Name: 的隔离方法离体肺灌注的大鼠模型：教训制定鼠EVLP课程中学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习建立大鼠离体肺灌注模型，通过气管插管、肺动脉和左心房插管实现机械通气与实时监测。该方法可评估供肺质量，为肺移植研究提供可重复的动物实验平台。

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作者谨此感谢哈佛仪器公司（Harvard Apparatus）的协助，特别是Stephanie Pazniokas，MS生理系统 &amp;#38; 再生医学 感谢他们在灌注回路的组装、修改和故障排查方面提供的帮助，以及XVIVO Perfusion（Daniel Martinelli，CCP，CTP）提供用于非临床用途的肺停搏液。

注意：所有操作均按照机构动物护理指南和美国国家研究委员会《实验动物人道护理与使用指南》（IACUC）的规定进行，并已获得俄亥俄州立大学 IACUC 委员会的批准。
1. 初始设置
<ol>
	<li>建立EVLP回路，并在植入离体肺之前，使灌注液在系统中循环并保持温暖（37 °C）（图1）。</li>
	<li>将用于包裹灌注液储液罐、热交换器和人工胸腔的温水浴设置为37 °C并开始循环（图1）。</li>
	<li>通过气体过滤器向灌注液中反向通入去氧混合气体（例如，6% O2, 8% CO2, 84% N2），以确保实验过程中灌注液的溶解氧浓度约为6%。 
	注：这种去氧灌注液可通过测量器官后灌注液中引入的氧气量来评估肺功能。</li>
	<li>打开数据采集程序，并将肺动脉压力传感器、气管差压传感器、呼吸流量差压传感器、肺重量传感器和泵速传感器连接至EVLP回路及数据采集/模数转换器盒（图2）。</li>
	<li>在EVLP回路旁设置手术台和手术器械（图3）。</li>
	<li>若需采集样本，应在EVLP回路附近放置一个盛有液氮的小容器。 
	注：作者的系统经过改进，可在不中断可能损伤肺组织的压力-流量动力学的情况下，采集器官前和器官后的灌注液样本。</li>
</ol>
2. 麻醉剂和肝素的配制及大鼠麻醉
<ol>
	<li>在接触大鼠及大鼠组织前，穿戴以下个人防护装备（PPE）：外科口罩、外科手套和一次性防护服。</li>
	<li>称量大鼠体重并记录数值。</li>
	<li>配制1,200 U/kg肝素。</li>
	<li>在同一注射器中配制60 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪，先加入氯胺酮。</li>
	<li>将氯胺酮和赛拉嗪的混合物腹腔注射至大鼠体内，等待5分钟使大鼠进入无意识状态。</li>
	<li>通过检查足趾夹捏反射确认麻醉效果。若大鼠无足趾回缩反应，则表明无疼痛感。</li>
	<li>将大鼠转移至手术台，固定于仰卧位，并用酒精喷洒进行消毒。</li>
</ol>
3. 大鼠肺脏的提取与初始通气
<ol>
	<li>准备4-20厘米长的丝线缝合线（3-0或4-0规格即可）。</li>
	<li>使用数据采集程序开始记录数据。</li>
	<li>检查麻醉深度是否合适，使用手术剪通过腹正中切口进入腹腔，并向下腔静脉注射肝素。</li>
	<li>将切口向头侧延伸，越过胸骨柄进入颈部，直至暴露气管。注意不要穿破胸腔。图 4A).</li>
	<li>在正中线处于气管后方进行分离，并将丝线从气管后方穿过&#160;(图4B).</li>
	<li>抬起气管的前段，在气管软骨环之间高位做一横向切口。此时不要切穿气管后部的膜性部分。图4C).</li>
	<li>用气管插管插入气管，并用丝线缝合固定图 4D确保缝合线结固定在切迹处，以防止套管移位。</li>
	<li>将气管插管连接至通气回路。</li>
	<li>打开机械呼吸机，开始对肺部进行机械通气。 
	注意：初始设置选择潮气量为 4 ml/kg，呼气末正压（PEEP）为 2 cmH₂O。2O. 这些设置为初始设置，一旦器官置于系统中后，可根据实验条件进行调整 离体 灌注系统</li>
	<li>通过胸骨/剑突进入胸腔，并向头侧的胸骨上切迹方向继续推进。注意避免接触肺部。 
	注意：由于大鼠肺组织较为脆弱，任何无意的操作都可能导致创伤和肺水肿图5A).</li>
	<li>使用2个拉钩，牵开胸腔以充分暴露解剖结构（图5A再次注意避免触碰肺部。</li>
	<li>轻轻抬起并钝性分离以摘除胸腺。</li>
	<li>将腹腔内容物移向一侧，以暴露下腔静脉（IVC）或肠系膜静脉（MV）。</li>
	<li>切开下腔静脉或门静脉以放血处死大鼠，实施安乐死。</li>
	<li>在肺动脉和主动脉后方放置一根丝线缝合，以备固定肺动脉插管&#160;(图5B).</li>
	<li>在右心室流出道前表面做一个2-3 mm的切口，将导管插入切口并进入主肺动脉，用丝线缝合固定图5C).</li>
	<li>切开心脏心尖部，以进入左心室，并通过灌注约15 ml低钾溶液冲洗肺血管系统内的血凝块+ 电解质溶液经肺动脉流入，从心尖流出至胸腔内（图 5D).</li>
	<li>将肺动脉（PA）插管连接至体外肺灌注（EVLP）回路。确保从回路通向肺动脉插管的流入管路已用灌注液预充，以避免空气进入心脏和肺部。</li>
	<li>打开主蠕动泵，将其调至低速（约2 ml/min），使灌注液经肺动脉流过，并从左心室流出至胸腔。 **关键步骤** 确保肺动脉压力不会突然升高，因为这可能是阻塞或插管不良的征兆（图6).</li>
	<li>关闭蠕动泵。</li>
	<li>将丝线缝合线置于心脏后方，环绕心室（图7).</li>
	<li>通过心尖插入一把小型手术镊，穿过二尖瓣进入左心房，开始左心房插管操作。 
	注意：这将扩张二尖瓣并便于插管。过度扩张或过深扩张可能意外撕裂左心房，导致器官获取失败。</li>
	<li>将镊子从心脏上移开。</li>
	<li>将左心房插管经二尖瓣从心尖插入左心房。</li>
	<li>用丝线在心脏后方固定左心房插管（图8). 
	注意：可将此缝线预先打结，以方便插管。</li>
	<li>将肺动脉套管连接到 离体 肺灌注回路（图9A不要在心脏-肺组织块完全从体内取出之前将左心房插管连接到EVLP回路。</li>
	<li>用止血钳夹住食管，并在止血钳下方（止血钳与膈肌之间）切断，以便利用食管将心肺结构向上牵拉。</li>
	<li>钝性分离周围组织，切断降主动脉及辅助血管，同时通过食管提起，游离心肺组织块。图9B).</li>
	<li>在气管插管头侧横断气管，以完全游离心肺组织块。</li>
	<li>取出心肺组织块并放置于体外肺灌注（EVLP）回路的指定位置图 9C).</li>
	<li>将左心房套管连接至流出管路，并启动主蠕动泵（图9D).</li>
</ol>
4. 离体 肺灌注
<ol>
	<li>迅速将通气管路从EVLP装置顶部移开，安装带有压力传感器的外壳，然后将通气管路重新连接至EVLP装置顶部的外壳上方。 
	注意：这将允许记录通风数据并监测压力。</li>
	<li>确保灌注液充满气泡捕集器，且无气泡残留（即，空气栓子）被引入肺部。</li>
	<li>在最初的15分钟内，缓慢调整通气和灌注参数至目标实验水平。此外，在此初始上升阶段，将灌注流速逐步增加至目标流速和/或压力。 
	注意：建议将呼吸机设置为产生间歇性深呼吸（sigh breaths），以促进液体从肺部排出，从而延缓肺水肿的发生。具有深呼吸功能的呼吸机可实现此类通气模式。</li>
	<li>将“时间0”定义为通气参数处于潮气量4 ml/kg、PEEP为2 cm H₂O的时刻2O₂，且灌注参数处于预期水平并保持稳定。</li>
	<li>必要时，从取样口采集灌注液样本，用液氮速冻，并记录样本采集时间。</li>
	<li>实验结束后，分离出所需解剖组织样本，立即在液氮中速冻，或置于固定液中，以备后续研究。</li>
</ol>

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</ol>

系统监测
实验顺利进行时的现象：
当导管已接入回路且肺脏开始通气后，可通过多种方式确认系统运行正常。灌注液在管路中应无任何泄漏。肺血管阻力（PVR）应保持相对稳定（假设流量恒定）。当呼吸机正常工作并扩张肺脏以募集更多肺泡进行气体交换后，氧交换能力应有所提升。图12A展示了在人工胸腔内连接至EVLP回路、通气和灌注均正常的肺脏。
实验进行不顺利时的表现：
在EVLP实验的初期阶段，有一些常见问题的发生率较高。第一个也是最容易解决的问题是肺部流出管道出现泄漏。这种泄漏可通过观察到部分管路下方有灌注液积聚，以及储液器中的液位持续下降而被发现。应检查并拧紧泄漏区域附近的任何管路连接处，并检查管路本身是否存在泄漏。如果泄漏发生在进入肺部之前，还可能将气泡引入肺内。这种情况应尽快处理，因为灌注液中的气泡会导致组织损伤，并显著增加肺血管阻力（PVR）。此外，泄漏也可能来自肺组织本身或其中一根插管。这可能是由于插管滑脱，或流出管路发生阻塞导致压力积聚所致。应检查两根插管的位置，确保其均未发生滑脱或扭曲。在此过程中还应监测肺动脉（PA）压力，因为PA压力的瞬时升高是管路发生某种阻塞的明显征象。图12B展示了一个因压力过高而破裂的肺。肺组织本身的泄漏也可能是由于组织撕裂所致。此问题可能可以修复，也可能无法修复，但在这种情况下，最佳处理方式是重新调整并再次固定插管。
关键学习要点/机会：
通过反复试验对离体肺灌注系统（ex-vivo lung perfusion, EVLP）的优化，我们已确定若干关键问题，现概述如下，以促进 EVLP 系统的高效实施。首先，在器官获取方面，必须遵循标准麻醉技术，确保动物得到充分麻醉（使用足量麻醉剂，并注入腹腔），同时须严格遵守 IACUC 的所有规定。导管（如图 13 A、B 和 C 所示）应反复冲洗，以清除肺血管系统内的任何血块或碎片。在动物选择方面，我们建议使用体重为 250–350 g 的 Sprague Dawley 或 Lewis 大鼠。对于体重接近 250 g 的大鼠，插管时需格外小心，因其血管较细，插管操作更困难，容易损伤血管系统。若使用更小的大鼠或小鼠模型，则可能需要选用更小的导管。
气管插管通常并不困难，关键在于插管前先分离周围筋膜，将丝线从气管后方穿过并妥善固定。随后，在结扎线以上1-2个气管环处做一前侧切口，以便插入导管。为确保导管稳固，应将方结打在气管环之间的沟槽内，以增强固定效果图4C）。与气管插管相比，肺动脉（PA）插管更具挑战性。本研究采用以下步骤进行该操作：首先，用一对镊子夹住心尖；将另一对镊子经由横窦插入，并穿过缝线以固定插管于近端肺动脉。在右心室流出道（RVOT）前方立即切开右心室图14A）。在切开右心室流出道后，将导管引导至肺动脉流出道。在右心室切开前，先将缝线置于肺动脉/主动脉后方，可提高操作效率（图5C）。应使用缝线将导管固定在位，以防移位。若肺动脉（PA）导管未处于正确的解剖方位，可能会发生严重并发症。导管插入过深可能导致仅灌注单一分支，或在取出心肺标本时因扭转而造成导管位置不当。此时可轻易将其重新调整至原始位置，以维持正确的解剖角度。最后，左心房（LA）插管是该操作中最困难的部分。左心房导管必须准确置入左心房内。由于组织极为脆弱，操作时需格外注意，避免施加过大外力或扭转动作，以防肺静脉撕裂 &amp;左心房，否则将导致实验无法挽救。肺动脉插管应优先于左心房插管放置。研究表明，通过左心室切口切除心尖，可破坏腱索，从而更易经二尖瓣叶进入。此外，心室切口还有助于扩张和观察二尖瓣，并便于将插管经二尖瓣送入。使用一对小型钝头镊子扩张二尖瓣环，有助于观察通往左心房的路径（图14B缝合线应在插管前置于心脏后方。操作时可使用一对小型钝头镊子轻轻抬起心脏，将缝合线置于心脏下方并横穿通过。此时左心房已准备就绪，可进行插管。将左心房插管经由镊子之间送入，以便清晰观察插管进入左心房的位置。需特别注意避免插管滑入左心室。随后应将缝合线紧密固定于左心室心肌上。若将缝合线固定在左心房，可能造成插管全部或部分阻塞。
在操作过程中，必须确保装置的流入部分无任何空气残留。若存在较大量的空气，可能引发空气栓塞，增加肺血管阻力（PVR）（相当于形成“气锁”），从而导致在给定压力下灌注液的流量显著降低。可通过系统中的多个位点排除空气。流出部分存在空气属于正常现象，不会对肺组织产生有害影响。已有研究表明，通过持续向猪模型中注入少量空气，可在8周内成功复制肺动脉高压的病理状态。增加的空气量会减少灌注量，同时引起周围组织的炎症反应19。
在完成插管后但来自左心房（LA）的导管尚未连接到体外肺灌注（EVLP）管路之前，即可开始灌注。应让灌注液流经管路以清除任何血凝块，此过程中的灌注液可无碍地排入胸壁内。将灌注泵切换至手动模式，并缓慢增加流速至约 2 ml/min，以便密切监测肺动脉（PA）压力。当压力超过 20–30 cmH2O 时，可能提示存在阻塞；同时观察是否有灌注液从左心房流出也可作为判断依据，但该现象通常难以察觉。若压力确实升至 20–30 cmH2O 以上，应立即停止灌注泵并重新检查两处插管情况。待压力稳定在 10–20 cmH2O 左右后，让灌注液持续流经并进入胸腔约 2 分钟。此时可将来自左心房的导管连接至 EVLP 循环系统。随后可将灌注泵速度提高至 5–10 ml/min。随着液柱在管路中推进，由于液柱高度增加，静压随之上升，肺动脉压力也会相应升高。如果液体无法越过管路中的最高点，可能需要在管路另一端施加负压吸引，或尝试降低管路最高部分的位置。一旦克服该问题，灌注液应能顺利循环，无任何障碍。
使用呼吸机时需注意几个问题。首先，随着肺部水肿加重、重量增加，可能发生支气管/气管扭曲以及心肺位置改变。保持插管处于相对正常的解剖位置非常重要，因此可能需要调整一根或两根插管的位置。该体外肺灌注（EVLP）系统可兼容压力控制或容量控制呼吸机，以及正压或负压通气模式。在大鼠模型中，我们发现采用正压、容量控制通气模式，潮气量设置在4–10 ml/kg、呼气末正压（PEEP）设置在2–8 cmH2O时效果良好。然而，当PEEP达到8 cmH2O时，可能导致气管分叉处发生破裂。每次实验（或连续进行的多组实验）结束后，应清除通向气管的通气管路中可能沿气管上行的支气管肺泡灌洗（BAL）液体。若不及时清理，该液体会逐渐硬化，完全堵塞通气管路。
灌注液的成分对于成功的离体肺灌注（EVLP）实验至关重要。5%的右旋糖酐混合液可实现接近生理状态的肺灌注，维持稳定的胶体渗透压以促使液体回流入血管系统，从而防止水肿，并预防肺血管内血栓形成。需要注意的是，某些品系的大鼠可能对右旋糖酐过敏，从而引发肺水肿20。本研究中所有实验组的灌注液成分保持一致，因此右旋糖酐含量不应成为混杂因素。胶体渗透压是一个关键变量，可能改善或导致组织水肿。已有研究在该系统中使用 commercially available 灌注液，这些溶液针对冷静态保存或常温灌注进行了优化，可延长肺脏的存活时间。我们注意到，其中一些溶液含有白蛋白，而一个潜在担忧是牛源白蛋白可能在啮齿类动物肺组织中引发炎症反应。尽管最佳灌注液成分仍在持续研究中，但灌注液的设计必须综合考虑胶体渗透压、渗透压以及缓冲能力。我们建议采用改良的Krebs–Henseleit溶液或细胞培养基作为基础溶液。胶体渗透压应根据具体应用选择由右旋糖酐或白蛋白来维持。灌注压力和流速会影响器官状态，超生理范围的灌注参数可能使器官易于发生机械性损伤。
实验过程中的视觉指示：
有许多视觉提示以及实时数据指标可用于判断离体肺灌注（EVLP）实验是否顺利进行。肺脏体积应保持不变，每次呼吸后均能回缩至相同的容积。肺组织本身不应出现任何泄漏。肺血管阻力（PVR）、肺脏重量和顺应性应保持相对稳定。氧合能力应保持稳定或略有升高。
实验过程中肺组织受损时会出现多种视觉指征。肺组织会变得水肿，并在大小和重量上迅速增加。肺的颜色会发生改变（由浅粉褐色变为白色），并且可在组织中观察到液体积聚的区域。如果气管或肺因气压伤或过度扩张而破裂，损伤部位将出现气泡（图12B）。此外，氧气产量会下降，肺血管阻力（PVR）和顺应性也会显著升高。
在啮齿类等小型动物上使用离体肺灌注（EVLP）模型的潜力，为未来改善肺移植治疗的研究打开了大门。然而，该小型动物模型需要更深入的理解，以真正模拟肺移植过程。该模型未来可用于改进医学治疗，并为后续肺移植研究确定基线参数。

临床相关性
目前可用于移植的合适肺源严重匮乏，全国范围内仅有19%的肺脏能够被利用，导致患者等待时间延长，部分患者在等待移植期间死亡1短缺可能源于供体年龄较大、创伤、感染、多系统器官衰竭，以及有时在获取时供体肺脏已受到损伤2此外，肺脏在胸腔外是一种脆弱的器官，标准的运输和保存技术可能导致其功能退化甚至无法使用。因此，维持并改善肺脏的可移植性 离体 最近已成为肺移植医学的主要关注点。
离体 肺灌注 (EVLP)
离体肺灌注（ex-vivo lung perfusion, EVLP）技术已发展为可对拟用于移植的器官进行持续灌注，并提供一段评估时间，从而具备对肺脏进行复苏或再 conditioning 的潜力。EVLP 可延长器官离体后的总缺血时间，并使供体肺脏能够运输至更远的距离3。通常，肺脏以总肺容量的 50% 或气道峰压 20 cmH2O 进行通气，吸入氧浓度（FiO2）维持在 30% 至 50%4。在人类和大型动物中，灌注液以 40–60 ml/kg（约相当于预测心输出量 100 ml/kg 的 40%）的速率进行灌注5,6，而在大鼠中则以约相当于心输出量 20% 的速率灌注7。STEEN 溶液的应用使得人类肺脏可在常温（RT）&#160;环境下运输而不会发生肺水肿9。多伦多大学肺移植项目已对此项开创性工作进行了优化10–13，目前正评估其在改善边缘供体肺移植评估中的应用价值14,15。然而，为实现边缘性或低于标准肺脏的再生，所需的最优通气与灌注条件尚不明确，这也是当前研究的活跃领域。
离体肺灌注系统已用于小型动物，以诱导肺损伤、重建呼吸系统疾病，或用不同溶液灌注肺脏以防止缺血性损害。研究人员已利用离体肺灌注系统建立小型动物肺移植模型，模拟可在人类和大型动物中应用的体外肺灌注（EVLP）方案16-18。然而，该实验模型在模拟人体生理状态所采用的各种技术和参数方面仍面临诸多挑战。特别是，在EVLP过程中维持肺脏活性存在诸多细微要点，这些要点可能源于肺脏获取技术、正压通气参数设置、灌注液成分与流动条件以及肺血管插管方法的差异。因此，本研究旨在为科研界提供一系列我们在实践中总结的故障排查与实施建议，以建立一种在啮齿类动物模型中稳定实施EVLP的可靠方法。

<table><tbody><tr><td>基本肺灌注系统 IPL-2</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5号不锈钢镊子，弯曲，11&amp;nbsp;cm</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>IND500232</td><td></td></tr><tr><td>5号 Dumostar 镊子，11&amp;nbsp;cm</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS500085-A</td><td></td></tr><tr><td>7号钛合金镊子，12&amp;nbsp;cm，尖端弯曲</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS600187</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 剪刀，8&amp;nbsp;cm，直刃，5&amp;nbsp;mm</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS14124</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀，8&amp;nbsp;cm，直刃，5&amp;nbsp;mm</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS14003</td><td></td></tr><tr><td>器械消毒托盘，5&quot; × 7&quot;</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS800101</td><td></td></tr><tr><td>肝素，每30 ml含30,000单位</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>由俄亥俄州立大学药房提供</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮，每5&amp;nbsp;ml含500&amp;nbsp;mg</td><td>JHP Pharmaceuticals</td><td>由俄亥俄州立大学药房提供</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪，每1&amp;nbsp;ml含100&amp;nbsp;mg</td><td>Akorn</td><td>由俄亥俄州立大学药房提供</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;nbsp;cc胰岛素注射器，29&amp;nbsp;G × 1/2&quot;针头</td><td>B-D</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Hyflex NBR</td><td>Ansell</td><td>S-17310M</td><td>防咬手套</td></tr><tr><td>BL1500</td><td>Sartorius</td><td>Practum 1102-1S</td><td>天平</td></tr><tr><td>大号平底固定器</td><td>Braintree Scientific Inc</td><td>FB L 3.375 直径 × 8.5，适用于250–500克大鼠&amp;nbsp;</td><td>大鼠注射用隧道</td></tr><tr><td>斯特林无粉丁腈检查手套，大号</td><td>Kimberly-Clark</td><td>50708</td><td></td></tr><tr><td>Rapidpoint 405</td><td>Siemens</td><td></td><td>血气分析仪</td></tr><tr><td>纤维氧合器 D150</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>PY2 73-3762</td><td></td></tr><tr><td>LabChart v7.3.7</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气管插管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733557</td><td></td></tr><tr><td>肺动脉插管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730710</td><td></td></tr><tr><td>左心房插管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730712</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Ismatec</td><td>ISM 827B</td><td></td></tr><tr><td>小型动物呼吸机，型号683</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-000</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline Star Edition 003, E100</td><td>Lauda</td><td>LCK 1879</td><td>水浴加热器</td></tr><tr><td>管路盒</td><td>Cole-Parmer</td><td>IS 0649</td><td></td></tr><tr><td>D150连接套件</td><td>Cole-Parmer</td><td>VK 73-3763</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>ADInstruments</td><td>730045</td><td></td></tr><tr><td>TAM-A换能器放大模块，型号705/1</td><td>Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td><td>73-0065</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D换能器放大器，型号705/2</td><td>Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP灌注伺服控制器，型号704</td><td>Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td><td>732806</td><td></td></tr><tr><td>CFBA载频桥式放大器，型号672</td><td>Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td><td>731747</td><td></td></tr><tr><td>VCM呼吸机控制模块，型号681</td><td>Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td><td>731741</td><td></td></tr><tr><td>TCM时间控制模块，型号686</td><td>Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td><td>731750</td><td></td></tr><tr><td>IL2灌注液管路组件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733842</td><td></td></tr><tr><td>湿化室管路组件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73V83157</td><td></td></tr><tr><td>Tygon E-3603管路，内径2.4&amp;nbsp;mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721017</td><td>进入肺部的灌注液管路</td></tr><tr><td>Tygon E-3603管路，内径3.2&amp;nbsp;mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721019</td><td>离开肺部的灌注液管路</td></tr><tr><td>低钾右旋糖酐葡萄糖溶液</td><td></td><td></td><td>用于肺冲洗</td></tr></tbody></table>

分离方法 离体 大鼠模型中的肺灌注：建立大鼠离体肺灌注（evlp）项目的经验总结

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

可用于肺移植的合格供体肺因质量不佳而严重短缺。 离体 肺灌注（EVLP）技术通过实现对供体器官的评估并扩大供体来源，使人类肺移植变得更加可行。随着该技术的不断发展与完善，在移植前对质量欠佳的肺脏进行潜在评估和质量改善的能力成为迫切需求。为了更严格地评估这些方法，有必要建立一种可重复的动物模型，以用于测试改进的技术和优化供体肺的管理策略，同时研究对肺移植受者的影响。此外，还需建立与相关病理状态相关的EVLP动物模型， 例如， 呼吸机相关性肺损伤（VILI）将为这些疾病的治疗评估提供一种新颖的方法。本文描述了大鼠离体肺灌注（EVLP）肺程序的建立过程，以及对该方法的优化，从而实现可重复的模型，为未来研究的拓展奠定基础。我们还介绍了该EVLP系统在大鼠肺脏中模拟VILI的应用。本研究旨在向科研界提供关键信息以及在反复试验中积累的重要技术要点和经验，这些对于建立稳定且可重复的EVLP系统至关重要。

通过数据采集程序收集的实时力学数据可轻松用于检验多种假设。例如，图10A展示了10次大鼠实验中在60分钟内的平均肺重量，这些实验中的动物采用低潮气量/低呼气末正压（4 ml/kg 和 2 cmH2O）进行通气。尽管在整个实验过程中肺重量略有增加，但该变化在统计学上并不显著（ANOVA，p = 0.92）。图10B展示了12次大鼠实验中60分钟内的平均肺动脉压（PAP）。0分钟时间点的较低PAP是由于所有实验开始时采用的灌注流量和通气参数较低所致，此后PAP保持稳定，在t=10分钟后无统计学显著变化（秩次ANOVA，p = 0.89）。图10C展示了12次大鼠实验中60分钟内的肺血管阻力（PVR），尽管在t=20分钟后PVR略有下降，但在本实验过程中PVR无统计学显著差异（秩次ANOVA，p = 0.65）。与本研究展示的PVR数据相比，Noda 等报道在4小时期间PVR随时间轻微上升。然而，这些作者报告的PVR数据从实验开始1小时后起算，而非实验起始点，且未提供标准差数值7。Noda 等也未展示4小时实验中的肺水肿数据，因此无法与本研究中图10A的数据进行比较。Noda 等的方法与本文所述方法的主要差异包括：在EVLP前使用LPS溶液进行1小时的低温保存；大鼠最初使用含异氟烷的气体混合物进行通气以实现麻醉；灌注液中添加了50 mg甲基泼尼松龙和50 mg头孢菌素；总灌注流量定义为计算心输出量的20%；仅在肺用100% O2通气5分钟后采集灌注液样本；实验持续4小时。
实验过程中从灌流液中采集的样本也可用于多种分析目的。例如，在 图11 我们展示了高潮气量/高呼气末正压（PEEP）通气如何在60分钟内诱发促炎反应。在这些实验中，灌注液来自4只在损伤性条件下通气的大鼠， 即， 高潮气量（10 ml/kg）和高呼气末正压（PEEP，8 cmH₂O）2O 组使用标准 ELISA 技术检测了促炎和抗炎细胞因子 IL1β、TNFα 和 IL4。如图所示 图11与通气前（0分钟）的细胞因子水平相比，60分钟的损伤性通气导致促炎性细胞因子IL-1β和TNFα水平出现统计学显著升高，而抗炎性细胞因子IL-4的浓度未发生变化。因此，该离体肺灌注（EVLP）系统能够产生在机械通气过程中常见的肺损伤特征。
<img alt="Cardiac bypass process: peristaltic pump, membrane oxygenator; lab setup with volume reservoir." src="/files/ftp_upload/52309/52309fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 小型动物的示意图与照片 离体 肺灌注（EVLP）回路 图中的字母与照片中的字母相对应。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学激发测量的光谱学装置；使用设备进行吸收/发射分析。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 所有传感器均已牢固连接至控制箱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Protein purification setup, chromatography system, process equipment on lab bench." src="/files/ftp_upload/52309/52309fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 大鼠手术台已牢固地安置在临近位置 离体 肺灌注（EVLP）回路 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于解剖学研究的大鼠解剖步骤；显示手术器械和器官的实验装置。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. （A）在颅侧做一切口以暴露气管，胸腔未被打开。（B）在气管后方放置一条丝线缝合线。（C）部分切断气管以准备插管。（D）将气管插管置入适当位置，并用丝线缝合线固定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大鼠解剖操作；手术设置用于分析内脏器官；解剖学与功能研究。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. (A) 拉开胸腔以暴露心脏和肺。(B) 准备在肺动脉后方穿线。(C) 对肺动脉进行插管，并用预先放置的丝线结扎。( D) 通过肺动脉灌注低 K+ 电解质溶液，并从左心房流出，以清除任何血凝块。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光谱数据分析图；瞬态吸收光谱；激发-发射分析；图表。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 灌注肺脏时，若增加肺动脉流量，可能导致肺动脉压力急剧升高。 如果插管操作正确且无明显阻塞，压力应下降。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示内脏器官和组织分析步骤的动物解剖装置。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 将丝线缝合线环绕整个心脏，为左心房插管做准备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于解剖学研究和医学研究的啮齿类动物内脏器官解剖过程示意图" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig8highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 左心房插管用丝线缝合固定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="Surgical procedure and isolated heart preparation on a rat; in vitro organ perfusion experiment setup." src="/files/ftp_upload/52309/52309fig9highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 9"> 
图9. (A肺动脉插管连接至 离体 肺灌注回路。 (B) 食管被夹闭，通过钝性分离结缔组织以摘取心肺组织块。C心脏-肺组织块从胸腔中取出后置于 离体 肺灌注回路。 (D左心房与 离体 肺灌注回路 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示肺重量、肺动脉压力、血管阻力随时间变化的曲线图；标注 N.S。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig10highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 10"> 
图 10. （A）雄性 Sprague Dawley 大鼠在 60 分钟 ex vivo 肺灌注过程中的肺重量（n=10）。（B）雄性 Sprague Dawley 大鼠在 60 分钟 ex vivo 肺灌注过程中的肺动脉压力（n=12）。（C）雄性 Sprague Dawley 大鼠在 60 分钟 ex vivo 肺灌注过程中的肺血管阻力（n=12），N.S. 表示无统计学显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="条形图比较IL-1b、TNF-a和IL-4在0分钟和60分钟时的浓度。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig11highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图11"> 
图11. 高潮气量（10 ml/kg）和高PEEP（8 cmH2O）通气1小时对灌注液中促炎和抗炎细胞因子浓度的影响。 n=4，*表示与0小时样本相比具有统计学显著差异（p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肺灌注装置；脱细胞过程；实验对比；生物反应器环境。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig12highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图12"> 
图12. (A) 连接到体外肺灌注（EVLP）回路的肺组织，通气和灌注正常。(B) 过高的呼气末正压（PEEP）导致气管分叉处撕裂，使气泡在损伤部位形成并充满人工胸腔。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术钩状工具，标记为 A-C，展示用于医疗操作的不同设计变体。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig13highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图13"> 
图13. （A）肺动脉插管。该插管比左心房插管更小。（B）左心房插管。该插管明显大于肺动脉插管。（C）气管插管。该插管带有肋状结构，有助于使用丝线缝合固定气管。插入气管的一端略呈尖形，以方便将插管插入气管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类动物肝脏手术；生物学研究实验装置，戴手套的手，工具。" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig14highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图14"> 
图14. （A）用镊子夹住心脏心尖，即将切开右心室以插管肺动脉。（B）使用一对小型钝头镊子扩张二尖瓣环，有助于更清晰地观察通向左心房的路径。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

离体肺灌注（EVLP）通过实现对器官的评估并扩大供体来源，使人类肺移植变得更加可行。本文中，我们描述了大鼠EVLP模型的建立过程以及相关优化，这些改进为未来的进一步拓展提供了可重复的实验模型。

分离方法 离体 大鼠模型中的肺灌注：建立大鼠离体肺灌注（EVLP）项目的经验总结

可用于肺移植的合格供体肺数量因质量欠佳而严重受限。离体肺灌注（Ex-Vivo Lung Perfusion, EVLP）技术的出现已使得……

本实验的总体目标是建立一种稳定的大鼠离体肺灌注模型，以获得可重复的实验结果。第一步是进行气管插管并开始机械通气。接下来，对肺动脉和左心房进行插管。最后一步是将心肺组织块从胸腔中取出，并置于离体肺灌注回路中。最终，通过使用压力传感器、重量传感器和血气分析仪，实时监测肺动脉压及其他参数，以评估肺脏的状态。离体肺灌注是一项卓越的技术，使我们能够扩大肺移植的供体来源。我们预计，通过这一技术作为器官评估的平台，能够提高用于移植的器官质量，并改善整体移植效果。在科珀实验室，我们提出了“武装器官”的概念，即对器官进行评估、重塑或修复，进而对其进行改造，以提高器官质量，从而改善移植效果。我们已建立了一种稳定且可重复的离体肺灌注小型动物大鼠模型。通过本视频，我们将为您演示构建离体肺灌注模型的关键且重要的步骤，该模型随后可作为灌注与移植研究的平台。首先建立 EVLP 灌注回路，并在整个系统中循环 37°C 的温灌注液。将水浴锅、热交换器和人工胸腔均设置为 37 摄氏度。在实验中，通过 PERFUSE 八通道气体过滤器通入脱氧氧气，以确保其溶解氧浓度约为 6%。打开数据采集程序后，将肺动脉压传感器、气管压差传感器、呼吸气流传感器、肺重量传感器以及泵速传感器连接至模数转换器盒。最后，设置好手术台，并准备好手术过程中所需的所有手术工具和用品。通过脚趾夹捏确认麻醉效果后，将麻醉动物仰卧位放置于手术台上。使用数据采集程序开始记录数据。准备就绪后，打开腹腔，并向下腔静脉注射肝素。按照标准操作流程，插管气管并将其连接至通气回路。启动机械呼吸机以开始对肺部进行机械通气。接着，打开胸腔以暴露肺组织，注意避免接触肺部。取出胸腺，并将腹腔内容物移向一侧以暴露下腔静脉或肠系膜静脉。安乐死后，在肺动脉和主动脉后方穿过一根丝线缝合线。为固定肺动脉插管做准备，在右心室流出道前壁做一长度为2至3毫米的切口，将插管插入主肺动脉。用丝线缝合固定，通过肺动脉灌注约15毫升低钾含正电解质溶液，并从心脏心尖部流出，以清除肺血管系统中的血块。接着，在心脏后方及心室周围置入一根丝线。为扩张二尖瓣并便于插管，将一把小型外科镊子经心尖部穿过二尖瓣进入左心房。准备就绪后，将套管经二尖瓣插入心尖，进入左心房。用丝线缝合固定左心房套管。接着，将肺动脉套管连接至体外肺灌注（EVLP）回路。确保从循环管路流入的管路已用灌注液八预充。为防止空气进入心脏和肺部，开启主蠕动泵并将其调至低速。这将使灌注液八流经肺动脉，从左心室流出，进入胸腔。监测肺动脉压力，确保其无急剧升高，以防止出现阻塞或插管不良。准备就绪后，关闭蠕动泵。将肺动脉插管连接至离体肺灌注回路。在移除心肺组织块之前，切勿将左心房插管连接至体外循环系统。使用止血钳夹闭食管，并在止血钳下方切断，利用食管钝性上提心肺结构，分离周围组织，切断降主动脉及附属血管，同时通过食管提起心肺组织块以将其游离。横断气管以完全游离心肺组织块，并将其放置于体外肺灌注（EVLP）系统指定位置。然后将左心房插管连接至流出管路，并启动蠕动泵。为记录通气数据并快速监测压力，需将通气管路从EVLP装置顶部移除，并连接带有压力传感器的外壳。接下来，将通气管路重新插入EVLP装置顶部。确保气泡捕集器中已充分充满灌注液八。在最初的15分钟内，为避免将气泡引入肺部，应缓慢调整通气和灌注参数至目标实验水平。在此初始递增阶段，同时将灌注流速提高至所需的流速和压力。建议将呼吸机设置为产生间歇性侧向呼吸，以促进液体从肺部空间排出，并延缓水肿的发生。将时间零点定义为通气参数达到每公斤体重4毫升正潮气量、呼气末正压为2厘米水柱压力的时刻。H2O 和灌注参数均处于预期水平并保持恒定。如有需要，可从取样口取出八份灌注样品，用液氮速冻，并记录取样时间。实验完成后，分离出任何需要的解剖组织样本，或用液氮速冻，或置于固定液中，以供后续研究。雄性Sprague Dawley大鼠的肺重量在离体肺灌注开始后的前10分钟之后，在随后60分钟内未发生显著变化。肺动脉压也未发生变化。同样，肺血管阻力在整个研究期间均无改变。在使用高潮气量和高呼气末正压通气一小时后，PERFUSE 八中的促炎性细胞因子浓度升高，而抗炎性细胞因子浓度保持不变。观看本视频后，您应能充分理解在实验室中建立大鼠离体肺灌注模型所需的关键步骤。

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本文描述了建立大鼠离体肺灌注（EVLP）模型所需的必要步骤，并展示了灌注肺组织相关的炎症特征。目的是传播有关大鼠EVLP模型的知识与经验，促进对这一革命性技术所涉及的生物学反应的全面理解。...

建立一种 离体 用于肺移植转化研究的大鼠肺灌注模型

目标是开发一种新的 离体 大鼠离体肺灌注（EVLP）模型，可在4小时内维持稳定的肺功能，并为行业提供具体实施细节，从而为将EVLP技术应用于啮齿类动物模型建立一种可靠的方法。...

建立一种用于循环死亡后大鼠肺脏的新型离体肺灌注系统

热预处理期间 离体 移植前修复受损肺移植物的肺灌注技术

本文介绍了一种简单高效的气管插管方法，可用于小鼠肺功能测定或肺部灌注，且允许小鼠在术后恢复并进行后续研究。该操作使用一种廉价的光纤光源，可直接照亮气管。...

一种小鼠肺部插管的简易方法

青光眼的特征是视网膜神经节细胞受损。在动物模型中诱导青光眼可为研究该疾病提供重要线索。本文概述了一种在动物模型中诱导视网膜神经节细胞（RGCs）丢失的实验方法 体内 大鼠模型及用于分析的全层视网膜制备方法...

诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

建立了一种独特的大鼠肝脏肝门阻断模型，用于研究药物分子在减轻缺血-再灌注损伤中的作用。该模型通过门静脉分支对缺血肝段的门脉供血进行直接插管，从而实现肝脏的直接给药。...

利用大鼠肝门阻断模型进行肝内节段性直接给药的方法

学习建立大鼠离体肺灌注模型，通过气管插管、肺动脉和左心房插管实现机械通气与实时监测。该方法可评估供肺质量，为肺移植研究提供可重复的动物实验平台。

分离方法离体大鼠模型中的肺灌注：建立大鼠离体肺灌注（EVLP）项目的经验总结

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