Name: 视网膜下进行注射的鼠害提供视网膜色素上皮细胞悬浮 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学习视网膜下注射视网膜色素上皮细胞的方法，用于啮齿动物视网膜退行性疾病模型研究。该技术通过锐针造孔和钝针注射实现微创递送，结合组织学和活体成像评估细胞存活与整合效果，为临床前研究提供可靠方案。

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我们感谢 Alison Dorsey 在开发视网膜下注射技术方面提供的帮助。同时，我们感谢美国国立眼科研究所（NEI 基金项目 EY11254 和 EY021416）、加州再生医学研究所（CIRM 基金项目 TR1-01219）以及 Lowy 医学研究所（LMRI）为本项目提供的慷慨资助。

注意：所有动物均按照斯克里普斯研究所制定的伦理准则进行处理。
1. 注射材料的准备（约20分钟）
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>预热细胞解离溶液（最好选择可通过稀释失活而非通过血清失活的溶液）、无菌 PBS 和培养基（表 1）。</li>
	<li>通过拆卸带有钝针的注射器，并将其各部件在水中煮沸 15 分钟，进行灭菌。</li>
</ol>
2. 注射用视网膜色素上皮细胞的制备（约30分钟至1小时）
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>使用预热的细胞解离液在 37 °C 下孵育 5–8 分钟，以解离视网膜色素上皮（RPE）细胞。</li>
	<li>轻轻刮取培养皿表面，使仍附着的细胞脱落。</li>
	<li>用大量培养基（加满 15 ml 离心管）稀释细胞，以中和解离液，并进行细胞计数。</li>
	<li>在 800 × g 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞重悬于无菌预热的 PBS 中，浓度为 200,000 个细胞/µl（以便在 0.5 µl 体积中递送 100,000 个细胞），并转移至 1.5 ml 微量离心管中。</li>
	<li>可选：加入活细胞瞬时荧光标记物，在 37 °C 下孵育 30–45 分钟。</li>
	<li>用平头针头将 0.5 µl 细胞悬液吸入注射器，并尽快完成注射。</li>
</ol>
3. 视网膜下注射（每次注射约5分钟）
注意：如果可能，使用成年白化大鼠学习该技术，因为其角膜缘血管更容易观察。在学习过程中（尝试注射细胞之前）注射快绿溶液，以便更清晰地观察注射部位。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>对啮齿类动物进行麻醉。采用腹腔注射100&#160;mg/ml的氯胺酮和10&#160;mg/ml的赛拉嗪（20 µl/10 g体重），优于使用异氟烷吸入麻醉，因为动物在吸入麻醉状态下口鼻固定于吸入器中，难以操作并完成眼球注射。
	<ol>
		<li>通过轻捏动物的一只脚掌确认其是否已深度麻醉。若动物出现退缩反应，需等待数分钟后再次测试，直至确认深度麻醉后再开始视网膜下注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物侧卧放置，使待注射的眼朝向上方。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用手指轻轻固定动物头部（一手拇指和食指置于耳部上方，另一手固定下颌），沿眼睑方向平行轻拉皮肤，使眼球轻微突出于眼窝外（暂时性眼球突出），从而更易于操作（见图1C）。注意不要紧握动物咽喉部位。</li>
	<li>使用30 G的一次性无菌锐利针头，在角膜缘正下方穿刺造孔（若刺中血管，将引起明显出血，并影响后续定位孔口）；穿刺时保持一定角度，避免针头接触晶状体（见图1D）。切勿用锐利或钝针触碰晶状体，否则将立即导致白内障形成。 
	注：注射操作由两人协作效果更佳。一人使用锐利针头完成穿刺后，可由另一人立即接过装有钝针的注射器进行注射，有助于持续聚焦并准确定位穿刺孔。</li>
	<li>在保持头部固定的同时，将一次性锐利针头缓慢退出眼球。务必准确记住穿刺孔的位置。</li>
	<li>将预装细胞悬液、连接钝针的注射器安装至显微操作仪，或手持操作，随后将钝针针尖经原穿刺孔插入眼内，再次注意避免接触晶状体，并轻柔地将针头缓慢推进至眼内，直至感到轻微阻力（见图1D）。</li>
	<li>尽量减少任何移动，缓慢而谨慎地将RPE细胞注入视网膜下腔。 
	注：注射将不可避免地引起RPE/视网膜脱离。然而，操作越精确，脱离范围越小，视网膜复位的成功率也显著提高（见图1E）。过度动作可能导致针头重新进入视网膜，侧向移动则可能损伤视网膜。使用注射泵为可选操作，但有助于实现极为精确的给药。</li>
	<li>缓慢退出注射器。滴加眼表保湿液以维持眼球表面湿润。</li>
	<li>持续监测动物状态，直至其恢复胸卧位。在动物未恢复胸卧位前，不得无人看管，也不得将其放回与其他清醒动物共处的笼中。</li>
</ol>

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<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Diniz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
</ol>

所有作者均无任何商业利益需要声明。

本文介绍了一种相对简单的方法，用于在大鼠和小鼠中进行视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液的视网膜下注射。该方案易于掌握，随着操作经验的积累，可显著减少手术创伤。图3；这代表了一次较好的注射效果，尤其是使用显微操作仪时（图1A）。任何创伤均可被监测 体内 使用 cSLO 和 OCT 系统（图2）如可获取。若需要更高分辨率且噪声更少的图像，可采用先进的成像平台，以及在小鼠疾病模型中实施光学相干断层扫描（OCT）的优秀实验方案。39-41.
该技术最常见的并发症源于手术过程中动物体位不当、造成过度的视网膜脱离、脉络膜出血以及视网膜色素上皮（RPE）细胞从针头反流。若体位不正确，将难以创建第一个穿刺孔，之后更难找到该孔。眼球的移动可能遮蔽穿刺孔，使钝头针无法穿透。虽然可以使用锐利针头另开一孔，但这会造成更大的创伤。明显的视网膜脱离可导致严重的视力丧失。视网膜脱离会诱导视网膜神经元和胶质细胞发生特征性形态学改变；这种反应性胶质增生与视网膜重塑的联合作用可促...

感觉视网膜由神经元、胶质细胞和内皮细胞构成的功能性层次结构组成。位于视网膜后部的光感受器受光激活，通过光转导将光子转化为电信号，这些信号经中间神经元进一步处理后传递至大脑的视觉皮层。光转导过程离不开穆勒胶质细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞的协同作用。RPE细胞以单层结构排列在光感受器后方，执行多种多样且对光感受器功能和稳态至关重要的功能。事实上，RPE细胞与光感受器之间具有高度的相互依赖性，通常被视为一个功能单位。RPE细胞的死亡或功能障碍会对光感受器造成严重的继发性损害，并与老年性黄斑变性（AMD）密切相关，后者是老年人致盲的首要原因1,2。
尽管目前尚未发现治愈AMD的方法，但多项临床研究表明，视网膜色素上皮（RPE）细胞替代疗法可能是一种有前景的治疗选择3-13随着干细胞技术的发展，现在已能够大量生成视网膜色素上皮（RPE）细胞 体外 来自胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（hES 和 hiPS）的细胞在功能和解剖结构上均与其体细胞对应物高度相似14-26干细胞来源的RPE也被证明具有功能 体内 由多个独立研究团队（包括我们自己的团队）证实，可显著延缓具有自发性视网膜退变的大鼠和小鼠品系的视网膜退行性病变进程16,18,21,22,25,28,29这一系列临床与临床前支持性证据极具说服力，目前已有多个利用干细胞来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞预防视网膜变性的临床试验正在进行中30,31. 
RPE 可通过多种分化和注射技术，从人胚胎干细胞（hES）和/或人诱导多能干细胞（hiPS）中高效获得，并植入啮齿类动物的视网膜下腔32,33。（参见 Westenskow et al. 发表的一篇多媒体形式的方法学论文，其中展示了我们所采用的定向分化方案34。）关于外源性递送的 RPE 细胞在植入后的安全性、存活率及功能能力，目前仍存在若干关键问题，因此掌握在啮齿类动物中进行视网膜下注射的技术至关重要16,18,21,29,36,37。RPE 细胞的递送并非易事，且学界对于最有效的注射技术尚存争议。本文所描述的方案是一种简单而有效的视网膜下腔团注式递送 RPE 细胞的方法，并已被应用于首个干细胞来源 RPE 移植的临床试验31。（读者也可参考 Eberle et al. 在 JoVE 上发表的另一篇文章，其中展示了啮齿类动物视网膜下注射的另一种操作方式38。）
本文所述技术无法实现可视化，且不可避免地会造成创伤（与其他所有视网膜下注射技术一样）。该操作通过在角膜缘血管下方制造一个小孔，沿巩膜路径插入钝针，将细胞悬液注射至对侧视网膜下。注射者在钝针接触视网膜时会感受到阻力。尽管如此，注射后可直接观察到细胞，且可通过使用短暂性荧光标记物标记视网膜色素上皮（RPE）细胞，并利用共聚焦扫描检眼镜（cSLO）进行检测，从而确定所诱发的视网膜脱离程度。此外，还可使用光学相干断层扫描（OCT）系统监测创伤情况，并轻松识别注射部位。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（55 mM）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21985-023</td><td>50 ml x 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞刮铲</td><td>VWR</td><td>89260-222</td><td>1 盒</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Molecular Probes</td><td>C34552</td><td>50 &amp;micro;g x 20</td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml x 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>25 g x 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Genteal Gel Drops 中至重度润滑型滴眼液&amp;nbsp;</td><td>Walmart</td><td>4060941</td><td>25 ml x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Model 62 RN 注射器</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>1 支注射器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hamilton 33 G 针头，0.5&quot;，point 3（304 不锈钢）</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>6 支针头</td></tr><tr><td>Knockout DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Leica Biosystems</td><td>39430216</td><td>1 个支架</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100X）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Leica Biosystems</td><td>3943001</td><td>1 台操作仪</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>BD 无针滑动接头注射器&amp;nbsp;（3 ml）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD309656</td><td>1 包</td></tr><tr><td>BD 特殊用途针头&amp;nbsp;（30 G，1&quot;）</td><td>VWR</td><td>BD305128</td><td>1 盒</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X），无酚红</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>100 ml x 1</td></tr></tbody></table>

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

将光转化为电冲动的过程发生在视网膜外层，主要由视杆细胞、视锥细胞光感受器以及视网膜色素上皮（RPE）细胞完成。RPE细胞为光感受器提供关键支持，RPE细胞的死亡或功能障碍是年龄相关性黄斑变性（AMD）的典型特征，而AMD是55岁及以上人群永久性视力丧失的首要原因。尽管目前尚未发现治愈AMD的方法，但在患病眼中植入健康的RPE细胞可能成为一种有效的治疗手段，且可从多能干细胞中大量生成RPE细胞。关于RPE细胞移植的安全性和有效性的若干重要问题仍可在动物模型中进行研究，目前已有多个被广泛接受的RPE注射方案。本文所述技术已被多个研究团队在不同研究中采用，首先使用锐利针头在眼球上制造一个小孔，然后将装有细胞的钝头针头注射器经此孔插入，并穿过玻璃体，直至轻轻接触RPE层。采用这种相对简单且所需设备最少的注射方法，我们实现了干细胞来源的RPE细胞在宿主RPE细胞间的稳定且高效的整合，从而在动物模型中显著防止了光感受器的退化。虽然不属于实际操作步骤，我们还描述了如何评估注射所引起的创伤程度，以及如何验证细胞已被准确注入视网膜下腔的方法。 体内 成像方式。最后，该方案的应用不仅限于RPE细胞；也可用于向视网膜下腔注射任何化合物或细胞。

利用本文所述的方法，我们可以快速且一致地将视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液递送至啮齿类动物的视网膜下腔。虽然使用显微操作器并非必需，但采用图1A&amp;B所示装置可显著减少操作创伤。如图1C所示固定啮齿类动物，以实现暂时性眼球突出。无论使用显微操作器还是手动操作，其步骤均相同，如图1D的示意图所示。若操作得当，可通过共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）检测到标记的RPE细胞发出的荧光，并可通过光学相干断层扫描（OCT）系统观察到诱导产生的视网膜脱离（图2）。在图3中，使用cSLO围绕整个注射部位采集了多幅图像（图2和图3的图像均在视网膜下注射后立即获取）。请注意，在中心图像（3-5）中视网膜脱离最为明显，但并不严重。
<img alt="显微手术装置、视网膜研究、视网膜操作步...

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。

光信号转化为电冲动的过程发生在视网膜外层，主要由视杆细胞和视锥细胞光感受器以及视网膜色素上皮...

本实验的总体目标是在尽量减少创伤的情况下，将视网膜色素上皮（RPE）细胞注射到啮齿类动物的视网膜下腔。首先使用锐利的针头在麻醉动物的眼部刺出一个小孔，随后通过钝针将细胞注入视网膜下腔。最后一步，将保湿剂涂抹于眼球表面以保持其湿润。最终，可通过组织学和活体成像等方法监测注射效果。尽管今天我们向您展示的方法是专门针对将视网膜色素上皮细胞（RPE细胞）递送至视网膜下腔而设计的，但该技术本身也可广泛适用于将其他多种细胞类型和化学物质递送至视网膜下腔，用于各类临床前研究。通常，初次接触该方法的人会感到困难，因为很难判断注射操作的完成质量。该方法的可视化演示至关重要，因为若无实际观察示范，注射步骤将难以掌握。注射前约一小时，将非胰蛋白酶细胞解离液、无菌 PBS 和培养基预热至 37 摄氏度，并将装有 33 号钝针的注射器各部件拆开后置于沸水中消毒。接下来，在 37 摄氏度条件下，将 RPE 细胞置于细胞解离液中解离 5 至 8 分钟，轻轻刮除仍附着的细胞，然后用 15 毫升培养基稀释以终止酶反应，将解离后的细胞转移至 15 毫升离心管中，计数后离心收集细胞，并以每微升含 2×10⁵ 个细胞的密度重悬于无菌预热的溶液中。加入PBS，然后将细胞转移至1.5毫升微量离心管中，并用0.5微升细胞悬液装填已灭菌的注射器，立即进行注射。在通过脚趾夹捏确认动物已镇静后，将麻醉后的啮齿类动物侧放，使待注射的眼睛朝上。随后在解剖显微镜下，用两根手指分别捏住耳部上方和下颌部位固定动物头部，并沿眼睑方向轻轻拉伸皮肤，使眼球轻微突出于眼窝之外。接着，以一定角度持握注射器。为避免触碰晶状体并注意避开任何血管，使用30号锐利针头在角巩膜缘下方立即穿刺打孔进行注射。两人协作操作效果更佳，其中一人可传递注射器、钝针和注射针筒，使操作者能够持续专注于小鼠的眼睛。现在，在保持头部固定的同时，将一次性锐利针头从眼睛中撤出。注意准确记住小孔的位置，并安装预装好的注射器。将带有钝头针头的注射器固定在显微操作仪上，将钝头针头的尖端穿过小孔。再次注意不要触碰晶状体，轻柔地推动针头穿过眼球，直至感到阻力。尽量减少所有操作动作。小心地将RPE细胞缓慢注射到视网膜下腔。将出现RPE视网膜脱离。然而，更洁净的注射可最大限度地减少脱离，并显著提高重新附着的可能性，然后缓慢撤出注射器，并滴加眼部保湿滴液以保持眼睛湿润，持续监测动物直至其完全恢复。利用该技术，可快速且稳定地将视网膜色素上皮细胞（RPE细胞）递送至啮齿类动物的视网膜下腔。尽管并非必需，但使用显微操作器可显著减少创伤。在此操作设置下，若操作得当，可通过共焦扫描检眼镜检测到标记的视网膜色素上皮（RPE）细胞的荧光信号，并利用光学相干断层扫描系统观察所诱导的视网膜脱离。共焦扫描检眼镜用于在视网膜下注射后立即采集注射部位周围区域的这些图像。请注意，中间图像显示的脱离最为明

performing-subretinal-injections-rodents-to-deliver-retinal-pigment

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

视网膜下进行注射的鼠害提供视网膜色素上皮细胞悬浮

该手术技术演示了将基因治疗载体和干细胞注射到小鼠眼球视网膜下腔的方法。...

围产期小鼠眼内视网膜下注射基因治疗载体与干细胞

来源：Park, S. W., 等. 小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的角膜缘入路视网膜下注射。J. Vis. Exp.

小鼠模型中向视网膜色素上皮的视网膜下注射病毒载体

视网膜下注射是一种将基因有效递送至小鼠眼内视网膜色素上皮的外科技术。本文介绍了一种在实验小鼠中对视网膜色素上皮进行病毒载体视网膜下注射的简便且可重复的方法。...

经角膜缘入路-小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的视网膜下注射

关键词：角膜缘入路，视网膜下注射，病毒载体，基因治疗，视网膜色素上皮，小鼠

视网膜下注射是将大分子治疗剂（如蛋白质和病毒载体）递送至光感受器和视网膜色素上皮层的最常用技术。本文介绍了一种在小鼠中可有效靶向视网膜下腔、造成最小附带损伤且恢复时间较快的替代方法。...

一种可替代且经过验证的进入视网膜下腔的注射方法 通过 经巩膜后部入路

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。...

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

视网膜色素上皮（RPE）的视网膜下植入是治疗退行性视网膜疾病最有前景的方法之一。然而，在大眼动物模型上开展临床前研究仍具有挑战性。本报告提供了将RPE细胞搭载于细胞载体上进行视网膜下移植至小型猪的实验操作指南。...

小型猪视网膜下植入携带视网膜色素上皮细胞的载体：术前准备、手术技术及术后护理指南

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

本文介绍了利用术中可视化技术来控制注射部位和视网膜脱离范围的大鼠视网膜下注射方法。...

大鼠视网膜下注射与视网膜脱离的术中可视化

视网膜下注射是光感受器和视网膜色素上皮（RPE）疾病治疗药物临床前研发中不可或缺的技术。本文介绍一种优化的小鼠经巩膜视网膜下注射技术，可提高术中操作成功率并最大限度减少视网膜损伤。...

优化的小鼠经巩膜微创视网膜下注射技术

学习视网膜下注射视网膜色素上皮细胞的方法，用于啮齿动物视网膜退行性疾病模型研究。该技术通过锐针造孔和钝针注射实现微创递送，结合组织学和活体成像评估细胞存活与整合效果，为临床前研究提供可靠方案。

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

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