胞（每种菌株分别处理）用RPMI 1640培养基配制成终浓度为5 × 104 个细胞/ml的悬液。</li>
	<li>向每个涂有血清的导管片段中加入1 ml细胞悬液。</li>
	<li>剧烈涡旋振荡，确保导管完全浸没于培养基中，不漂浮于液面。</li>
	<li>于37 °C孵育90分钟（黏附阶段）。</li>
	<li>用无菌镊子取出导管，用1 ml PBS洗涤两次。洗涤时应保持导管垂直，轻柔冲洗以确保洗液流经管腔。重要的是，避免使用强水流，以免冲走已黏附的细胞。</li>
	<li>将每根洗涤后的导管转移至洁净的微量离心管中（每管一根）。</li>
	<li>置于冰上，并在冰上保存直至手术使用。</li>
</ol>
5. 麻醉
<ol>
	<li>通过将75 µl的氯胺酮（100 mg/ml）与100 µl的美托咪定（1 mg/ml）及825 µl的无菌生理盐水混合来配制麻醉剂。按每10 g体重腹腔注射（i.p.）60–80 µl麻醉混合液，使氯胺酮剂量达到45–60 mg/kg，美托咪定剂量达到0.6–0.8 mg/kg。</li>
	<li>为逆转麻醉作用，将50 µl阿替美唑（5 mg/ml）稀释于4.95 ml生理盐水中，作为解毒剂按每10 g体重腹腔注射100 µl，使剂量达到0.5 mg/kg。</li>
	<li>注射麻醉剂后，将动物置于单独的笼子中，等待其完全进入睡眠状态。</li>
	<li>通过轻捏皮肤和脚趾进行麻醉深度检测，该操作不会对皮肤造成损伤。若观察到任何运动反应，则表明动物尚未达到足够的麻醉深度，不能进行手术。若出现此情况，需再等待数分钟，直至在皮肤或脚趾捏压下均无任何运动反应。</li>
</ol>
6. 动物手术
<ol>
	<li>将麻醉后的动物从笼中转移至加热垫上预先放置的清洁纱布上，加热垫温度预热至 37 °C（图2A, (1)). 
	注意：一种成本较低的替代方案是使用电热毯。也可使用等温垫，但需在动物手术前将其放入微波炉中预热。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼药膏。</li>
	<li>用电剃刀剃除动物背部下部的毛发。清除所有动物毛发后，将动物转移至干净的纸巾上。对皮肤进行消毒（例如，使用1%碘异丙醇或0.5%氯己定溶于70%酒精）处理，并让消毒区域自然干燥约1分钟（图2A, (2)).</li>
	<li>在动物左侧和右侧的皮肤上各做一个小切口（长约0.5–1 cm）图2A, (3)).</li>
	<li>用剪刀解剖皮下组织，形成两个皮下隧道。每个隧道长约1.5 cm，宽约1 cm。</li>
	<li>插入三段先前已感染的导管片段 假丝酵母，每个通道内确保导管并排呈水平排列，且彼此不重叠，以便总共植入六个导管片段（图2A, (4)).</li>
	<li>用缝线闭合切口。或者，使用Dermabond闭合伤口。</li>
	<li>用0.5%氯己定的70%酒精溶液或1%碘伏异丙醇溶液轻柔消毒伤口。</li>
	<li>将局部麻醉剂（利多卡因凝胶，2%）直接涂抹于伤口处。</li>
	<li>给予麻醉逆转剂（方案5，步骤2）：按每10克体重100 µl的剂量进行腹腔注射。</li>
	<li>将动物转移至已预先放置于加热板上的清洁笼具中。保持动物单独饲养并保温，直至其完全清醒。在此期间，继续进行下一只动物的手术与植入操作。待所有手术动物均完全清醒后，将其转移至同一笼具中。定期对动物进行监测。</li>
</ol>
7. 生物发光成像：G. princeps 荧光素酶底物腔肠素（CTZ）的制备
<ol>
	<li>通过将5 mg/ml的腔肠素（CTZ）溶解于酸化乙醇中，或按照制造商说明书配制新鲜的腔肠素（CTZ）储备液。</li>
	<li>通过将原液用无菌 PBS 稀释 1:10，配制 1.2 mM 的工作液。 
	注意：在导管周围区域皮下注射 100 µl CTZ 工作液。使用胰岛素注射器进行 CTZ 的皮下注射。</li>
	<li>始终将CTZ避光保存（例如，用铝箔包裹含有CTZ的微量离心管。在实验期间将储备液保存于-80 °C。</li>
</ol>
8. 生物发光成像
<ol>
	<li>启动BLI相机。</li>
	<li>使用诱导箱对动物进行麻醉。采用异氟烷与氧气、N2O/O2 或空气的混合气体，浓度为2-3%。</li>
	<li>诱导麻醉后，在诱导箱及成像室中维持1.5-2%的麻醉浓度。</li>
	<li>开始成像前，将成像板置于位置A，对应10 cm的视场（FOV）。通过将一只已入睡的动物放入箱内，确认麻醉出气口和动物位置正确。</li>
	<li>拍摄几张照片，直至动物处于理想的成像位置，即位于相机正下方的视场内。</li>
	<li>准备两支胰岛素注射器，每支装有100 µl的CTZ工作液。</li>
	<li>将一只动物置于实验台面上，通过鼻罩持续供给气体麻醉以维持睡眠状态。</li>
	<li>将注射器针头置于皮下导管周围区域，并在导管上方同时注射CTZ。</li>
	<li>注射后立即把动物放置于成像箱内的加热板上，开始生物发光图像采集。</li>
	<li>根据信号强度，以20至60秒不等的采集时间连续扫描，直至达到最大信号强度。在采集下一帧图像的同时，通过在每组三个导管上放置感兴趣区域（ROI），测量前一帧图像中该ROI内的光子通量，以评估BLI信号强度。</li>
	<li>对下一只动物重复步骤7开始的操作。</li>
	<li>成像结束后，将动物放回笼中。在实验过程中重复进行BLI检测，以实现对生物膜形成的纵向、无创性追踪。</li>
	<li>使用Living Image软件分析BLI数据。在每组三个导管上方放置大小固定的矩形ROI，测量每个ROI的光子通量（辐射亮度）。对每只动物均重复此操作。</li>
	<li>以每秒光子通量报告每组三个导管的BLI信号强度。通过绘制每组光子通量每秒均值及标准差，以对数尺度表示BLI数据。对log10转换后的数据进行统计学分析。</li>
</ol>
9. 导管取出
<ol>
	<li>准备含有 1 ml PBS 的微量离心管，每个导管装置对应一管，并将其置于冰上。</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死动物（图 2B，(1)）。</li>
	<li>使用含 0.5% 氯己定的 70% 酒精或 1% 碘异丙醇对背部皮肤进行消毒。</li>
	<li>在导管上方做一切口（约 3 cm）。</li>
	<li>切开皮下组织，使用无菌镊子逐个从皮下组织下取出导管片段（图 2B，(2)）。</li>
	<li>将导管轻柔地保持垂直位置，用 1 ml 无菌 PBS 清洗两次。将每段导管放入单独的微量离心管中（步骤 1 中已准备）。</li>
</ol>
10. 通过菌落形成单位计数（CFUs）对生物膜相关细胞进行定量及结果的统计学分析
<ol>
	<li>将先前放入1 ml PBS中的导管在水浴超声仪中以40,000 Hz超声处理10分钟，随后置于冰上。</li>
	<li>超声处理后，剧烈涡旋振荡30秒，再次置于冰上。</li>
	<li>准备另外两个含有900 μl PBS的微量离心管。</li>
	<li>从原始样品（含导管的样品）中制备1:10和1:100的稀释液，并将所有微量离心管保持在冰上。</li>
	<li>取100 µl原始样品、1:10和1:100稀释液，分别涂布于YPD琼脂平板上，每个样品设两个重复。</li>
	<li>将平板在37 °C培养2天，并计数菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>计数YPD琼脂平板上生长的菌落（可计数范围为每平板最多300个菌落），乘以相应的稀释倍数（1倍—原始样品，10倍或100倍稀释）。再将每个导管片段的数值乘以10倍，以代表含导管的1 ml体系中的最终菌落总数。将最终菌落数转换为log10 cells/导管片段，并计算标准差（SD）。数据以均值±SD表示。</li>
	<li>将每根导管及其所属特定组别的所有数值输入电子表格和/或统计学软件，进行上述计算和统计分析。标明需比较的特定组别，例如 WT vs. 突变株，或2天 vs. 6天生物膜形成，并对经log10转换的数据进行非配对t检验以及带Tukey事后检验的单因素方差分析（ANOVA）。
	<ol>
		<li>以p值表示显著性水平。本研究中，当p值&#60;0.05时定义为具有显著性，表示如下：* p &#60;0.05，**p &#60;0.005，***p &#60;0.0005。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在致力于微生物生物膜研究的实验中，使用动物模型（尤其是啮齿类动物模型）非常重要，因为宿主免疫系统是生物膜形成的关键因素，而体外模型无法模拟这一因素。in vitro 模型无法对此进行模拟。在本研究中，我们描述了一种相对简便的皮下白色念珠菌（C. albicans）生物膜小鼠模型，该模型易于在科研实验室中采用，且无需高难度的技术操作。该模型最初是为研究表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）在大鼠体内的生物膜形成而开发的24。
在所展示的模型中，用血清包被的聚氨酯导管被挑战以 假丝酵母 细胞 离体 在黏附期间（90 分钟，37 °C）。这是第一步 体外 由于在生物膜感染过程的最初阶段缺乏免疫系统，该步骤可能被视为限制性因素。在黏附之后、导管植入之前，通过清洗去除未与器械相关的细胞。若在黏附期后省略清洗步骤，可能导致与器械相关细胞数量失控。因此，我们建议在导管植入前进行清洗，从而确保其生物膜发育始于已黏附的细胞。经过初始黏附阶段后...

Candida albicans 是一种共生生物，可在健康个体的不同部位发现，例如皮肤表面，或作为胃肠道及阴道菌群的一部分。然而，在住院患者尤其是免疫功能低下者中，它可能引发多种感染1。在这些个体中，免疫系统功能减弱使得Candida细胞得以进入血液并侵入深层组织，导致危及生命的感染。此外，诸如中心静脉导管、尿道导管、人工心脏瓣膜和关节等非生物材料的存在，可能为Candida的附着提供适宜的生态位点2。对这些材料的黏附是进一步形成生物膜的前提，生物膜是由酵母相和菌丝相细胞嵌入主要成分为多糖的胞外聚合物基质中所构成的结构2。C. albicans导管相关性感染与高死亡率相关。生物膜的一个普遍特征是其对已知抗真菌药物（如唑类）的敏感性显著降低3,4。目前仅有较新的抗真菌药物类别，如棘白菌素类以及两性霉素B脂质体剂型，被证实对导管相关性感染有效5–7。由于生物膜对抗真菌药物具有高度耐受性，治疗手段极为有限，常需移除导管并更换新导管作为唯一解决方案。
我们目前对大多数问题的理解 C. albicans 生物膜的形成起始于 体外 在聚苯乙烯或用于制造上述设备的塑料等非生物基质上的研究， 即， 硅胶，聚氨酯 2这些模型相当先进，力求模拟真实情况 体内 尽可能接近真实情况。然而，这些系统未包含宿主的持续血流和免疫系统，因此推动了 体内 模型系统，例如中心静脉导管（CVC）模型 8-10口腔念珠菌病的义齿性口炎模型 11 以及一种用于导管相关念珠菌尿症的小鼠模型 12此外， C. albicans 生物膜的发育过程被研究 体内 在黏膜表面，例如阴道黏膜表面 13 和口腔 14. 我们实验室为建立皮下模型做出了贡献 C. albicans 基于将感染的导管片段植入Sprague Dawley大鼠背部的生物膜模型 15该模型已在我们的实验室成功用于检测生物膜对氟康唑和棘白菌素类药物的敏感性 5,16，以研究双氯芬酸与卡泊芬净联合治疗的效果 17最近，我们将该系统改良用于BALB/c小鼠。 18,19与其他方法相比 体内 该皮下模型的主要优势在于能够研究每只动物体内植入导管片段腔内形成的多个生物膜。
为减少实验动物的使用数量，我们已对该模型进行改良，用于研究发育过程 C. albicans 利用生物发光成像（BLI）非侵入性地检测生物膜 18,19该方法被证明是一种强大的技术，可通过测量感兴趣区域（在本例中为植入导管的区域）的特异性BLI信号来定量生物膜，从而避免牺牲实验动物。与细菌相比，由于引入了特定的 lux 操纵子 20包括大多数真核生物 白色念珠菌， 依赖于荧光素酶基因的异源表达，并需外源施加特定底物，如D-荧光素或腔肠素 21。可能是由于真菌细胞壁的存在以及 C. albicans 形态发生过程中，荧光素酶底物的细胞内递送是一个主要挑战 21为了解决这一问题，Enjalbert 等. 22 构建了一种合成菌株 C. albicans 基因天然分泌型的密码子优化版本 Gaussia princeps 荧光素酶（gLuc）与融合到 C. albicans PGA59 基因，一种GPI锚定的细胞壁蛋白。由于荧光素酶存在于细胞壁上，可避免底物在细胞内可及性方面的问题。该特定系统被用于研究由表层感染引起的 C. albicans 22最近，生物发光成像（BLI）也被用于监测口咽念珠菌病的进展及其潜在治疗方法 23这些发现支持将生物发光成像（BLI）作为一种有前景的技术，用于研究由游离细胞引起的感染以及与医疗器械相关的感染。
在本研究中，我们描述了 C. albicans 在BALB/c小鼠中利用聚氨酯导管片段研究生物膜形成及其通过生物发光成像（BLI）进行定量分析。我们提供了一项详细的实验方案 体外 聚氨酯导管在黏附期及植入小鼠后的定植过程，以及活体动物内后续生物膜的形成。除了检测由生物发光成像（BLI）信号所发出的光强外 C. albicans 我们还测定菌落形成单位，以与生物膜真菌载量定量的标准技术进行比较。

<table><tbody><tr><td>颗粒状酵母提取物</td><td>Merck</td><td>MERC1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>细菌用蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>LP037B</td><td></td></tr><tr><td>颗粒状琼脂</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Fluka</td><td>49159-5KG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>实验室配制</td><td></td><td>配制1L 10倍PBS：80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺、不含碳酸钠的RPMI1640培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R6504-1L</td><td>按照白色念珠菌药物敏感性检测方案进行配制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>MOPS用于调节RPMI培养基的pH值（pH 7.0）</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>聚氨酯三腔静脉导管片段（直径2.4 mm，Certofix Trio S730）&amp;nbsp;</td><td>BBraun</td><td>CV-15703</td><td>将聚氨酯部分切割成1 cm长的片段</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Fagron SAS, 法国</td><td>611139</td><td>免疫抑制剂（储存液浓度为10 mg/mL）</td></tr><tr><td>氨苄西林&amp;nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie, 荷兰</td><td>A0104</td><td>抗菌预防用药</td></tr><tr><td>凯泰1000（Ketamine 1000）</td><td>Pfizer</td><td>804 119</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>多米托（Domitor）</td><td>Pfizer</td><td>134737-1</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>安替醒（Antisedan）</td><td>Pfizer</td><td>134783-2</td><td>逆转麻醉作用</td></tr><tr><td>利多卡因凝胶（2%）——即Linisol</td><td>AstraZeneca</td><td>352 1206</td><td>皮肤局部麻醉剂</td></tr><tr><td>土霉素/多粘菌素B眼膏</td><td></td><td></td><td>防止眼睛干燥和感染</td></tr><tr><td>腔肠素&amp;nbsp;</td><td>Prolume (Nanolight)</td><td>NF-CTZ-FB</td><td>光敏试剂（必须避光保存）</td></tr><tr><td>1%碘异丙醇</td><td>3M&amp;trade; DuraPrep&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td></td><td>皮肤消毒剂</td></tr><tr><td>70%酒精中含0.5%氯己定&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cedium</td><td></td><td>皮肤消毒剂</td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器（0.3 mL）</td><td>Terumo Myjector 29G</td><td>324826</td><td>用于注射腔肠素</td></tr><tr><td>电动剃毛器</td><td></td><td></td><td>适用于小型动物</td></tr><tr><td>无菌手术器械</td><td></td><td></td><td>剪刀、镊子两把、手术刀</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Leica</td><td>14042321474</td><td></td></tr><tr><td>皮肤缝合线</td><td>Johnson&amp;Johnson</td><td>K890H</td><td>外科缝合线及缝合针</td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Branson 2210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物发光成像仪（IVIS Spectrum）&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td>IVISSPE</td><td></td></tr><tr><td>Living Image软件&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td></td><td>（版本4.2）&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

白色念珠菌 生物膜在生物或非生物表面的形成对住院患者构成特定威胁。迄今为止， C. albicans 生物膜主要被研究 体外 但迫切需要更深入地理解这一动态过程 体内 条件。我们开发了一种 体内 皮下大鼠模型研究 C. albicans 生物膜形成。在我们的模型中，多个（最多9个） 假丝酵母将感染的装置植入动物背部，这使我们相较于中心静脉导管模型系统具有显著优势，因为它允许我们在单个动物体内研究多个独立的生物膜。近期，我们对该模型进行了改进以用于研究 C. albicans BALB/c小鼠中生物膜的形成。在此模型中，成熟的 C. albicans 生物膜在48小时内形成，并展现出典型的三维生物膜结构。真菌生物膜的定量分析 traditionally 采用 死后 且需要牺牲宿主。由于进行动力学研究需要使用大量动物，我们采用了非侵入性生物发光成像（BLI）进行纵向追踪 在 体内 成熟 C. albicans 在我们的皮下模型中形成的生物膜。 C. albicans 细胞被改造以表达 Gaussia 始祖 luciferase 基因gLuc) 附着于细胞壁。生物发光信号由荧光素酶催化所添加的底物腔肠素产生，生成可被检测的光信号。该BLI信号与从移植导管中获得的细胞计数结果相似。用于定量的非侵入性成像 体内 生物膜形成可为抗真菌药物的筛选与验证提供直接应用平台 体内 条件，以及基于宿主-病原体相互作用的研究，从而有助于更好地理解导管相关性感染的发病机制。

本研究展示了在小鼠体内白色念珠菌（C. albicans）生物膜发育过程中导管植入与取出的手术操作。此外，我们不仅通过传统的菌落形成单位（CFU）计数，还通过生物发光成像（BLI）对成熟生物膜进行了定量分析。
如图1A所示，将非磷光性聚氨酯导管材料切割成1 cm长的装置，并随后涂覆血清。此步骤非常关键，因为与未涂覆血清的植入物相比，血清涂层可使Candida细胞更快地附着于基质上15。需要特别指出的是，在开展任何C. albicans实验之前，我们首先记录了装置的背景发光情况18。该步骤在进行任何生物发光成像（BLI）之前至关重要，因为装置本身的高磷光会干扰对gLuc-表达细胞所产生的特异性生物发光信号强度及信号动力学的评估。接下来，将C. albicans细胞与涂覆血清的导管片段共同孵育。随后在动物背部皮下切口后植入导管片段（图2A）。在此体内实验设置中，在小鼠背...

我们介绍了一种在小鼠皮下模型中建立Candida albicans生物膜的实验方法。通过测定菌落形成单位数量以及非侵入性生物发光成像对真菌生物膜进行定量，其中产生的光量与活细胞数量相对应。

Candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测

白色念珠菌在生物或非生物表面形成生物膜，对住院患者构成特定威胁。迄今为止，白色念珠菌……

以下实验的总体目标是验证使用表达荧光素酶的菌株对白色念珠菌细胞在体内形成生物膜进行无创监测的可行性。该方法通过将已定植表达荧光素酶的白色念珠菌菌株的导管片段植入小鼠背部来实现。在第二步中，酵母菌在细胞外基质内生长形成较厚的细胞层，从而在导管内部形成成熟的生物膜。接下来，加入可被荧光素酶催化转化的底物。该反应会产生可测量的光信号，随后利用生物发光成像（BLI）技术记录并定量活体宿主内生物膜的形成。与现有其他技术（如中心静脉系统）相比，该方法的主要优势在于，我们可在单个动物体内同时检测多达六个生物膜，从而显著减少统计分析所需的实验动物数量。该技术的应用前景涉及白色念珠菌生物膜形成的治疗，因为我们的方法能够便捷地测试现有及新型抗真菌成分。此外，该方法可加深对白色念珠菌及真菌生物膜的理解，还可推广应用于其他微生物，如细菌或其他真菌种类。建议的操作步骤可在任何具备动物饲养设施的实验室中轻松实施，前提是手术前24小时可进入该设施。在生物安全柜内打开含有三腔导管的包装。使用无菌镊子移除所有不必要的部件，并用无菌手术刀切除与导管相连的部分。然后将一把尺子置于塑料包装下方，将聚氨酯导管切割成每段长1厘米的小段。接下来，向每根导管中加入约 1.8 毫升的 100% 胎牛血清，并将导管片段于 37°C 下孵育过夜。次日早晨，将每根涂有血清的导管片段转移至各自的 1.5 毫升微量离心管中，并从 YPD 平板上刮取白色念珠菌，按 1:100 的稀释比例将其接种到另一微量离心管中含 1 毫升 PBS 的溶液中。计数后，将细胞悬液稀释至终浓度为每毫升 5 × 10⁴ 个细胞。向每段包被了血清的导管中加入一毫升细胞。在37摄氏度下孵育90分钟，使细胞贴附于导管上。然后用无菌镊子将试管垂直固定。用一毫升 PBS 从管腔内轻轻冲洗每段两次，以放置导管。首先，将一只八周龄的雌性麻醉小鼠置于加热垫上，剃除其下背部的毛发。然后对皮肤进行消毒，并在动物两侧各做一个 0.5 至 1 厘米的小切口。接下来，使用剪刀解剖皮下组织，制作两个长约1.5厘米、宽约1厘米的皮下隧道。将三段导管分别插入每个隧道中，确保各段导管水平排列且彼此相邻，不发生重叠。用缝线关闭切口，然后用消毒剂非常轻柔地清洁伤口。然后将局部麻醉剂直接应用于切口处，并给予麻醉逆转剂，同时监测动物直至其完全恢复。为了在适当的实验时间点成像生物膜的形成，向麻醉动物体内含有导管的每个区域皮下注射100 µL新鲜配制的coil和terezin。随后进行连续扫描，采集时间范围为20至60秒，直至达到最大信号强度。在采集下一帧图像时，在每组三根导管上放置一个感兴趣区域，以测量先前采集的帧的生物发光成像（BLI）信号强度。同时，在对照区域放置一个固定大小的矩形感兴趣区域，以在Living Image软件中测量背景信号。分别测量每组三根导管及背景区域感兴趣区域内的光子通量。在生物膜形成过程中，对每只动物在不同时间点重复进行上述测量后，报告每个导管三联组的BLI信号强度，单位为每秒光子通量。数据可直接复制粘贴至电子表格程序中。纵向实验结束时，处死每只动物，切开皮下组织，用无菌镊子逐个取出导管片段。用一毫升 PBS 将导管清洗两次，方法如前所述。然后将导管片段放入新微型离心管中，加入一毫升新鲜 PBS，在水浴中超声处理，频率为 40,000 赫兹。超声 10 分钟后，将含有导管的离心管置于冰上，并取原始样品 100 微升，分别进行 1:10 和 1:100 稀释，接种于 YPD 琼脂平板上。重复一次。最后，在对数尺度上绘制每只动物的菌落形成单位的平均值和标准差，以及生物发光成像信号。在此图像中，显示了生物膜形成六天后具有代表性的动物及其感兴趣区域的生物发光信号。请注意，对照背景区域无信号产生，表明生物膜仅局限于念珠菌包被导管附近的区域。在此代表性实验中，可观察到由表达荧光素酶的生物膜产生的明显BLI信号，而野生型菌株仅产生背景信号。这种信号增强的趋势与每份生物膜中菌落形成单位的增加以及各组动物的光子通量测量结果一致。这些数据表明，生物发光成像（BLI）是一种强大的技术，可用于监测和定量分析皮下小鼠模型中白色念珠菌成熟生物膜的体内形成。一旦掌握该技术，用念珠菌细胞感染装置可能需要两小时，而每只小鼠的导管植入可在10分钟内完成。每只小鼠的BLI成像可在五分钟内完成。使用BLI的主要优势在于，可以在同一只动物体内反复监测生物量和生物膜的发育情况。随着时间推移，采用该方法后，其他技术如MRI或CT可提供关于确切解剖位置的信息。随后，该信息可用于更复杂模型（如深静脉大教堂模型）中的定量分析。观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠体内进行皮下生物膜实验，这可能为进一步深入分析宿主与病原体相互作用奠定基础。

candida-albicans-biofilm-development-on-medically-relevant-foreign

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

白色念珠菌生物膜发展在医学上，国外相关机构在小鼠皮下型号其次是生物发光成像

本视频展示了以下内容的开发过程 体内 用于研究生物膜形成的鼠类模型 白色念珠菌 在皮下组织中。该实验涉及植入...

Candida albicans 在小鼠体内的生物膜形成模型

本文介绍了一种利用无毛小鼠建立的新型糖尿病小鼠模型，可用于对发光假单胞菌（Pseudomonas...

来到光的一侧：体内监测糖尿病无毛小鼠模型慢性伤口中铜绿假单胞菌的生物膜感染

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生物膜形成的可视化 白色念珠菌 使用自动化微流控装置

本实验方案的目的是在哺乳动物胃肠道中观察白色念珠菌（Candida...

使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

观察和量化内部特征 白色念珠菌...

澄清与成像 白色念珠菌 生物膜

本论文描述了通过膀胱内给予携带lux操纵子的尿路致病菌以在小鼠中诱导尿路感染，并利用生物发光成像对细菌载量进行后续的纵向体内分析。...

利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访

本文描述了一种用于筛选中等规模样本的方法 白色念珠菌 利用非侵入性共聚焦显微镜，在哺乳动物宿主内活动感染期间筛选与形态发生表型相关的突变体文库。...

使用 In Vivo 成像技术在哺乳动物宿主活跃感染期间筛选 Candida albicans 突变菌株的形态发生表型

由危险病原体引起的假体周围关节感染（PJI）在临床骨科中较为常见。现有的动物模型无法准确模拟PJI的实际状况。本文中，我们建立了一种与白色念珠菌（Candida...

小鼠假体周围Candida albicans感染模型

我们建立了一种与C.albicans相关的导管相关性感染（CRI）小鼠模型，该模型中导管表面可形成生物膜，且C.albicans与宿主之间的相互作用与临床CRI具有良好的相关性。该模型有助于筛选针对C.albicans生物膜相关CRI的治疗方法，为临床转化奠定基础。...

小鼠导管相关性Candida albicans感染模型

本方案描述了抗菌光动力疗法（aPDT）在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用。aPDT 采用水溶性姜黄素类化合物混合物结合蓝光 LED...

姜黄素类介导的光动力抗菌疗法在小鼠口腔念珠菌病模型中的应用

本方案描述了一种独特的植入物相关感染实验模型，可在单只小鼠体内于相同条件下同时孵育两个植入物与细菌。该模型还可利用优化的比较分析方法，精确评估植入物表面的生物膜形成情况，展示了评价生物材料抗菌性能的先进实验技术。...

一种用于定量评估皮下脓肿中手术植入物上生物膜形成的独特小鼠模型

了解利用生物发光成像技术在小鼠皮下模型中监测白色念珠菌生物膜形成的方法。该技术通过荧光素酶表达菌株实现活体无创检测，为抗真菌治疗研究提供高效工具。

Candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测

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