Name: 样品制备策略的3D细胞培养模型质谱成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习三维细胞培养样品制备与质谱成像分析方法。本方案介绍明胶包埋、冷冻切片及MALDI MSI检测流程，用于无标记检测蛋白质、脂质和代谢物等多种生物分子，为癌症生物学研究提供可靠的空间分布分析技术。

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本工作由沃尔瑟癌症基金会（Walther Cancer Foundation）资助，该资助属于其支持圣母大学哈珀癌症研究中心（Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame）的“推进基础癌症研究”项目（DARW），以及匹兹堡分析化学家学会（Society for Analytical Chemists of Pittsburgh）2011年启动基金（ABH）。同时感谢质谱与蛋白质组学平台工作人员提供的有益讨论。

1. 三维细胞培养及成像前准备
<ol>
	<li>培养合适的细胞系， 即， HCT116 结肠癌细胞系，二维单层培养。</li>
	<li>在含10%胎牛血清的McCoy's 5A培养基中，于5% CO₂培养箱内将HCT 116细胞接种于T-25培养瓶中培养2 孵育数天，直至细胞融合度达到50%-70%。</li>
	<li>使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，取部分细胞用血细胞计数板和台盼蓝染色检测细胞密度和活力。</li>
	<li>计数后，用完全培养基将细胞稀释至适当的接种密度，即6,000个细胞/孔或30,000个细胞/ml。</li>
</ol>
2. 准备琼脂糖包被的96孔板
<ol>
	<li>在50 ml锥形管中，将0.19 g琼脂糖加入10 ml标准培养基中（培养基中琼脂糖浓度为1.5%）10。通过轻轻混匀确保充分溶解。将琼脂糖溶液置于水浴中高压灭菌20分钟。</li>
	<li>使用多通道移液器，将50 µl琼脂糖与培养基的混合液加入平底96孔细胞培养板的60个中央孔中。由于板边缘孔的蒸发速率略高，因此在这些边缘孔中加入200 μl 1×磷酸盐缓冲液（PBS），而非琼脂糖溶液。</li>
	<li>待琼脂糖混合液加入内侧孔后，将培养板静置，冷却至约37 °C，再进行细胞接种。</li>
</ol>
3. 接种并培养三维细胞
注意：可根据具体培养需求接种更多或更少的细胞，但已确定这些条件可在培养 10–14 天后形成直径约 1 mm 的三维细胞培养结构（数据未显示）。
<ol>
	<li>向琼脂糖包被的96孔板中加入200 μl适当细胞悬液（稀释至约含6,000个细胞）。盖好板后置于37 °C、含5% CO2的加湿培养箱中进行细胞培养。</li>
	<li>每48小时至少更换一次培养基，或在培养基颜色发生明显变化时及时更换。
	<ol>
		<li>小心吸除琼脂糖底部小的三维细胞培养物（第2天起肉眼可见）周围的旧培养基，以更换培养基。随后轻柔地向三维细胞培养物上方加入200 µl新鲜培养基。</li>
		<li>（可选步骤）在更换培养基过程中，可加入化疗药物或其他待测药物。将所选药物用完全培养基稀释至目标终浓度，并向每孔中加入相应的200 µl药液。</li>
		<li>通过光学显微镜监测三维细胞培养物的生长情况，直至其直径达到约1 mm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 收获三维细胞培养物
<ol>
	<li>使用 2 ml 血清学移液管轻轻将三维细胞培养物从琼脂糖基质中取出。</li>
	<li>用 PBS 清洗三维细胞培养物，轻轻将其移入置于 24 孔板中的约 1 ml PBS 中。</li>
	<li>通过血清学移液管将收获的三维细胞培养物转移至离心管中，用于蛋白质或代谢物提取；或将其包埋于切片介质中，以便进行成像切片。</li>
</ol>
5. 将三维细胞培养物包埋于明胶中
<ol>
	<li>在高纯度水（推荐使用18 MΩ）中配制浓度约为175 mg/ml的明胶溶液。22,23 充分搅拌明胶，观察到溶液逐渐变黏稠且难以操作。将含有明胶的锥形管置于约60 °C的水浴中加热，直至溶液变得澄清且易于吸取。 
	注意：温热的明胶溶液在冷却时会迅速凝固，因此在冷冻前需迅速完成以下所有步骤。</li>
	<li>加热后立即将明胶转移至细胞培养超净台。将装有明胶的离心管置于盛有约60 °C预热蒸馏水的烧杯中，以防止明胶溶液凝固。</li>
	<li>使用2 ml移液管，将0.6 ml温热的明胶溶液加入24孔平底板的一个孔中。此体积足以在孔底形成一层薄层。随后，使用另一支2 ml移液管，立即将3D细胞培养物轻柔地放置于明胶层上方，避免破坏3D结构。 
	注意：此步骤需特别小心，避免将PBS滴入明胶层中。若不慎发生，可用200 μl移液器将明胶表面的PBS吸除。</li>
	<li>将3D细胞培养物放置于明胶层表面后，再小心地用移液管加入0.6 ml温热的明胶溶液覆盖其上，注意不要扰动培养物的位置。第二层明胶加完后，将包埋有3D细胞培养物的明胶样品在-80 °C下冷冻。</li>
</ol>
6. 对明胶包埋的三维细胞培养物进行切片并解冻贴片，用于质谱成像
<ol>
	<li>从冷冻箱中取出含有3D细胞培养物的24孔板。用手掌温暖孔板底部，直至镊子或手术刀可轻轻沿孔壁滑入。</li>
	<li>平稳地滑入镊子或手术刀，使明胶块脱离孔壁，同时避免中心部分解冻。取一滴水滴于冷冻切片机载物台上，用其将明胶圆盘粘附于载物台。
	<ol>
		<li>包埋在明胶中的3D细胞培养物在-30 °C时最适于切片。使用前用70%乙醇清洁冷冻切片机的刀片和玻璃。每处理一个3D细胞培养-明胶圆盘，应使用刀片的不同部位或更换新刀片，以防止刀片变钝。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用冷冻切片机，轻轻修片去除多余的明胶，直至3D细胞培养物清晰可见。</li>
	<li>随后以平稳动作缓慢切片，将3D细胞培养物切成12–16 μm的切片。 
	注意：切片的关键因素包括玻璃与刀片之间的距离、刀片角度、冷冻切片机的温度以及载物台上圆盘的倾斜角度，因此必须逐一检查这些参数，以确保结果的一致性。</li>
	<li>小心地使切片自然解冻，并将其贴附于已正确标记的氧化铟锡（ITO）涂层玻片上，随后存放于干燥器中。为获得最佳质量，应尽快使用这些切片。</li>
</ol>
7. 基质应用与MALDI成像样品制备
<ol>
	<li>进行MALDI成像之前，需使用适当的基质对切片进行预处理。
	<ol>
		<li>对于小分子分析，通常无需洗涤步骤。对于完整蛋白质的检测，需将切片在冷的100%丙酮、Carnoy固定液或70%/95%异丙醇中洗涤，以去除可能掩盖信号的脂类等小分子物质。24–26</li>
		<li>每次洗涤时间不超过30秒，动作应轻柔，避免扰动任何切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将基质溶解于含0.1%三氟乙酸（TFA）的有机溶剂与水的混合溶液中。对于α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）等小分子，使用60%乙腈:40% H2O:0.1% TFA（10 mg/ml）溶液；对于芥子酸（30 mg/ml）等蛋白质检测，使用相同的溶剂体系。为获得芥子酸的最佳溶解度，应先将其溶于乙腈，再加入TFA:H2O溶液。其他基质可根据需要适当选用。 
	注意：基质可通过多种不同方法施加，但需注意某些基质（如阿魏酸）可能与明胶共结晶，导致样品无法使用。较小的晶体可产生更一致的质谱信号，有助于检测更多分子种类，并将差异归因于生物学差异而非基质效应。</li>
	<li>采用手动点样法施加基质。
	<ol>
		<li>使用细尖注射器将0.5 µl基质溶液点加至三维细胞培养切片上，并让基质自然结晶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者采用喷雾法。将市售喷雾器装入基质溶液。
	<ol>
		<li>将喷头距离载玻片8–12英寸，对准切片均匀喷雾。每次喷雾后，让基质干燥1分钟，以促进最佳晶体形成。通常需要喷雾10–20次才能形成理想的基质覆盖层22。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者采用其他文献中详述的升华法25,27</li>
	<li>无论采用何种基质施加方法，在进行MALDI-MSI前，均需将载玻片在干燥器中干燥至少30分钟25</li>
</ol>
8. 使用MALDI-TOF系统进行MALDI-MSI分析即，&#160;AutoFlex III
注意：本节包含针对基质辅助激光解吸电离飞行时间成像实验（MALDI-TOF成像实验）的参数设置说明与建议。根据所使用的仪器制造商和软件不同，具体操作流程可能有所差异。
<ol>
	<li>将载玻片放入专为稳固固定75 mm x 25 mm载玻片而设计的适配器中，以对附着在ITO涂层载玻片上的3D细胞培养切片进行成像。将载玻片适配器装入仪器中。</li>
	<li>通过选择适用于目标质荷比范围的适当校准标准品，对 MALDI-MSI 仪器进行准备。在小分子检测中，常使用与所用基质 α-CHCA 对应的信号作为一类常见的校准物。对于蛋白质分析，则应采用已知的蛋白质标准品即， 泛素、胰蛋白酶原）等在目标质量范围内的物质被选作校准物，并点样于3D细胞培养物附近。在进行方法开发之前，需对仪器进行校准。</li>
	<li>成像前，使用仪器制造商提供的软件，针对所选质量范围开发数据采集方法。参见 图1 和 2 用于小分子和蛋白质成像。对于小分子成像，使用反射模式以获得最高的质荷比分辨率。
	<ol>
		<li>将小分子数据采集的质量范围调整为100–1,000 m/z 分子量在8,000至25,000之间的蛋白质 m/z调整质量范围，以涵盖所选区域，同时尽可能提供仪器所能达到的最高质量分辨率。</li>
		<li>调节激光功率、频率、激光发射次数和光斑尺寸时，使用校准溶液和附近的一个“牺牲性”三维细胞培养切片进行优化。在主仪器控制软件中观察这些设置。以下参数可作为推荐的起始设置：60% 功率、400 次激光发射、超小光斑尺寸。这些参数会因仪器和方法的不同而有所差异，因此需优化各特定仪器的参数以获得最高质量的光谱。其他可调节的参数包括探测器增益、采样率和电子增益。将此方法保存，以便在成像软件中使用（即., FlexImaging 将调用的自动执行方法）。 
		注意：在仪器控制中找到并抑制低于目标质量范围的离子，以避免干扰检测。</li>
		<li>开发适用于目标质荷比范围的蛋白质数据采集方法。遵循上述相同步骤，但对于约3 kDa以上的中高质荷比范围，应使用线性模式。 
		注意：设置参数将不同于小分子方法所使用的参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用仪器制造商提供的成像软件（如 Bruker MALDI-TOF 系统的 FlexImaging）设置特定的质谱仪器参数。
	<ol>
		<li>创建新的成像文件和文件夹，使用先前开发并保存的方法。选择仪器参数，例如光栅点大小（将默认值约 200 µm 更改为 50 µm），设置仪器控制方法（在步骤 8.3.2 或 8.3.3 中设置），并确定在 3D 细胞培养物上的扫描位置。</li>
		<li>选择样品上三个合适的教学点，依次将激光移动至各点。使用“打印屏幕”功能，从MALDI-TOF激光控制软件中获取光学照片。 
		注意：许多成像软件需要样品的光学照片，以“教会”软件识别激光的位置，该照片可通过扫描仪或仪器自带的相机获取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>然后从成像软件（而非仪器控制软件）启动成像过程，并从每个切片采集质谱数据。观察在三维细胞培养物中广泛分布的多数质荷比信号，以及定位于特定区域的其他信号。</li>
</ol>
9. 可选的数据分析方法
<ol>
	<li>对于靶向分析，可通过点击平均谱图中的某个质荷比进行谱图的手动分析，或设置成像软件自动选取高于特定阈值的质荷比例如，高于前20%阈值的峰）。为进行质量控制，应检查基质峰的分布或平均谱图。</li>
	<li>使用 R 或 Matlab 等数学软件对提取的数据集进行统计分析。
	<ol>
		<li>以ASCII格式导出单个光谱，生成可读的文本文件，以便载入任意选定的软件中。</li>
		<li>将各个质谱数据转换为 ASCII、mzXML 或 mzML 格式，以便多种不同软件程序读取。28–31 或以 Analyze（.img）格式导出数据，该格式是 MRI 等其他成像应用中常用的格式。32 两种可用于分析的开源选项是 MSiReader 和 BioMap32,33.</li>
		<li>将文件导出为软件可读的格式后，按照相应软件的说明加载数据集。加载完成后，进行采集后的处理，例如基线校正和归一化。</li>
		<li>使用该数据集，通过自定义脚本或 MATLAB 等软件中的内置算法，进行主成分分析或层次聚类等统计处理18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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本文是布鲁克生物自旋公司赞助的多模态临床前成像专题特刊的一部分。用于获得代表性结果的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）系统为布鲁克AutoFlex III。

采用上述方法，可对3D细胞培养物进行培养并利用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）进行分析。许多永生化细胞系在适当培养条件下可形成3D结构9,10。培养时应避免使用传代次数过多的细胞，即应选择低代次细胞。通常，代次在十代及以下的细胞最适合用于培养3D细胞模型。在传统琼脂糖支撑体系中培养3D细胞，为有意尝试该系统的科研团队提供了一种经济有效的方法。该方法所用试剂大多为哺乳动物细胞培养实验室中已具备的组分。在制备琼脂糖板时需格外注意，以确保所形成的3D细胞培养物在大小和形状上保持一致；需特别关注的环节包括检查混合物中是否混入气泡，以及每个孔底部是否形成适当的弯月面。若弯月面未能正确形成，细胞可能生长为非球状结构或形成小团块。此外，必须注意避免将PBS加入含有类球体的明胶中。一旦发生此情况，应使用200 μl移液器将明胶表面的PBS移除。若成本不是限制因素，市面上已有超低吸附圆底培养板，可简化上述操作步骤。尽管其他组织包埋方法可能成本较高且不适用于质谱分析，但明胶包埋法已被证明既经济又具有广泛适用性。上述制备策略已针对3D细胞培养物进行了优化，以获得最高质量的数据。虽然明胶包埋法已被证实适用于质谱分析，但该过程会因共结晶现象而限制可用基质的种类。3D细胞培养物在冷冻后可长期稳定保存数月，前提是避免反复冻融。明胶在冷冻后会变得不透明，且3D细胞培养物颜色相近，因此建议在冷冻前记录3D细胞培养物的位置，以便后续切片操作。
制备样品时，基质可通过多种不同方法施加，但需注意某些基质可能与明胶共结晶，例如阿魏酸，导致样品无法使用。较小的基质晶体可产生更一致的质谱图。尽管手动点样是最简单的基质施加方法，但较大的溶剂体积可能导致晶体尺寸增大以及分析物显著迁移。
在质谱仪方面，基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）技术的进步已降低了开展分析所需的专门技术门槛。大多数系统上的数据采集与分析过程简便，即使是初学者也能从ITO涂层载玻片上获得高质量的信息。然而，仔细选择仪器参数至关重要，这些参数应在邻近的、不具备成像价值的三维细胞培养样本上进行优化，以获得高质量数据。例如，提高激光能量可能增强峰强度，而降低激光能量则可能改善空间分辨率并产生更对称的峰形。三维细胞培养样本在切片后应尽快使用，以确保最佳样品质量。若未妥善保存（如置于干燥器或-80 °C冰箱中），蛋白质信号可能在一周内出现降解，尤其是在高分子量区域（高于20 kDa）。由于需求不断增长，目前已开发出多种不同的质谱成像可视化软件，并向科研公众免费开放。大多数质谱成像仪器均已安装必要的软件，可用于可视化各仪器专用格式下的单一质荷比信号。这些软件可用于生成单个质荷比的图像并导出数据。大多数软件还支持对两个或多个目标质荷比信号进行叠加显示。此外，多种质谱成像数据查看工具可免费下载使用，例如MSiReader和BioMap32,33。所获得的质谱数据在采集后也可轻松进行后续处理，从而提取出更具价值的信息。
从药物到脂质再到蛋白质，上述系统能够快速获取数据，以评估目标分子在三维细胞培养结构中的分布情况。通过连续切片，可对三维细胞培养物的每一层进行二维成像，并将这些图像叠加，从而重建整个三维结构。本实验方案中的技术与注意事项，可为希望开展三维细胞培养的研究人员提供帮助，作为单层细胞培养与动物模型之间的有效过渡。一旦掌握，这些技术可应用于多种类型的三维细胞培养、组织及细胞培养物，使研究人员能够对所选的任意样本进行成像分析。

质谱成像（MSI）是一种强大的技术，可用于检测目标样品中各种分子物种的分布情况。研究人员已利用该技术对从完整动物到单个细胞的各种生物样本进行了成像1–4。与传统共聚焦显微镜需要开发额外荧光探针或组织学染色等仅能检测单一底物的技术相比，MSI 可在单次实验中同时成像数百种分析物5–7。此外，MSI 既可用于靶向分析，也可用于非靶向发现性研究，因此在研究化学物质分布重叠方面具有显著优势。本文介绍了三维多细胞培养物的小样本（直径约 1 mm）的培养、制备以及基质辅助激光解吸电离/解吸（MALDI）成像方法8–11。
三维细胞培养因其介于传统单层培养与体内环境之间的特性，而受到生物学领域的特别关注 体内 肿瘤。顾名思义，三维细胞培养是一种异质性细胞聚集体，其微环境中包含了许多在无血管小肿瘤结节中观察到的化学梯度，因此相较于单层细胞培养，它能更真实地模拟原位肿瘤环境。10 许多人类细胞系可以培养为三维（3D）细胞培养物，包括来源于结肠、乳腺、卵巢、前列腺、肾脏和肺组织的细胞系。10 三维细胞培养物在成像方面存在固有挑战，因其尺寸小于质谱成像中常用的许多样本，故需要精细的样品制备。7 然而，与动物模型相比，这些易于操作的模型系统具有成本较低、生长和分析时间更短的优势。因此，涉及三维细胞培养的研究可实现比传统动物实验更高的通量。12–14
上述所有优势使得三维细胞培养在生物研究中的应用日益广泛；相应地，迫切需要开发新的分析策略，以研究这些系统中分子的组成及其空间分布。12,15–21 本文的目标是描述质谱成像方法及样品制备技术在三维细胞培养中的应用与改进。

<table><tbody><tr><td>HCT116 细胞系</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-247</td><td>潜在危险，需小心操作</td></tr><tr><td>McCoy's 5A 培养基</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>无味明胶</td><td>Knox</td><td></td><td>大多数杂货店均有单份包装出售</td></tr><tr><td>ITO 涂层玻璃载片</td><td>Delta Technologies, Limited</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>芥子酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mm 重力供料双动式喷笔喷漆枪套件</td><td>RoyalMax Airbrush</td><td></td><td>Amazon.com 等网站提供多种选择</td></tr></tbody></table>

三维细胞培养模型质谱成像的样品制备策略

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

三维细胞培养是生物研究中颇具吸引力的模型。它们将细胞培养的灵活性和成本效益与部分组织的空间结构和分子复杂性相结合。例如，许多细胞系在适当的条件下能够形成三维结构 在 体外条件下，结肠癌细胞系形成三维细胞培养球体， 体外 无血管肿瘤结节的模拟物。尽管免疫组织化学和其他经典成像方法常用于监测特定分析物的分布，质谱成像则能够无偏倚地检测各类分子的分布情况。基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱成像最初是为分析来自人类或动物模型样本而开发的，本报告描述了对 体外 三维细胞培养，包括样品制备策略的改进。本文描述了通过基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MS）对三维细胞培养物进行培养、收获、切片、洗涤及分析的方法。以结肠癌三维细胞培养作为模型系统，本方案展示了利用MALDI-MSI在三维细胞培养体系中无偏倚地监测分析物的能力。

质谱成像（MSI）技术有望揭示三维细胞培养中多种不同的分子分布。利用上述方法，可对从小分子（图1）到大分子蛋白质（图2）在内的各类物质在整个培养体系中进行追踪。这些结果展示了使用免费工具MSiReader对单一离子进行可视化的效果32。研究者可借助可视化软件，针对感兴趣区域或整个扫描区域，对三维细胞培养中特定单一离子的分布进行分析。此外，大多数软件可自动可视化用户设定阈值以上的离子信号，有助于发现性研究。在获得单个离子分布图后，多数软件还支持图像叠加，以观察离子间的共定位情况。无论采用非靶向的发现模式还是靶向分析策略，质谱成像均是一种分析三维细胞培养体系的强大工具。
<img alt="在琼脂平板上以100 µm尺度观察微生物生长的显微图像，用于生物学研究。" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 三维细胞培养生长与切片的代表性结果。 左）结直肠HCT-116三维细胞培养结构在第14天收获前的完整光学图像。右）结直肠三维细胞培养物近赤道面切片的光学图像，该切片已解冻并贴附于ITO涂层载玻片上用于成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱数据；m/z 图谱和热图；离子分布分析。" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 三维细胞培养物赤道切面的小分子 MALDI-MSI 代表性结果。 上图）使用 α-CHCA 在低质量（小分子）范围内获得的平均质谱图。下图）单个质荷比的代表性图像：327.8 m/z 主要定位于三维细胞培养物内部，429.7 m/z 主要定位于三维细胞培养物边缘。虚线表示球状体的大致边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用 m/z 图谱进行质谱数据分析；热图显示离子分布。" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 三维细胞培养物赤道切面的 MALDI-MSI 蛋白质成像代表性结果。 上图）使用芥子酸在较高（蛋白质）质量范围内获得的平均质谱。下图）单个质荷比的代表性图像：10,871 m/z 主要定位于类球体边缘，而 12,184 m/z 更多定位于类球体内部。虚线表示类球体的大致边界。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

永生化癌细胞系可作为三维细胞培养物进行培养，这是生物研究中一种有价值的模型。本方案描述了三维细胞培养物的质谱成像方法，包括样品制备平台的改进。本方案的目的是指导用户制备适用于质谱成像分析的三维细胞培养物。

三维细胞培养是生物研究中颇具吸引力的模型。它们将细胞培养的灵活性和成本效益与……相结合

本实验的总体目标是制备三维细胞培养物，并通过质谱成像技术进行分析。首先构建三维细胞培养物，并使其生长至所需大小；第二步是收获三维细胞培养物并将其包埋于明胶中。接下来，使用冷冻切片机在负30摄氏度条件下对三维细胞培养物进行切片，并将其贴附到导电载玻片上。最后一步是利用MALDI质谱成像（MSI）仪器分析这些切片，并对检测到的分子进行分析。最终，通过质谱成像技术展示多种不同生物分子类别分析物在三维细胞培养物中分布变化的情况。与现有的质谱显微技术或自显影技术相比，该技术的主要优势在于，质谱成像能够在单次实验中无需抗体标记，即可实现对多种分析物（如蛋白质、脂质、药物及代谢物）的检测与定位。接下来由 Dorothy Alf Wheatcraft（Hamman 实验室的博士后研究员）和我本人，以及该实验室的研究生 Shin Li 演示该实验流程。在开始本实验之前，需在二维单层培养体系中培养合适的细胞系，例如 HCT116 结肠癌细胞系。随后，在 50 毫升锥形管中，将 0.19 克 aros 加入 10 毫升标准培养基中。通过轻柔混匀确保充分融合，然后使用多通道移液器吸取，在水浴中对琼脂进行20分钟的高压灭菌。将50微升琼脂培养基混合物加入平底96孔细胞培养板的60个中央孔中。由于培养板边缘周围孔的蒸发速率略高，因此向这些边缘孔中每孔加入200微升1×磷酸盐缓冲液，而非琼脂混合物。将 aros 混合物加入内孔后，将培养板放置一旁，冷却至约 37 摄氏度，然后再加入细胞。此时，向经 aros 包被的 96 孔板中加入 200 微升适当细胞悬液，覆盖培养板，并置于含 5% 二氧化碳、37 摄氏度的湿润培养箱中，以促进细胞生长。培养后，通过小心抽吸去除 aros 孔底部小规模三维细胞培养物周围的旧培养基，更换新鲜培养基。然后，将200 µL新鲜培养基轻柔地加入三维细胞培养物中。用高纯度水配制浓度约为175 mg/mL的明胶溶液。待溶液变得黏稠且难以操作后，剧烈搅拌明胶。将试管放入约 60 °C 的水浴中加热，直至溶液变得澄清且易于吸取。使用一支 2 mL 血清移液管，向 24 孔平底板的各孔中加入 0.6 mL 温热的明胶溶液。立即用另一支 2 mL 移液管将洗涤后的三维细胞培养物轻轻置于明胶层上方，以避免破坏三维结构。将细胞培养物置于明胶层表面后，小心地用移液管吸取另外0.6毫升温热的明胶混合液覆盖其上，注意不要扰动其位置。随后进行冷冻，将含有明胶的三维细胞培养物在负80摄氏度下保存。将含有细胞培养物的24孔板从冷冻环境中取出后，用手温热孔板底部，直至镊子可轻轻滑入孔的侧壁。随后，平稳地将镊子沿圆片周围滑动，使明胶脱离，同时避免中心部位解冻。在冷冻切片机载物台上滴加一滴水，将明胶圆片粘附于载物台上，然后放入冷冻切片机中冷冻。待修平多余明胶以暴露三维细胞培养物后，以平稳动作缓慢切片，厚度为 12 至 16 微米。切片解冻后，将其贴附于镀有氧化铟钛的玻璃载玻片上。标记载玻片后，将其置于干燥器中保存，以确保蛋白质的完整检测。用冷丙酮洗涤切片，以去除可能掩盖信号的小分子物质（如脂质）。在含有0.1%三氯乙酸的有机溶剂与水的混合溶液中配制基质。使用细尖注射器将0.5微升基质溶液点样至三维细胞培养切片上。待基质结晶后，在进行MALDI质谱成像（MSI）前，将载玻片置于干燥器中干燥至少30分钟。在此阶段进行分析时，将切片放入专为牢固固定 75 毫米 × 25 毫米载玻片而设计的适配器中，以对三维细胞培养切片进行成像。然后将载玻片适配器装入仪器中。在建立适当的数据采集方法后，将小分子数据采集的质荷比范围调整为 101–000，蛋白质的质荷比范围调整为 8,020–5,000。随后，使用校准溶液和附近的一块用于牺牲的三维细胞培养切片，调整激光功率、频率、激光脉冲次数和光斑尺寸。将该方法保存，以用于仪器制造商提供的成像软件。按照先前所述方法，针对所选质荷比范围建立蛋白质数据采集方法。然后使用成像软件设置特定的质谱仪器参数。在选定仪器参数并设置好仪器控制方法的位置后，确定扫描三维细胞培养物的区域。接下来，在样品上选择三个合适的教学点，并将激光移至每个点。随后，使用打印屏幕功能从 MALDI TOF 激光控制软件中获取光学照片。然后从成像软件启动成像过程，并对每个切片采集质谱以进行靶向分析。通过在平均谱图中点击某一质荷比峰，对谱图进行手动分析。最后，使用数学软件对提取的数据集进行统计分析。质谱成像技术有望揭示三维细胞培养中多种不同的分子分布。利用前述方法，可追踪从小分子到大分子蛋白质在内的各类物质在整个培养样本中的分布情况。观看本视频后，您应充分了解如何制备、切片并利用质谱成像技术分析三维细胞培养物。

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三维细胞培养模型质谱成像的样品制备策略

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