分离方法 离体 大鼠模型中的肺灌注：建立大鼠离体肺灌注（EVLP）项目的经验总结

本实验的总体目标是建立一种稳定的大鼠离体肺灌注模型，以获得可重复的实验结果。第一步是进行气管插管并开始机械通气。接下来，对肺动脉和左心房进行插管。

最后一步是将心肺组织块从胸腔中取出，并置于离体肺灌注回路中。最终，通过使用压力传感器、重量换能器和血气分析仪，实时测量肺动脉压力及其他参数，以评估肺脏的状态。离体肺灌注是一项卓越的技术，使我们能够扩大肺移植的供体来源。

我们预计，通过这一技术作为器官评估的平台，能够提高用于移植的器官质量，并改善整体移植效果。在库珀实验室，我们提出了“武装器官”的概念，即对器官进行评估、重塑或修复，然后加以改造，以提高其质量，从而改善移植效果。我们已建立了一种稳定且可重复的离体肺灌注小型动物大鼠模型。

通过本视频，我们将向您演示构建离体肺灌注模型的关键且重要的步骤，该模型随后可作为灌注与移植研究的平台。首先建立EVLP回路，并在整个系统中循环温灌注液。将温水浴、热交换器和人工胸腔设置为37摄氏度。

在实验中，通过 PERFUSE 八通道气体过滤器通入脱氧氧气，以确保其溶解氧浓度约为 6%。打开数据采集程序后，将肺动脉压传感器、气管压差传感器、呼吸气流压差传感器、肺重量传感器以及泵速传感器连接至模数转换器盒。最后，设置好手术台，并准备好手术过程中所需的所有手术工具和用品。

通过脚趾夹捏确认麻醉效果后，将麻醉动物仰卧位放置于手术台上。使用数据采集程序开始记录数据。准备就绪后，打开腹腔，并向下腔静脉注射肝素。

按照标准操作流程，插管气管并将其连接至通气回路。开启机械呼吸机以开始对肺部进行机械通气。接着，撑开胸腔以暴露肺部，注意避免触碰肺组织。

取出胸腺，并将腹腔内容物移向一侧，以暴露下腔静脉或肠系膜静脉。安乐死后，在肺动脉和主动脉后方放置一根丝线缝线。为固定肺动脉插管做准备，在右心室流出道前壁做一 2 至 3 毫米的切口，将插管插入主肺动脉。

用丝线缝合固定，通过肺动脉灌注约15毫升低钾含电解质溶液，并从心尖流出，以清除肺血管系统中的血凝块。接着将丝线置于心脏后方并环绕心室。为扩张二尖瓣并便于插管，将一把小型手术镊经心尖穿过二尖瓣进入左心房。

准备就绪后，将套管经二尖瓣插入心尖并进入左心房。用丝线固定左心房套管。接着，将肺动脉套管连接至EVLP回路。

确保来自循环管路的流入管路已用灌注液八预充。为防止空气进入心脏和肺部，开启主蠕动泵并将其调至低速。这将使灌注液八流经肺动脉，从左心室流出进入胸腔。

监测肺动脉压力，确保其无急剧升高，以避免出现阻塞或插管不良的情况。准备就绪后，关闭蠕动泵。将肺动脉插管连接至离体肺灌注回路。

在移除心肺组织块之前，切勿将左心房插管连接至体外循环系统。使用止血钳夹闭食管，并在止血钳下方切断，利用食管钝性上提心肺结构，分离周围组织，切断降主动脉及附属血管，通过食管向上提起以完整游离心肺组织块。横断气管以完全游离心肺组织块，随后将其放置于体外肺灌注（EVLP）系统指定位置。

然后将左心房插管连接至流出管路，并启动蠕动泵。为记录通气数据并快速监测压力，需将通气管路从EVLP装置顶部移除，并连接带有压力传感器的外壳。接下来，将通气管路重新插入EVLP装置顶部。

确保气泡捕集器中充分充满灌注液八。在最初的15分钟内，为避免将气泡引入肺部，应缓慢调整通气和灌注参数至目标实验水平。在此初始上升阶段，同时将灌注流速逐步增加至所需的流速和压力。

建议将呼吸机设置为产生间歇性侧向呼吸，以促进液体从肺腔排出并延缓水肿的发生。将时间零点定义为呼吸参数达到每公斤体重4毫升潮气量且呼气末正压为2厘米水柱的时刻。

水和灌注参数均处于预期水平并保持恒定。如有需要，可从取样口采集八份灌注样品，用液氮速冻，并记录取样时间。实验完成后，分离出任何需要的解剖组织样本，或用液氮速冻，或置于固定液中，以供后续研究使用。

雄性Sprague Dawley大鼠的肺重量在离体肺灌注开始后的前10分钟内未发生显著变化，并在随后60分钟内保持稳定。肺动脉压力亦无变化。同样，肺血管阻力在整个研究期间均未发生改变。

在使用高潮气量和高呼气末正压（PEEP）通气一小时后，PERFUSE 八组中促炎性细胞因子浓度升高，而抗炎性细胞因子浓度保持不变。观看本视频后，您应能够充分理解在实验室中建立大鼠离体肺灌注模型所需的关键步骤。