冷冻电镜技术的注意事项：大分子三维重构的样品制备与高质量数据采集入门指南

以下实验的目的是利用透射电子显微镜对大分子在冷冻水合状态下的结构进行成像。该目标通过将载有样品的载网迅速浸入冷冻剂中，获得一层薄的玻璃态样品来实现。第二步，用电子束照射样品，从而形成大分子的投影图像。

接下来，通过计算机处理图像，以获得该大分子的三维重构。结果显示了该大分子高度精细的三维结构、其构象以及其分子伴侣在三维空间中的定位。该技术在透射电镜样品制备方法中具有主要优势。

在冷冻电镜中，图像由大分子内的电子直接形成，更能真实反映其接近天然的结构。该方法的直观演示至关重要。

冷冻网格的制备以及将其转移至电子显微镜的过程由于在低温条件下操作增加了额外的复杂性而难以掌握。在抽气程序开始时以及一次冷冻电镜实验结束后，需使用升温循环。要开始此操作，请将冷冻样品杆插入抽气站的其中一个抽气接口中，然后启动升温循环选项。

在冷台控制器中，打开蝶阀 V2，当涡轮泵站的真空度稳定并达到 10⁻³ 托或更低时，打开蝶阀 V1。待样品台内温度稳定在室温以上且升温循环完成后，关闭 V1 并停止循环。

接下来，启动ZE光源循环选项，并设置必要的时间，以达到1×10⁻⁴至2×10⁻⁴托的优良真空度。当真空度达到10⁻³托范围时，打开DU抽空阀B3以及低温样品杆上的阀门。循环完成后，按照与开启时相反的顺序关闭各阀门。

使用一对镊子剥离云母片，以暴露两个新的表面。将新暴露的云母表面朝上放置于培养皿中的白色纸片上。将培养皿放入碳蒸发仪的钟罩内后，执行抽气程序，直至真空度低于10⁻⁶托，然后在云母表面镀上一层薄碳膜。

然后将薄碳膜转移至载网上。取一块0.5厘米×1厘米的镀碳云母片，将其碳膜漂浮到过滤去离子水的平面上。用镊子夹住载网，使载网有孔碳膜的一面与漂浮的碳层上表面接触，并将其捞起。

将网格的碳面朝上放置在覆盖有导电膜的 7.5 × 2.5 厘米玻璃载片上。然后将玻璃载片放入电晕放电仪的腔室中，并关闭腔室。抽真空并进行电晕放电。

在 25 毫安和 7 × 10⁻² 毫巴条件下放电 20 秒。此时开启 plunge freezing 装置。通过向储液器中注入液氮，使乙烷容器下降。

当液氮停止沸腾后，将来自乙烷罐的导管尖端放入内腔，并非常缓慢地打开阀门。使乙烷在内腔中液化，并填充至距顶部一毫米处。开启湿度控制。

接下来，将一个载网装入镊子中，并在载网的碳膜表面加载三到五微升样品。待样品吸附到载网上后，进行 blotting 操作以形成一层薄液膜，随后将载网迅速浸入液态乙烷中进行冷冻。小心地将镊子与载网组件从液态乙烷中取出，并转移至含有液氮的外层腔室中。

然后将载网转移至浸没在液氮中的小型载网盒中。此时，将冷冻电镜样品杆插入冷冻转移工作站。向冷冻电镜样品杆的杜瓦瓶及工作站容器中加入液氮。

迅速将装有冷冻水合网格的冷冻网格盒转移至工作站的液氮中。打开冷冻网格盒后，取出冷冻水合网格并将其放入样品 holder 槽中。接着，将夹环置于网格上方，并用夹环工具的钝端轻轻按压，直至其牢固地就位。

然后关闭冷冻快门。用液氮加满透射电子显微镜的防污染阱。将显微镜样品台重新倾斜至负60度。

随后，在显微镜上启动 PrepU 气闸循环。当泵抽气闸程序完成后，将样品台插入气闸中，并将冷台控制线连接至样品台，以监测温度。待红灯熄灭后，将样品台旋转至零度位置，以便将其插入透射电子显微镜（TEM）的高真空镜筒中。

收回冷冻快门并打开柱阀。在搜索模式下启动低剂量程序。居中样品台，并使用α摆动器将样品台向正负15度方向摆动以设定同心高度，选择一个合适的孔洞，并通过XY样品台控制器将其置于视野中心。

切换至对焦模式并聚焦图像，然后在0.5至4.5微米范围内对图像进行对焦。切换至曝光模式并记录图像。

最后，返回搜索模式以选择下一个孔位，并重复该序列。本研究通过负染色法和冷冻电镜法对四种具有不同结构特征的代表性样品进行成像，并比较其显微图像：负染色的腺相关病毒衣壳显示出类病毒颗粒，而冷冻电镜结果显示其为空衣壳。烟草花叶病毒的图像显示，在负染色中，螺旋状杆状结构的中央通道被染色剂填充，而在冷冻电镜图像中该通道为空。

KLH 在负染色和冷冻电镜图像中均形成具有六个条纹的特征性桶状结构。通过冷冻电镜对嗅觉受体进行观察，其矩形侧视图以及圆形顶视图和斜视图均显示出该结构内部为空心。复杂的表面特征，如中心十字形和中央凹陷，在负染色中表现为染色剂聚集，在冷冻电镜中则表现为低密度区域。

冷冻电镜中典型的伪影包括结晶冰、冰污染、像散以及网状结构。对冷冻水合状态下的 ine 受体一进行单颗粒分析和三维重构，揭示了其具有四重对称性的结构。其胞质结构域形成一个方形棱柱，包含多个可重复出现的规律性结构域，构成类似支架的结构。

在10埃的分辨率下，可以观察到α螺旋的三维结构。差异图谱分析能够揭示重要配体的位置。构象变化为大分子提供了动态的视角。

观看本视频后，您应能充分了解如何制备高质量的冷冻电镜样品。冷冻电镜结合图像处理技术，使研究人员能够深入探究大分子机器的结构亚基排列及其构象动态。