Name: 平滑肌功能中分离出来的组织浴，应用药理学研究测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习使用离体组织浴系统测量大鼠主动脉平滑肌等长收缩的方法。该技术可评估受体功能、信号传导及药物对肌肉反应性的影响，为药理学研究提供可靠的实验数据。

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多年来，Watts 实验室以及 Marlene Cohen 博士和 Kathy Schenck 在二十多年前向我们传授了该检测方法。本教学模块的开发得到了 NIGMS R25GM074119 项目的支持 整合与系统药理学短期课程 2005年至2013年在密歇根州立大学校园内举行。

注意：本文所述所有操作步骤均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的指南进行。
1. 系统准备与设置
<ol>
	<li>配制5 L生理盐溶液（PSS），该体积适用于使用最多50 ml组织浴的组织收缩实验；PSS配方见表2。通过将组织浴数量乘以每个浴的体积，再乘以所需换液次数，计算所需的总体积。
	<ol>
		<li>参照表2配制PSS。将盐类溶解于约4 L水中。注意：建议使用HPLC一级水。</li>
		<li>向溶液中加入8 ml 1 M CaCl2溶液（若使用二水合盐，则为147 g/L），使终浓度为1.6 mM钙离子。</li>
		<li>加水定容PSS溶液至5 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开启循环恒温水浴，将组织浴系统预热至37 °C。关键步骤：系统的每个组件均为水套式设计，需确保各组件之间串联连接。水流方向至关重要——必须保证水从每个组件最低的接头流入，从最高的接头流出。</li>
	<li>开启数据采集系统。实验开始前至少15分钟打开张力传感器电源，使其温度达到平衡。 
	注意：大多数张力传感器采用对温度变化敏感的应变片，在通电初期会出现热漂移现象。</li>
	<li>启动数据采集软件，并确认与数据采集系统的连接。请按照制造商说明启用数据记录功能。</li>
	<li>在将组织放入组织浴之前以及开始记录数据之前，确保已完成张力传感器的校准；请遵循制造商提供的校准说明。</li>
	<li>将组织浴系统连接至95% O2 / 5% CO2医用级气体钢瓶，检查是否存在气体泄漏，然后对系统加压。</li>
	<li>用PSS填充组织浴储液器，并让溶液有足够时间达到最佳温度。启动系统，排除系统及管路中的所有气泡。</li>
	<li>检查组织浴曝气装置，确保溶液持续均匀曝气，以氧合PSS缓冲液，并通过布朗运动使实验过程中加入的药物在浴液中均匀分布。注意曝气/气泡不应引起组织移动，以免干扰数据记录；必要时应降低气体流速。 
	注意：此时组织浴和数据采集系统已准备就绪，可开始实验。</li>
</ol>
2. 组织制备
<ol>
	<li>最好在使用前立即从动物体内解剖组织，并直接放入PSS中。 
	注意：某些组织可在4 °C的PSS中保存过夜，但必须进行适当的对照实验，以验证长期保存后组织功能的完整性；参见第6节。</li>
	<li>本实验使用胸主动脉作为组织样本。</li>
	<li>根据机构指南对大鼠实施麻醉，并将大鼠仰卧位放置。通过脚趾夹捏法确认麻醉状态，并观察其对疼痛刺激的反射反应是否消失。 
	注意：本方案采用腹腔注射戊巴比妥钠（70 mg/kg）。各机构对啮齿类动物麻醉的指南可能有所不同。</li>
	<li>用剪刀沿肋笼底部的膈肌处做切口，造成气胸。然后将切口从肋笼底部延伸至胸骨并纵向剪开。</li>
	<li>移除或拨开覆盖在脊柱上方的器官，找到紧贴脊柱走行的主动脉。 
	注意：此步骤可提供清晰的操作视野，便于分离主动脉。</li>
	<li>切断主动脉与食管、肺等结构的所有连接，并在膈肌水平处垂直于脊柱剪断主动脉。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住主动脉，用剪刀从脊柱上分离主动脉。从靠近脊柱的下膈区域开始解剖，并向心脏方向推进。操作时务必格外小心，避免牵拉主动脉组织，以防造成损伤。</li>
	<li>立即将主动脉放入盛有PSS的预冷解剖皿中。 
	注意：将主动脉切成环状时，最好使用底部带有黑色硅胶基底的解剖皿。这种装置可固定穿管用的金属丝，从而在解剖过程中稳定主动脉。黑色背景可提供良好对比度，有助于解剖操作。使用穿管金属丝时应格外谨慎，避免金属丝过度摩擦血管腔内壁，以免损伤内皮细胞层。</li>
	<li>取一根金属丝，在一端弯成一个小的90°角，将弯角端插入硅胶基底以固定引导金属丝。将整段主动脉放入解剖皿中。</li>
	<li>用镊子夹住引导金属丝的末端，轻轻将其穿入主动脉腔内。</li>
	<li>用镊子辅助，将主动脉沿金属丝滑动推进。当引导金属丝的自由端露出时，轻柔地弯曲金属丝，并将其自由端插入解剖皿的硅胶基底中，以固定组织。</li>
	<li>使用小型精细剪刀和镊子，去除主动脉周围的脂肪组织及其他附属组织、血凝块等，直至胸主动脉呈现白色且略带纤维状外观。</li>
	<li>将清理干净的主动脉从金属丝上取下，用剪刀将其切成宽度约为3–5 mm的环状片段。</li>
	<li>手持一对组织钩中的一只，用镊子轻轻将一个主动脉环套在钩上。对第二只组织钩重复此操作。注意避免钩子相互缠绕；参见图3。</li>
	<li>检查每只组织钩是否连接了不同的丝线缝合线。确认其中一只钩上系有一个小的打结丝线环，可用于连接玻璃棒或不锈钢杆；另一只则连接一段10–4 cm长的缝合线，用于手动绑至力传感器；参见图3。 
	注意：主动脉固定于组织钩后，即可准备将其安装至组织浴槽中；参见图3。</li>
	<li>重复步骤2.14–2.15，将第二个主动脉环安装至第二个组织浴槽室中。</li>
</ol>
3. 组织置于浴槽中
<ol>
	<li>请注意，在此系统中，组织浴槽本身是固定的。此时，向组织浴槽中加入预热并通气的PSS，使溶液达到设定温度。</li>
	<li>使用丝线缝合线，将组织标本的一端钩子绑在不锈钢杆的凸钉上。将此端放入组织浴槽室中。将金属杆固定在铁架台上，并将另一端置于盛有PSS的染色皿中，以确保组织始终浸没在缓冲液中；参见图3。
	<ol>
		<li>将金属杆和组织放入组织浴槽室中，确保组织完全浸没在PSS中，且金属杆固定稳妥；参见图3。</li>
		<li>将另一根缝合线系在力传感器上，并确保组织与力传感器之间的缝合线留有适当松弛。 
		注意：该松弛部分将通过调节微米计来消除；参见图3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对第二个主动脉环和另一个组织浴槽室重复上述步骤。</li>
</ol>
4. 设置被动张力
注意：每种组织都有一个最佳长度（Lo），在此长度下平滑肌细胞的反应最为理想。对于每种待检测的组织类型，必须通过初步实验来确定达到该最佳长度所需的最优被动牵张张力。大鼠胸主动脉的最佳被动牵张张力为 4 g。
<ol>
	<li>使用千分尺/齿条齿轮装置将张力增加至 2 g，并等待组织达到平台期。一旦达到平台期，再增加 2 g 张力，并等待组织再次达到平台期。 
	注意：在主动脉环中，初始施加 2 g 张力并达到平台期后，组织应松弛至约 1.6 g。再次施加 2 g 张力将使组织张力升至约 3.6 g，随后组织会再次松弛，张力随之下降。因此，在总共施加 4 g 张力后，软件显示的张力值应约为 3.2 g。</li>
	<li>对第二个主动脉环及组织浴槽室重复上述步骤。</li>
</ol>
5. 平衡与药物制备
<ol>
	<li>施加被动张力后，使组织平衡60分钟。</li>
	<li>在平衡期间，每15-20分钟清洗组织一次。排空组织浴槽，并用来自预热储液器的PSS替换其中的PSS。 
	注意：在此期间，组织会逐渐松弛，表现为被动张力的降低。</li>
	<li>在此期间，准备实验所需药物，药物储备液的浓度应至少比浴槽中的终浓度高1,000倍，以便仅需加入少量药液即可达到目标浓度。</li>
</ol>
6. 初始挑战
<ol>
	<li>平衡期结束后，最后一次清洗组织，保存数据，并重新校准所有输入信号。</li>
	<li>选择一种能引起组织主动收缩的激动剂（即能够引发收缩反应的化合物）。 
	注意：在大鼠胸主动脉中，由于交感神经系统对组织的支配作用，动脉平滑肌会对α-肾上腺素受体激动剂产生主动收缩反应。然而，在肠道组织中，肾上腺素类激动剂会引起舒张，因此不适用。此时可选用乙酰胆碱（胆碱能受体激动剂）等受体激动剂。另一种替代方案是使用非受体激动剂，例如高钾（K）溶液作为首次刺激。在平滑肌中，高钾通过间接开放钙通道发挥作用，因此常被用作评估平滑肌完整性的通用指标。
	<ol>
		<li>通过向组织浴槽中加入10-5 M去氧肾上腺素进行首次刺激（又称“唤醒”刺激）。为在50 ml组织浴液中达到该浓度，需加入50 μl&#160;的10-2 M去氧肾上腺素溶液。 
		注意：将50 μl&#160;溶液加入50 ml生理盐溶液（PSS）中，相当于1/1,000的稀释倍数，因此终浓度比原液低1,000倍，即10-5 M。准确掌握体积并持续维持组织浴槽内的液体体积，对于确定药物终浓度至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向组织浴槽中加入10-5 M去氧肾上腺素，待收缩反应达到峰值并进入平台期（数据斜率为零时）为止。确保记录每一次实验事件，以便后续分析。</li>
	<li>平台期结束后，通过排空并重新注入新鲜PSS彻底清洗激动剂。同样需记录这些操作事件。 
	注意：经验法则是每次清洗可使浴槽中激动剂浓度降低10倍。尽管如此，可能需要进行3～4次以上的清洗，才能使组织恢复至平衡状态下的基础张力（张力）。</li>
	<li>在继续下一步操作前，让组织在基础张力下静置约10分钟。</li>
</ol>
7. 实验
注意：将向组织浴槽中加入α肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪，以使去氧肾上腺素（PE）的浓度-反应曲线发生右移；此现象为可观察到的拮抗作用。
<ol>
	<li>向其中一个浴液中加入溶剂（H2O）中溶解的哌唑嗪。向另一样品中加入适当浓度的哌唑嗪。在此实例中，加入 25 µl&#160;溶剂25 µl加入一个浴槽&#160;10 中的 1-5 M浓度的哌唑嗪加入另一侧，以达到5 x 10-9 5 nM 的浓度置于浴液中。 
	注意：尽管在此示例中添加溶剂看似不必要，但在使用其他可能具有血管活性的溶剂时，必须添加溶剂例如， DMSO、乙醇、醋酸盐）。即使缺乏证据表明某种溶剂具有血管活性，也应添加相应的溶剂对照。</li>
	<li>将溶剂/哌唑嗪保留在浴液中，组织不洗涤，持续1小时。
	<ol>
		<li>在组织平衡的同时，配制多种浓度的激动剂（PE）。浓度范围应足够宽，包括不引起反应的浓度（例如， 10-9 M PE）达到超过最大反应的浓度（例如， 10-4 M PE）。由于浓度-反应曲线本质上呈对数关系，需配制六种不同浓度的PE储备液（10-6-10-1 M）通过从10开始的连续稀释-1 M 储备液。确保每种浓度所需的体积略大于所有浴液所需总体积的三倍即 &#62;300 µl</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续添加激动剂，具体步骤如所述 表1. 
	注意：本实验将生成去氧肾上腺素（PE）的累积浓度-反应曲线；每次加药均需计入已加入浴液中的药物总量。持续加药直至收缩不再增强，或整个曲线达到平台期。
	<ol>
		<li>逐一添加每种药物浓度，直至达到组织阈值。</li>
		<li>若无变化，加入系列中的下一个浓度；参见 表2. 
		注意：这些试剂的添加时机取决于所使用的激动剂。例如，去甲肾上腺素和苯肾上腺素引起的收缩反应发展迅速，通常在数分钟内达到平台期。相比之下，内皮素-1 引起的收缩反应发展较慢，可能需要近 45 分钟才能达到平台期。在完成此类浓度-效应曲线构建后，只要满足以下两个条件，即可对组织进行其他实验：（1）该物质可被充分洗脱；（2）可证明组织恢复正常的收缩功能，且不受先前刺激的影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>务必在干预前和干预后立即保存数据（例如，唤醒或完整剂量反应曲线）。</li>
	<li>为每个组织浴槽/输入通道找到并设定组织的基线，这将有助于数据分析。</li>
	<li>设定基线后，找出每个浓度下的最大反应，并记录相对于基线的变化值。依次对各个浓度进行操作，并记录基线的偏移。</li>
	<li>绘制所得数据图，可使用任意作图软件。 
	注意：Graph Pad Prism 是为药理学家设计的软件，非常适合此处所述类型的实验。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

等长力测定作为研究工具已有150多年历史，但至今仍是可收缩组织中受体表征的典型技术2。该技术的优势在于其简单性和多功能性：通过记录在有或无拮抗剂存在下，激动剂浓度递增所引发的反应，可获得关于每种药物及其结合受体的大量药理学信息3-5。此类实验还可获取所用拮抗剂的竞争性与非竞争性特征、受体异质性以及药物非特异性效应等方面的信息6-8。因此，通过对这种离体组织浴实验进行简单的变量调整，即可相对完整地建立介导激动剂诱导肌肉收缩的受体的药理学谱型。
在激动作用方面，可在特定组织中计算并比较激动剂的相对效能（EMAX）和效价（EC50），并与同一组织中其他激动剂的反应进行比较1。在本实验中，大鼠胸主动脉在加入α1肾上腺素受体激动剂去氧肾上腺素（PE）并诱导收缩之前，先用溶剂或α1肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪（5 nM）孵育1小时。&#160; 图2展示了图1的修正结果。绿色曲线标出了PE所达到的最大收缩幅度（标记为max）、半最大收缩幅度（标记为½ max），并对应产生该反应的PE浓度。确定这些数值即为确定激动剂引起半最大（50%）反应时的有效浓度，即EC50值。
遗憾的是，仅使用激动剂依赖性参数来确定受体结合特性可能会比较复杂9。理想情况下，通过使用受体拮抗剂进行额外实验，可以计算出两个对定义药物与受体相互作用至关重要的参数：拮抗剂解离常数的负对数（-log10，pKB）以及引起浓度-反应曲线两倍右移所需摩尔浓度拮抗剂的负对数（-log10，pA2）10。KB 和 pA2 的实用性在于它们是不依赖于激动剂的数值，即使在不同组织之间也保持恒定11。根据图2中的数据，可利用以下公式并基于其他地方计算得到的 EC50 值来计算 pKB：
无哌唑嗪时的EC50&#160; = 2 × 10-8 M 
有哌唑嗪时的EC50 = 7 × 10-6 M
根据以下方程求解 KB： 
log (dr-1) = log [B] - log KB 
其中： 
[B] = 拮抗剂浓度，即 5 × 10-9 M。&#160; log (5 × 10-9 M) = -8.3 
dr = 存在拮抗剂时的 EC50 值与无拮抗剂时 EC50 值的剂量比。&#160; 若出现右移，则该值大于 1。因此： 
dr = 7 × 10-6 M / 2 × 10-8 M 或 700 × 10-8 M / 2 × 10-8 M = 700 / 2 = 350 
将 [B] 和 dr 代入方程： 
log (350-1) = -8 - log KB 
2.54 = -8 - log KB 
pKB = 10.54
该普拉唑嗪的数值与其作用于α1肾上腺素受体时获得的数值一致12,13，提示介导去氧肾上腺素引起收缩反应的肾上腺素受体为α1肾上腺素受体。&#160;
实验成功的关键在于多个步骤。组织在分离后必须始终保持在PSS中，以防止组织活性丧失。任何等长肌肉制备都存在一个最佳的长度-张力关系，可在对抗被动张力时产生最大主动张力14,15。在本实验方案所述的实验中，最佳被动张力是通过逐步增加0.5 g的被动张力并短暂观察组织反应预先确定的。组织初始应无张力，经过30分钟平衡后，用最大浓度的KCl（80 mM）进行刺激，以诱导产生主动张力。随后，组织经冲洗并恢复至基础张力水平。在基础张力维持15分钟后，再增加0.5 g被动张力，并重复此过程，直至增加被动张力不再引起主动张力的进一步升高，即达到平台期。在预实验中，已确定4 g总被动张力可使主动脉环产生最大主动张力，因此在平衡前即对组织环施加该总量的张力。操作上，建议在施加被动张力前先将张力归零，但也可在实验开始前的任何时间进行。在实验或分离过程中的任何阶段过度拉伸组织，都会对组织活性和实验结果产生负面影响。在将组织放入浴槽时尤其需要注意，因为此步骤最容易造成过度拉伸。为获得可重复的实验效果，必须保证足够的冲洗次数和持续时间。若在前一次刺激后过早进行第二次刺激，或在组织尚未恢复至基础张力时即再次刺激，将导致异常反应。若研究的是可逆性拮抗剂或抑制剂，则在加入激动剂前不应冲洗组织，以免降低抑制剂的浓度。
离体组织浴实验具有显著的优点和缺点。
缺点：组织在手术切除或将其放置于挂钩上时，可能会经历不同程度的损伤。由于内皮细胞是主动脉环的内层衬里，因此在将主动脉环放置于挂钩上时必须小心操作，以免损伤这一细胞层。不同组织在组织浴中保持活性的时间也可能明显不同，这一点需要事先确定；并非所有组织都具有相同的特性。此外，组织在一天中不同时段的反应性可能发生改变，因此每个实验都必须设置时间对照。一个典型的例子是豚鼠气管，在典型的8小时实验过程中，其最大收缩能力可提高100%。水溶性差的药物可能在生理盐溶液（PSS）中析出沉淀。最后，若激动剂存在受体脱敏现象，则累积性与非累积性加药方式可能导致不同的实验结果；血管紧张素II就是一种会迅速产生快速耐受性的药物。
优点：组织浴实验的主要优点之一是其实时性；实验过程中可以实时观察结果，快速得出结论并规划下一步操作，同时能够在实验过程中进行故障排查。一个实验通常只需一天即可完成。通常可以从一只动物身上获取多个组织样本，使该动物可作为自身的对照，从而增强实验的可靠性。此外，还可以将组织与其他因素隔离，以测试组织对药物的相对纯净反应。体外实验（如组织浴系统）相比体内实验还能减少药物用量。
本文所述的基本实验设计可进行广泛修改，以记录更多参数或引入其他外部刺激。例如，添加电极可用于对支配神经进行电场刺激16,17。通过增加温度或pH探针，还可测量温度和pH对收缩反应的影响18,19。类似地，可用N2部分或完全替代氧气，以评估缺氧诱导的效应。此外，本视频中使用的等长收缩力测量的基本原理，也可用于开发能够同时测量等长张力发展和细胞内钙变化的系统20。信号转导也易于研究，因为已有系统可在组织对刺激产生反应的过程中快速冷冻样品，从而通过生物化学方法验证信号转导通路系统的活性。
可用于完成此实验的设备种类极为繁多。该整套系统，无论是手工搭建还是自动化装置，均可从多家不同公司购买获得。本实验方案中所使用的组织浴槽和组织固定器均由密歇根州立大学校内机械加工车间手工吹制（浴槽）和手工制作（固定器）而成。

药理学领域使用离体组织浴系统已有150多年的历史。该系统的多功能性使全球科学家能够表征受体及其信号转导过程，这些知识构成了治疗数百万人疾病的疗法基础，这些疾病包括高血压、心力衰竭、糖尿病、胃肠道疾病、膀胱功能障碍、哮喘和吞咽障碍等。时至今日，离体组织浴仍然是药物开发和基础研究的重要组成部分，因为它能够使组织保持其原有的组织功能。在本JoVE课程中，将分享一个正式的实验方案，通过可视化和虚拟实验展示如何利用离体组织浴实验中测得的等长收缩数据进行受体表征。
该技术的主要优势在于组织保持活性并作为一个整体发挥功能，其生理反应（收缩或舒张）与体内实际情况相关。这是一种多种步骤的综合体现，包括药物-受体相互作用、信号转导、第二信使生成、平滑肌兴奋性的改变以及组织功能的变化。而其他技术仅能用于研究这些步骤中的各个单独环节（例如 药物亲和力的放射性配体结合、第二信使的测定），离体组织浴技术可实现对所有这些步骤的整合1另一个优点是，保持组织功能可以计算出在组织中更具意义的重要药理学参数 与 细胞环境；更接近所研究药物在整体生物体内的作用方式。

<table><tbody><tr><td>LabChart 软件</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab（4通道）&amp;nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge（4通道）</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>草种适配器电缆</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>草茎受力-位移传感器</td><td>格拉斯仪器公司</td><td>FT03</td><td>FT03</td></tr><tr><td>草类传感器电缆</td><td>Grass仪器公司</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC 至 BNC 电缆</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>组织浴槽</td><td>多个来源&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐溶液</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>编织丝线缝合线</td><td>哈佛仪器</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>解剖培养皿</td><td>手工制作，采用硅胶材质</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>软管夹</td><td>Cole-Parmer 仪器公司</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml 肌肉浴槽</td><td>埃伯哈特玻璃吹制</td><td>自定义</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 温育室</td><td>埃伯哈特玻璃吹制</td><td>自定义</td><td></td></tr><tr><td>气体分散管</td><td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>微米器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制支架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三叉夹</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>S型连接器</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>组织钩</td><td>手工自制</td><td>自定义</td><td></td></tr><tr><td>组织解剖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>徕卡体视显微镜 MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>体视显微镜光纤光源</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 玻璃</td></tr><tr><td>Sylgard 硅胶弹性体</td><td>道康宁</td><td></td><td>Sylgard 170 试剂盒</td></tr><tr><td>万纳斯剪刀</td><td>George Tiemann &amp;amp; 公司</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>碎片 &amp;夹持与固定镊子</td><td>George Tiemann &amp;amp; 公司</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

离体组织浴中平滑肌功能的测定——在药理学研究中的应用

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

离体组织浴实验是一种经典的药理学工具，用于评估多种收缩性组织中的浓度-反应关系。尽管该技术已应用超过100年，但其多功能性、操作简便性和可重复性使其至今仍是药理学家和生理学家不可或缺的研究手段。组织浴系统具有多种形状和规格，研究人员可利用其检测小至小鼠肠系膜动脉、大至猪回肠（甚至更大）的组织样本。离体组织浴实验的核心在于能够测量等长收缩随药物浓度变化的情况，并评估收缩性激动剂的效能和效价如何受到逐渐增加浓度的拮抗剂或抑制剂的影响。尽管该实验的基本原理相对稳定，但近年来的技术进步通过引入基于计算机的数据记录与分析软件，进一步提升了组织浴实验的灵活性。本视频将演示如何使用离体组织浴系统测量离体平滑肌（本例为大鼠胸主动脉环）的等长收缩，并展示该技术所能获得的研究信息类型。内容包括主动脉组织的解剖与制备、主动脉环在组织浴中的放置方法、实验前组织的适当平衡、组织活性检测、实验设计与实施，以及数据定量分析。主动脉环将连接至等长力传感器，所产生的信号将通过市售的专用于此类实验的模拟-数字转换器和桥式放大器进行采集。配套软件将用于实时显示实验过程并分析所采集的数据。

就激动作用而言，可在特定组织中计算并比较激动剂的相对效能（EMAX）和效价（EC50），并与同一组织中其他激动剂的反应进行比较1。在本实验中，将大鼠胸主动脉分别在加入α1肾上腺素受体激动剂去氧肾上腺素并诱导收缩之前，用溶剂或α1肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪（5 nM）孵育一小时（图1）。
图2展示了图1的修正结果。绿色曲线标出了苯肾上腺素（PE）引起的最大收缩（标记为max）、半最大收缩（标记为½最大收缩），并关联了引起该反应的PE浓度。确定这些数值即为确定激动剂引起半最大（50%）反应的有效浓度，即EC50值。本示例中通过图形法完成此过程。也可使用基于S形曲线的逻辑函数进行曲线拟合，并通过计算机软件计算EC50值。
在生成和解读这些结果时，使用激动剂的低浓度和高浓度来绘制浓度-反应曲线非常重要。如果缺乏足够的数据点以显示稳定的基线和最大平台期，则只能对EC50和EMAX进行估算。本示例中采用图形法完成分析。也可使用基于S形曲线的逻辑函数进行曲线拟合，并通过计算机软件计算EC50值。
<img alt="灌流室示意图、力传感器装置、液体循环、旋塞、气体流入控制。" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：组织浴槽示意图。 示意图展示一段组织环置于双层壁、水套控温的组织浴槽中。缓冲液的流入与流出由集成在浴槽底部的三通玻璃旋塞控制。O2/CO2通过一个带有垫圈密封的曝气器通入，以防止生理盐溶液（PSS）或气体泄漏。循环液入口位于出口下方，以确保适当的液体循环，并防止形成气泡，避免温度失控。
<img alt="大鼠胸主动脉剂量-反应曲线、去甲肾上腺素的对数浓度、哌唑嗪效应、比较分析图。" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：大鼠胸主动脉 + 内皮组织。 上图展示了四项独立实验（不同动物、由不同研究人员在不同实验条件下进行，以不同颜色表示），用于检测哌唑嗪（prazosin）对去甲肾上腺素（PE）诱导收缩反应的右移能力。结果显示，5 nM 哌唑嗪可使 PE 诱导的收缩曲线明显平行右移。
<img alt="大鼠胸主动脉反应；曲线图；张力 vs. 去甲肾上腺素[浓度对数]；不同处理；哌唑嗪效应；EC50。" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：大鼠胸主动脉（保留内皮）。 在无（溶剂对照）和有（哌唑嗪）拮抗剂条件下，去甲肾上腺素（PE）EC50 值的图形化估算结果。仅标出绿色线（C组）。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>盐</td>
			<td>分子量 (g/mol)</td>
			<td>5 升</td>
			<td>终浓度 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>               (克)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.45</td>
			<td>37.99</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl </td>
			<td>74.56</td>
			<td>1.75</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>1.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4•7H20</td>
			<td>246.5</td>
			<td>1.45</td>
			<td>1.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.21</td>
			<td>6.25</td>
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose </td>
			<td>180.16</td>
			<td>5</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>380</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：正常生理盐溶液（PSS）配方。 本实验所用碳酸氢盐缓冲PSS的成分。包括所有盐类的分子量，以及为达到所需浓度而加入5 L去离子水（dH2O）中的各成分用量。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>浴液中的浓度</td>
			<td>加入浴液的激动剂体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 10-9 M</td>
			<td>50 ml 1 x 10-6 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 10-9 M</td>
			<td>100 ml 1 x 10-6 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 10-8 M</td>
			<td>35 ml 1 x 10-5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 10-8 M </td>
			<td>100 ml 1 x 10-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 10-7 M</td>
			<td>35 ml 1 x 10-4 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 10-7 M</td>
			<td>100 ml 1 x 10-4 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 10-6 M</td>
			<td>35 ml 1 x 10-3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 10-6 M</td>
			<td>100 ml 1 x 10-3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 10-5 M</td>
			<td>35 ml 1 x 10-2 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 10-5 M</td>
			<td>100 ml 1 x 10-2 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 x 10-4 M</td>
			<td>35 ml 1 x 10-1 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：组织浴槽中添加的激动剂浓度。 为正确构建累积浓度-反应曲线，需向每个浴槽中加入的激动剂用量。通过逐步加入浓度递增的激动剂实现目标浴槽浓度。每次添加均需考虑浴槽中已存在的激动剂浓度。此方法可尽量减少因使用单一浓度激动剂而不断增加添加体积所导致的组织浴槽总体积增加。

本方案描述了使用离体组织浴系统和基于计算机的数据采集系统，对离体平滑肌标本进行等长收缩的测定方法。

离体组织浴实验是一种经典的药理学工具，用于评估多种收缩性组织中的浓度-反应关系。

本实验的总体目标是测量平滑肌张力。首先通过解剖和制备组织来完成这一目标，第二步是将组织安装到离体组织浴槽中。然后检测组织的活性，并进行等长收缩测量。最终，通过离体组织浴装置来检测受体功能、受体信号传导以及平滑肌反应性。总体而言，该技术的主要优势在于系统的灵活性、快速获得结果的能力，以及保持组织完整性的特点。该方法有助于回答任何使用药物干扰受体信号传导或平滑肌功能领域的关键科学问题。实验前需注意若干准备工作：必须通过开启循环加热水浴将组织浴槽系统预热至 37 摄氏度。水流必须从每个组件最低的带刺接头处流入，并从最高的带刺接头处流出。每个组件都必须连接妥当。力传感器应进行校准，并且必须在实验开始前至少提前15分钟通电，使其温度达到平衡状态。接下来，在连接气体时应检查是否存在泄漏，然后对系统加压。在用溶液填充系统后，务必进行预冲洗并去除所有气泡。还应测试组织浴槽的通气装置。良好的通气可有效分散药物，同时不会在实验开始前使组织状态失稳。解剖组织。在麻醉大鼠后，使用剪刀制造气胸。沿肋笼底部的膈肌进行剪切。然后从肋骨底部向胸骨方向剪开，并将组织一分为二。清除覆盖在脊柱上方的器官，以找到紧邻脊柱的主动脉。接着切断主动脉的所有连接，并在膈肌水平处垂直于脊柱横断主动脉。接下来，轻轻握住主动脉，从脊柱处分离主动脉。从靠近脊柱的膈肌下部开始，向心脏方向进行解剖。注意不要牵拉主动脉组织，以免对其造成即刻损伤。将主动脉置于含有PSS的解剖皿中。取一根金属丝，将其一端弯成一个小的90度角。将该弯角端固定在解剖皿的基座上。然后小心地将导丝穿入主动脉管腔，并将主动脉沿导丝滑动。当导丝的自由端变得可见时，轻轻弯曲导丝并将其推入基座，从而固定组织。现在使用小型Venus剪刀和镊子，去除血管周围脂肪组织及其他多余组织，直至胸主动脉呈现白色且略带纤维状。在清除多余组织后，小心地将洁净的主动脉从金属丝上取下。随后将主动脉切成宽度为3至5毫米的环状片段，完成此步骤。取一段主动脉环。已准备好两个带缝线的组织钩，用于将其固定在浴槽中。其中一个钩子应带有缝线，并在末端打一个小结形成环，以便固定在杆上。另一个钩子则需要一段长10至14厘米的缝线。打结时，小心地将一对组织钩连接到每个主动脉环上。注意避免组织钩缠绕在一起。接着，用固定在铁架台上的组织固定器将每块组织转移至盛有室温PSS的培养皿中。接下来，将打结的环套在杆的销钉上，并用缝合线的长端将组织提起。然后将杆放入腔室中，并确保杆固定稳妥。现在，将剩余钩子上的缝合线系到力传感器上。缝合线应留有足够的余量，以便通过微米计调节力传感器与组织之间的张力。对每个腔室中的每个环状组织重复此操作。现在，设定被动张力。使用千分尺将张力增加至2克，并等待组织上的张力停止上升。然后，再增加2克张力，并再次等待张力变化结束。至此完成。此时张力应约为 3.2 克。对每个腔室中的每个环状组织重复此操作。设置完所有被动张力后，让组织平衡 1 小时。在此期间，每15分钟更换一次PSS，并进行实验的其他准备工作，例如在平衡期结束时配制药物。最后一次清洗组织，保存数据并重置所有输入。然后按照文本方案中的详细步骤，进行初始刺激。务必在软件中记录这些操作。初始刺激后，张力变化将进入平台期。随后洗去刺激药物，使组织张力恢复至基线水平。让组织在此基础张力下静置约10分钟，现在将其中一个浴槽加入溶剂（本实验中为水），另一个不加。加入足量的哌唑嗪，使浴槽中浓度达到5纳摩尔。让组织浴槽孵育1小时，期间不进行洗涤。同时，沿对数曲线在较宽的浓度范围内修复酚林。一小时后，将苯林激动剂以递增的浓度依次加入浴液中，以生成累积浓度反应曲线。每次加药后，需等待组织反应达到平台期，再加入下一个浓度。持续添加试剂，直至组织张力不再发生变化，或整个反应曲线达到平台期。相反，胸主动脉在加入α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素并绘制累积收缩反应曲线之前，先在α1肾上腺素受体拮抗剂POZ sim中孵育一小时。仅含溶剂的对照组组织中苯肾上腺素的最大收缩和半最大收缩值以绿色标出。半最大效应值可确定药物的有效浓度。经雷珠素处理的组织的相同测量结果以黑色显示。观看本视频后，您应能够充分理解如何在离体组织浴中测定平滑肌功能。

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科研

JoVE Journal

Biology

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