样品制备策略的3D细胞培养模型质谱成像

该程序的总体目标是制备三维细胞培养物并通过质谱成像进行分析。这是通过首先构建三维细胞培养物并让它们生长到所需的大小来实现的。第二步是收获三维细胞培养物并将其包埋在明胶中。

接下来，使用低温恒温器在零下 30 摄氏度下对三维细胞培养物进行切片，并将其安装在导电载玻片上。最后一步是使用 Maldi MSI 仪器分析切片并对检测到的分子进行分析。最终，质谱成像用于显示许多不同生物分子类别的分析物在三维细胞培养物中的分布变化。

与现有的质谱（如显微镜或自动射线照相）相比，该技术的主要优点是质谱成像允许在单个实验中检测和定位多种分析，例如蛋白质、脂质药物和代谢，而无需抗标记。演示该程序的将是 Dorothy Alf Wheat craft、我自己（博士后）和 Shin Li（来自 Hamman 实验室的研究生）在开始此程序之前，在二维单层培养物中培养和适当的细胞系，例如 HCT one 16 结肠癌细胞系。在此之后，在 50 毫升锥形管中将 0.19 克 aros 添加到 10 毫升标准培养基中。

确保通过温和混合掺入，然后使用多移液器吸液将 Agros 在水浴中高压灭菌 20 分钟。将 50 微升 Agros 培养基混合物放入平底 96 孔培养板的 60 个中心孔中。由于板外围边缘的孔在 200 微升 1 x 磷酸盐缓冲盐水中的蒸发速率略高，而不是这些边缘的 aros。

aros 混合物添加到内孔中后，将板放在一边冷却至约 37 摄氏度，然后再加入细胞。此时，在 200 微升 aros 包被的 96 孔板中加入适当的细胞溶液，覆盖板并置于 37 度细胞 CS 下含有 5% 二氧化碳的加湿培养箱中以促进细胞生长。孵育后，小心地从 aros 底部的小 3D 细胞培养物周围吸出旧培养基，更换培养基。

然后在 3D 细胞培养物上轻轻加入 200 μL 新鲜培养基。在高纯水中制备每毫升明胶约 175 毫克的溶液。在溶液变得粘稠且难以作后，用力混合明胶。

将试管置于约 60 摄氏度的水浴中，加热至溶液变清且易于吸出。使用 2 毫升血清移液管沉积物，将 0.6 毫升温热的明胶溶液放入 24 孔平底板的孔中。使用不同的 2 毫升移液器将洗涤后的三维细胞培养物立即放在明胶层的顶部，以避免三维结构破裂。

将细胞培养物置于明胶层表面后，小心地将另外 0.6 毫升温热的明胶混合物移液到它们上面，以免干扰它们的位置。在此冻结之后。明胶在零下 80 摄氏度下包埋三维细胞培养物。

从冰箱中取出含有细胞培养物的 24 孔板后，用手加热板底部，直到镊子可以轻轻地滑下孔的侧面。接下来顺利。用镊子在圆盘上滑动，在不解冻中心的情况下释放明胶。

在低温恒温器支架上滴一滴水，然后将明胶盘粘附到支架上。然后放入低温恒温器中冷冻。在面对多余的明胶以暴露三维细胞培养物后，以 12 至 16 微米的平滑运动缓慢切片。

切片解冻后，将它们安装在涂有氧化铟钛的载玻片上。标记载玻片后，将它们储存在干燥物中以进行完整蛋白质检测。用冷丙酮清洗切片，以去除可能掩盖信号的小分子，例如脂质。

在有机溶剂和含 0.1% 三氯乙酸的水溶液中制备基质。使用细尖注射器将 0.5 μL 基质溶液涂抹在三维细胞培养切片上。让基质结晶后，在 Maldi MSI 之前将玻片在干燥物中干燥至少 30 分钟。

此时进行分析，将载玻片安装在一个适配器中，以牢固地固定 75 毫米 x 25 毫米的载玻片，以对三维细胞培养切片进行成像。然后将载玻片适配器装入仪器中。开发适当的数据采集方法后，将小分子数据采集的质量范围调整在 101， 000 主电荷比之间，将蛋白质数据采集的质量范围调整在 8， 020 5， 000 主电荷比之间。

在此之后，使用校准溶液和附近的牺牲三维细胞培养切片调整激光功率、频率、激光射击次数和光斑大小。保存此方法，以便在仪器制造商提供的成像软件中使用。如前所述，为所选质量范围开发蛋白质数据采集方法。

然后使用成像软件设置特定的 MS 仪器参数。选择仪器参数并设置仪器控制方法位置后，扫描 3D 细胞培养物的位置。接下来，在样品上选择三个合适的示教点，将激光器移动到每个示教点。

反过来，使用打印屏幕从 maldi TOF 激光控制软件获取光学照片。然后从成像软件开始成像过程，并从每个切片中获取质谱以进行靶向分析。通过单击平均谱图中的质量数来执行谱图的手动分析。

最后，在数学软件中使用提取的数据集进行统计分析。质谱成像有可能揭示三维细胞培养物中的许多不同分子分布。使用前面描述的方法，可以在整个培养物中追踪从小分子到大蛋白质的物种。

观看此视频后，您应该对如何通过质谱成像制备、切片和分析 3D 细胞培养物有很好的了解。