全基因组蛋白质相互作用通过蛋白质片段互补法（PCA）的活细胞筛选

蛋白质相互作用，这些相互作用在很大程度上决定了它们的功能。使用基于二氢叶酸还原酶蛋白片段互补测定 （DHFR-PCA） 的酵母适应性测定，可以在体内高通量鉴定蛋白质相互作用伴侣。

该程序的总体目标是使用 DI 氢叶酸还原酶蛋白片段互补测定或 D-H-F-R-P-C-A 鉴定目标蛋白质的蛋白质相互作用伴侣。这是通过首先在高密度集落阵列上压缩 DH FFR F 三个集合或赞美来实现的。接下来，诱饵菌株是在丰富的介质上用一系列赞美制成的。

在最后一步中，选择这些交配产生的二倍体。最终，通过测量选择性 PCA 培养基上的菌落大小来量化 DHFR 的重构，该培养基给出的信号与细胞中重构的诱饵猎物复合物的量成正比。这项技术的影响延伸到癌症等疾病的治疗，因为它是通过蛋白质相互作用网络的重新布线。

这种突变会导致此类疾病。在手术的早晨，首先将 PIN 工具浸泡在水浴站中 5 次，持续 10 秒，以去除任何残留的细胞团块，从而对机器人平台进行消毒。然后将 PIN 工具在刷子站中来回浸泡两次，在 so cater 站中浸泡两次，每次浸泡 20 秒，以在清洁 PIN 工具时去除任何剩余的细胞。

打开紫外线灯 5 分钟，对机器人进行消毒。然后，在最后一次清洗后，将 PIN 工具在空气干燥站中干燥 25 秒。在此处将 A-D-H-F-R 集合浓缩到 16 个 384 个菌株阵列上。

一个 384 数组可以细分为四个等利间隔的象限，每个象限由 96 个位置组成，采用 2 x 2 矩阵布局，总共有四个象限。要对每个 384 阵列执行此作，请在包含 YPD 加 250 微克/毫升的全向托盘的四个象限上打印四个甘油板。潮霉素 B，使用 96 针工具执行此作，在来自 DHFR 3 系列的 60 个甘油板之间插入 4 个 96 孔板，其中包含 LDH FFR F 三个阴性对照，以获得最终一组 64 个板，正好填充四个 1， 536 阵列。

然后在其他 60 个板之间插入 4 个 96 孔板，其中包含 LDH FFR F 三个阴性对照，得到最终一组 64 个板，这些板正好填充 4 15 36 个阵列，然后将细胞添加到源板中，在 35 毫升无菌水中润湿灭菌针在湿站的全向托盘中。将阵列在 37 摄氏度下孵育两天，然后将收集物浓缩成四个阵列，每组 1， 536 个菌株。在四个目标板中的每一个板上打印四个 384 菌株阵列。

使用 384 pin 工具。在每个复制周期之间对 PIN 工具进行消毒，就像刚刚在另外两天的孵育后所展示的那样。通过使用 1， 536 pin 工具在选定的 YPD 培养基上复制四个阵列来标准化菌落大小，并将板再孵育 48 小时。

实现高吞吐量。首先，在 50 毫升试管中的 20 毫升液体 YPD 和 CIO 蓖麻毒素中接种诱饵菌株的培养物，并在 30 摄氏度下以 250 RPM 摇动孵育细胞两天。当培养物达到饱和时。

将 5 毫升细胞悬液接种到 YPD 加 gnat omni 托盘上，5 到 10 分钟后让细胞在表面吸收，去除多余的液体，并在 30 摄氏度下孵育培养物两天后。使用 1， 536 针工具将诱饵菌株打印在 12 个 YPD 板上，每个细胞草坪不超过四次。然后，再次使用 1， 536 针工具，在诱饵单元顶部打印 DHFR F 三个集合的适当阵列。

让菌株在另外两天的孵育中交配，然后通过在含有 YPD 加氢霉素 B 和 Nordin 的全向托盘上打印菌落来选择二倍体细胞。将二倍体在 30 摄氏度下再孵育两天，然后在孵育一天后重复选择，就像刚刚演示的那样。第二天用含有甲氨蝶呤的培养基倒入平板。

使用 1， 536 针工具将二倍体细胞打印到甲氨蝶呤培养基上，并在塑料袋中将板再孵育 4 天，以防止培养物变干。在孵化的第三天。如第二天刚刚演示的那样，倒入第二批含有 MTX 培养基的全向托盘，打开机器人灯并使用机器人平台对板进行成像，以减少 PCA 菌株的背景生长并提高定量分辨率，在第二批 MTX 培养基上复制细胞以执行第二轮 MTX 选择，如刚刚演示的那样。

最后，从第二组板获取图像后，使用适当的软件分析菌落阵列，收集每个阵列每个位置的菌落大小信息。使用 LDH FFR F 三个控制定义的阈值可用作确定高置信度命中的经验阈值。然后可以从 Biogrid 等数据库中检索诱饵的已知物理交互器，并将其覆盖在数据上。

例如，在这里，八分之五的高置信度命中之前被报告为 NUP 82 相互作用物，其中其他 NUP one 16 和 NUP 1 59 被确定为 NUP 82 子复合物的一部分。数据还表明，PEX 30 近似膜蛋白可能代表 Nup 82 的新型物理相互作用，正如使用 D-H-F-R-P-C-A 在检测到的其他两个相互作用伙伴的低通量下证实的那样。新的 1、20 和新的 85 被确定为不属于新的 82 子复合物的一部分，这说明了 D-H-F-R-P-C-A 检测较大复合物的子复合物内部和之间的相互作用的能力。

在尝试此过程时，请务必记住使用 Freshly Report 培养基，以避免打印步骤中出现任何故障排除，并包括必要的对照，以确保最终的 PCA 培养基仅能够生长显示 DHFR 互补的细胞。