Candida albicans 在小鼠皮下模型中于医学相关异物表面的生物膜形成及其生物发光成像检测
2015年1月27日
我们介绍了一种在小鼠皮下模型中建立Candida albicans生物膜的实验方法。通过测定菌落形成单位数量以及非侵入性生物发光成像对真菌生物膜进行定量，其中产生的光量与活细胞数量相对应。
以下实验的总体目标是验证使用表达荧光素酶的菌株对白色念珠菌细胞在体内形成生物膜进行无创监测的可行性。该方法通过将已定植表达荧光素酶的白色念珠菌菌株的导管片段植入小鼠背部来实现。在第二步中，酵母菌在细胞外基质内生长形成较厚的细胞层，从而在导管内部形成成熟的生物膜。
接下来，加入可被荧光素酶催化转化的底物。该反应会产生可测量的光信号，随后利用生物发光成像（BLI）技术记录并定量活体宿主内生物膜的形成。与现有其他技术（如中心静脉系统）相比，该方法的主要优势在于，我们可在单个动物体内同时检测多达六个生物膜，从而显著减少统计分析所需的实验动物数量。
该技术的应用前景涉及白色念珠菌生物膜形成的治疗，因为我们的方法能够便捷地测试现有及新型抗真菌成分。此外，该方法可加深对白色念珠菌及真菌生物膜的理解，还可推广应用于其他微生物，如细菌或其他真菌种类。
建议的操作步骤可在任何具备动物饲养设施的实验室中轻松实施，前提是手术前24小时可进入该设施。在生物安全柜内打开含有三腔导管的包装。使用无菌镊子移除所有不必要的部件，并用无菌手术刀切除与导管相连的部分。然后将一把尺子置于塑料包装下方，将聚氨酯导管切割成每段长1厘米的小段。
接下来，向每根导管中加入约 1.8 毫升的 100% 胎牛血清，并将导管片段于 37°C 下孵育过夜。次日早晨，将每根涂有血清的导管片段转移至各自的 1.5 毫升微量离心管中，并从 YPD 平板上刮取白色念珠菌，按 1:100 的稀释比例将其接种到另一微量离心管中含 1 毫升 PBS 的溶液中。计数后，将细胞悬液稀释至终浓度为每毫升 5 × 10⁴ 个细胞。
向每段包被了血清的导管中加入一毫升细胞。在37摄氏度下孵育90分钟，使细胞贴附于导管上。然后用无菌镊子将试管垂直固定。
用一毫升 PBS 从管腔内轻轻冲洗每段两次，以放置导管。首先，将一只八周龄的雌性麻醉小鼠置于加热垫上，剃除其下背部的毛发。然后对皮肤进行消毒，并在动物两侧各做一个 0.5 至 1 厘米的小切口。
接下来，使用剪刀解剖皮下组织，制作两个长约1.5厘米、宽约1厘米的皮下隧道。将三段导管分别插入每个隧道中，确保各段导管水平排列且彼此相邻，不发生重叠。用缝线关闭切口，然后用消毒剂非常轻柔地清洁伤口。
然后将局部麻醉剂直接应用于切口处，并给予麻醉逆转剂，同时监测动物直至其完全恢复。为了在适当的实验时间点成像生物膜的形成，向麻醉动物体内含有导管的每个区域皮下注射100 µL新鲜配制的coil和terezin。随后进行连续扫描，采集时间范围为20至60秒，直至达到最大信号强度。
在采集下一帧图像时，在每组三根导管上放置一个感兴趣区域，以测量先前采集的帧的生物发光成像（BLI）信号强度。同时，在对照区域放置一个固定大小的矩形感兴趣区域，以在Living Image软件中测量背景信号。分别测量每组三根导管及背景区域感兴趣区域内的光子通量。
在生物膜形成过程中，对每只动物在不同时间点重复进行上述测量后，报告每个导管三联组的BLI信号强度，单位为每秒光子通量。数据可直接复制粘贴至电子表格程序中。纵向实验结束时，处死每只动物，切开皮下组织，用无菌镊子逐个取出导管片段。
用一毫升 PBS 将导管清洗两次，方法如前所述。然后将导管片段放入新微型离心管中，加入一毫升新鲜 PBS，在水浴中超声处理，频率为 40,000 赫兹。超声 10 分钟后，将含有导管的离心管置于冰上，并取原始样品 100 微升，分别进行 1:10 和 1:100 稀释，接种于 YPD 琼脂平板上。
重复一次。最后，在对数尺度上绘制每只动物的菌落形成单位的平均值和标准差，以及生物发光成像信号。
在此图像中，显示了生物膜形成六天后具有代表性的动物及其感兴趣区域的生物发光信号。请注意，对照背景区域无信号产生，表明生物膜仅局限于念珠菌包被导管附近的区域。在此代表性实验中，可观察到由表达荧光素酶的生物膜产生的明显BLI信号，而野生型菌株仅产生背景信号。
这种信号增强的趋势与每份生物膜中菌落形成单位的增加以及各组动物的光子通量测量结果一致。这些数据表明，生物发光成像（BLI）是一种强大的技术，可用于监测和定量分析皮下小鼠模型中白色念珠菌成熟生物膜的体内形成。一旦掌握该技术，用念珠菌细胞感染装置可能需要两小时，而每只小鼠的导管植入可在10分钟内完成。
每只小鼠的BLI成像可在五分钟内完成。使用BLI的主要优势在于，可以在同一只动物体内反复监测生物量和生物膜的发育情况。随着时间推移，采用该方法后，其他技术如MRI或CT可提供关于确切解剖位置的信息。
随后，该信息可用于更复杂模型（如深静脉大教堂模型）中的定量分析。观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠体内进行皮下生物膜实验，这可能为进一步深入分析宿主与病原体相互作用奠定基础。
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概述
本研究介绍了一种用于监测的实验方案 白色念珠菌 利用小鼠模型研究生物膜的形成。通过生物发光成像和菌落形成单位对生物膜的形成进行定量，从而深入了解真菌在体内的行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 真菌致病性
- 活体成像
背景
- 生物膜是由微生物群落形成的复杂结构。
- Candida albicans 是一种能够形成生物膜的常见真菌病原体。
- 在活体中监测生物膜的形成对于理解其致病性至关重要。
- 生物发光成像为在活体动物中研究生物膜提供了一种非侵入性方法。
研究目的
- 验证表达荧光素酶的菌株以监测生物膜的形成。
- 评估抗真菌治疗对生物膜发育的疗效。
- 提供一种适用于其他微生物物种的方法。
使用的方法
- 将定植有白色念珠菌（Candida albicans）的导管片段植入小鼠体内。
- 利用生物发光成像技术定量分析生物膜的形成。
- 通过统计学分析比较不同条件下生物膜的生长情况。
- 实验结束后测定菌落形成单位。
主要结果
- 成功在体内实现导管碎片上的生物膜定植。
- 生物发光成像结果与菌落形成单位计数具有相关性。
- 证明了该方法在抗真菌治疗测试中的应用潜力。
- 提供了关于活体宿主内生物膜空间分布的深入见解。
结论
- 生物发光成像是一种研究的有效工具 白色念珠菌 生物膜
- 该方法可减少实验所需的动物数量。
- 研究结果可为未来的抗真菌治疗策略提供参考。
常见问题
行业重要性概述
非侵入性生物发光成像技术可实现对白色念珠菌生物膜在体内的长期动态监测，减少动物使用量，并支持抗真菌药物的筛选。该方法可提供生物膜发育过程的定量、实时数据，提高临床前抗真菌评估的预测可靠性。该技术填补了导管相关性真菌感染模型在靶点验证和先导化合物筛选方面的关键空白。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将生物发光信号与活体宿主中的生物膜生物量相关联，实现对抗真菌靶点的探究。
- 操作价值：通过对同一只动物进行无创、重复的生物膜进展监测，支持机制性风险降低研究。
- 预测价值：通过将荧光素酶表达与皮下植入物中可存活真菌负荷量关联，提高靶点验证的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：在生理相关条件下，为抗真菌化合物筛选提供定量且可重复的检测结果。
- 操作价值：可在每只动物体内对多个生物膜进行高通量评估，提高检测效率并减少变异性。
- 可扩展性：适用于纵向研究，无需终末取样即可进行剂量-反应和时间进程分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：在医学相关的异物表面模拟生物膜形成，再现临床导管相关感染场景。
- 临床前应用价值：通过实现对生物膜负荷的无创重复成像，支持药代动力学/药效学（PK/PD）建模。
- 风险降低：通过捕捉动态的生物膜结构及宿主-病原体相互作用，减少抗真菌筛选中的假阴性结果。
流程与工作流整合
该方法可整合到从靶点验证到先导化合物优化的抗真菌药物发现工作流程中，实现无创生物膜定量，从而在开展成本较高的临床前研究之前为决策提供依据。
- 发现生物学：通过测量与抗真菌活性相对应的生物发光信号的降低，验证靶点结合效果。
- 筛选：为化合物库提供标准化的定量输出，支持在不同实验场所间实现检测的可重复性。
- 分析：生成光子通量数据，可在不同处理组和时间点之间进行归一化和统计学比较。
- 转化研究：将体外研究结果与体内生物膜动态变化相联系，支持基于生物标志物的抗真菌药物开发。
- 企业级复用：建立一个可应用于其他真菌或细菌生物膜模型的平台，最大化基础设施投资效益。
运营与企业影响
- 科学价值：通过实现对体内生物膜抑制的直接可视化，提高抗真菌疗效预测的可信度。
- 操作价值：通过对同一受试对象进行重复成像，减少动物使用量和实验变异性。
- 战略价值：利用具有生理相关性的数据加速抗真菌先导化合物的鉴定，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：通过提供生物膜穿透活性的早期证据，支持基于风险调整的药物研发推进。
实施注意事项
- 需要具备小鼠手术操作、无菌技术以及生物发光成像系统的专业知识。
- 依赖于表达荧光素酶的白色念珠菌菌株及腔肠素底物的可获得性。
- 需要在不同操作人员之间对导管植入和生物膜诱导方案进行标准化。
- 需验证信号强度与菌落形成单位（CFU）计数之间的线性关系，以实现准确定量。
- 仅限于皮下植入模型；外推至其他感染部位需额外的模型优化。
