基于发育毒性测定化学品安全筛选和系统生物学数据生成人类多能干细胞

该程序的总体目标是描述两种基于人胚胎干细胞和转录组研究的体外发育毒性测试系统。这是通过首先在小鼠胚胎成纤维细胞上培养人胚胎干细胞来实现的。第二步是让人类胚胎干细胞形成 Embry 小体，它们可以在其中产生所有三个胚层的细胞，或者将它们分化为神经外胚层祖细胞。

接下来，在分化过程中用不同浓度的目标化合物处理胚胎体或神经外胚层祖细胞。最后的步骤是评估细胞的活力并分离 RNA。最终，转录组微阵列分析用于显示与未处理的对照细胞相比，用目标化合物处理的细胞的 RNA 表达变化基于人类新离子干细胞和 DNA 宏区域，我们建立了一种体外方法，允许监测人类相关的发育毒性影响。

该方法可应用于制药和化工行业对潜在药物和环境毒物进行安全筛选。这种方法可以帮助回答发育毒性领域的关键问题，例如化学物质对非常早期的神经发育的影响。首先，在室温下解冻干细胞培养基补充剂，并将 100 毫升干细胞培养基加入 400 毫升基础干细胞培养基中。

接下来，在冰上解冻基底膜基质，然后将补充体积的基质加入 24 毫升冷藏 dmm 中。F 12 基础培养基，通过轻轻上下吹打混合溶液，然后将 2 毫升混合物加入 12 个单独的 6 厘米板中。将板在室温下孵育 1 小时，同时基质包被板。

然后去除培养基并加入 2 毫升干细胞培养基。接下来，从含有人胚胎的培养箱中取出四个汇合板。在立体镜下按照随附的 intext 方案中所述制备的小鼠胚胎 fiberblast 饲养层上生长的 H 9 细胞，使用 1 毫升移液器吸头并从板中去除分化的集落。

未分化的集落具有明确的边界，细胞紧凑，而分化的细胞开始从边界繁殖出来，它们的细胞体积更大。吸出培养基并用 4 ml PBS 洗涤细胞。然后用立体镜的 8 加入 2 毫升干细胞培养基。

26 号针头将菌落切成 6 到 9 块，每块，然后用 1 毫升移液器吸头刮擦团块。将切好的菌落轻轻收集在 50 mL Falcon 管中，并以 200 G 的浓度沉淀 5 分钟。接下来，吸出 snat 并将细胞重悬于 12 毫升干细胞培养基中。

将 20 微升细胞悬液放在载玻片上，并在显微镜下计数团块的数量。将悬浮液的浓度调整为每毫升 150 团，然后将 2 毫升悬浮液添加到每个 6 厘米的板中。来回和左右移动板以均匀分布细胞，然后每隔一天在细胞培养箱中孵育板。

小心更换培养基 去除分化的菌落后，向 Vbo 96 孔板的每个孔中加入 40 微升无菌 5% 嵌段共聚物溶液，并在室温下孵育 45 分钟。从培养箱中取出含有菌落的汇合板，并在立体显微镜下用 1 毫升移液器吸头挑选出任何分化的菌落。然后从板中吸出培养基，并用 4 毫升 PBS 轻轻洗涤细胞。

接下来，向每个板中加入 2 mL 随机分化培养基。使用传代工具将 H 9 个细胞集落切割成大小均匀的团块。用细胞刮刀刮擦团块，然后轻轻地将它们收集到 50 毫升 falcon 管离心机中。

菌落以 200 G 的浓度聚集 5 分钟，然后吸出 snat 并以每毫升 1000 团的浓度重悬细胞和随机分化培养基。接下来，从 V 形底部 96 孔板中吸出嵌段共聚物 在多通道移液器的帮助下，向每个孔中加入 100 微升菌落悬液，通过在 4 摄氏度下以 400 G 离心板 4 分钟，将团块聚集到 V 形孔的底部，然后使用更宽口径的 200 微升吸头将板放入培养箱中 4 天。从 96 孔板中取出胚胎体，并将它们放入无菌的 122 毫米方形板中。

接下来，使用 10 毫升无菌血清移液管将胚胎体从方板转移到 15 毫升猎鹰管中。让胚胎体静置两分钟，然后吸出 snat 并用 5 毫升 PBS 清洗胚胎体。同样，等待胚胎体稳定两分钟，然后吸出上清液。

这次将胚胎体重悬于 5 毫升随机分化培养基中。接下来，将胚胎体转移到 10 厘米的细菌板中，并额外添加 10 毫升的随机分化。中等。在 37 摄氏度和 5% CO 2 的水平振荡器上孵育板。

在 50 RPM 时，显示第 5 天、第 9 天和第 14 天的代表性胚胎体。每隔一天小心更换一次培养基，用新鲜的随机分化物替换所有 15 mL。中等。为了评估药物对分化的影响，请在第 5 天开始向培养基中加入药物，持续 10 天，如随附的文本方案所述。

使用无菌移液器，将胚胎体从 10 厘米板收集到 15 毫升猎鹰管中。让它们静置 2 分钟，然后吸出上清液。用 5 毫升 PBS 洗涤它们，然后将它们转移到不含核酸酶的 1.5 毫升试管中。

让它们稳定下来并吸出 snat 加注。将胚胎体悬浮在一毫升三醇试剂中，并将溶液用 1 毫升注射器通过 24 号针头约 15 次以破坏细胞。接下来，向每个样品中加入 200 微升氯仿。

短暂涡旋内容物，然后将样品以 12， 000 G 离心 15 分钟在 4 摄氏度下，将上清液收集在 1.5 毫升试管中，不要干扰任何其他层。然后向上清液中加入等体积的冷冻 70% 乙醇，摇动轻轻混合内容物。将 700 μL 混合物转移到迷你离心柱中，并按照制造商的说明在最后的洗脱步骤中纯化 RNA。

离心柱上加入 22 μL 不含核酸酶的水，并以 12， 000 G 离心试管 1 分钟。然后取出收集管并将 RNA 放在冰上。每个 H 9 细胞汇合的 T 25 培养瓶添加 1 mL 预热的圆盘空间，并在 37 摄氏度下孵育培养瓶 9 分钟。

然后加入 2 毫升 prewarm。将培养基洗涤至移位的处理细胞中，然后用 5 毫升移液器轻轻上下移液五次。将细胞溶液转移到 falcon 管中。

接下来，用 9 ml 洗涤培养基洗涤培养瓶，并将其加入装有细胞的试管中。PT 以 500 G 的浓度收获其细胞 3 分半钟，然后去除 snat 并将细胞重悬于 10 mL 洗涤培养基中。以 500 G 的浓度再次对细胞进行 3 分半钟的 PT，然后去除 sup natant，将细胞重悬于 4 mL 人胚胎干细胞培养基中，将 0.5 mL 细胞悬液和 4.5 mL新鲜培养基加入含有有丝分裂灭活小鼠胚胎成纤维细胞的新鲜 PBS 洗涤 T 25 培养瓶中。

每天更换培养瓶中的培养基。在 10 厘米长的培养皿中涂上 0.1% 明胶的 PBS 溶液，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。然后通过去除培养基收获人胚胎干细胞，并在细胞分离时向 T 25 培养瓶中加入 1 毫升 acuta。

将 6.6 毫升冷培养基添加到 330 微升冷冻基底膜基质中。通过 40 微米的细胞过滤器过滤溶液，并使用 1 毫升过滤后的溶液覆盖 6 孔板的每个孔。在人胚胎细胞与 Accutane 孵育 30 分钟后，将细胞接种在包被的板上，加入 1.5 毫升 Hess 培养基终止反应。

从培养瓶中刮出细胞，然后再加入 8 mL 的 Hess 培养基。用 10 mL 移液器通过 40 μm 细胞过滤器轻轻上下吹打过滤细胞，制备单细胞溶液，然后将细胞离心 3 分钟在 500 G 下，去除 S 上清液，再次将细胞重悬于 10 mL培养基离心细胞中，以 500 G 离心 3 分钟，然后去除上清液和reus。将细胞悬浮在 10 毫升含有岩石抑制剂 Y 2 7 6 3 2 的 Hess S 培养基中，终浓度为 10 微摩尔。

接下来，从明胶涂层培养皿板中取出上清液，将细胞悬液放在明胶涂层培养皿上，并在 37 摄氏度下孵育整整 1 小时。在此步骤中，原生质体将沉淀在明胶涂层板上，在那里人类胚胎干细胞将保持自由。漂浮时间至关重要，因为长时间孵育会导致干细胞聚集，而短孵育只会在成纤维细胞附着时去除少数这些成纤维细胞。

使用板中的培养基轻轻洗掉板中的非贴壁干细胞。用 10 mL Hess 培养基第二次洗涤板并混合细胞，以 500 G 离心细胞 3 分钟，去除所得 S 上清液，并将细胞重悬于约 4 mL 的条件培养基中，该培养基含有 10 微摩尔的岩石抑制剂 Y 2、7、6、3、2 和 10 ng/mL 成纤维细胞生长因子 2。接下来，将细胞与 trian blue 混合，并在血细胞计数器板中计数。

底前板每平方厘米 18， 000 个细胞。膜包被板每孔用 1.5 mL 培养基覆盖细胞，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。24 小时后，刷新培养基 再过 24 小时后，将培养基更换为每毫升仅补充 10 纳克成纤维细胞生长因子的新鲜条件培养基 2 72 小时。

接种细胞后，将培养基更换为 Knockout 血清替代培养基。此时间点称为分化的第 0 天。在接下来的三天内，每天用新鲜培养基刷新细胞。

在第 4 天和第 5 天更换培养基时，添加由 25%N 组成的两种补充培养基和 75% 敲除血清替代物。培养基：第 6 天收获细胞进行分析。胚胎体可用于许多不同的研究。

这是一个细胞毒性研究示例，显示了不同浓度的甲基汞对细胞活力的影响。从该图中可以确定，暴露 14 天后，24 微摩尔点导致 10% 细胞死亡，1.61 微摩尔浓度导致 50% 细胞死亡。从三个甲基汞处理组的胚胎体中分离的 RNA 在微阵列上运行，以观察各种生物标志物。

暴露于 25 微摩尔汞的矿床以红色显示。暴露于一微摩尔甲基汞的 RNA 显示为蓝色，对照 RNA 显示为绿色。该主成分分析图显示，每个处理组的遗传特征都与其他处理组显著不同，当暴露于一种微摩尔浓度的甲基汞时，超过 276 个基因被修饰了两倍以上。

其中 30 个基因也在 25 微摩尔点被较低浓度组修饰。在此热图上，可以看到在单微摩尔处理组中修饰的基因中有 233 个是下调的基因，只有 43 个基因被处理上调。不要忘记，与三唑或发育蚂蚁一起工作可能非常危险，在执行此程序时应始终考虑预防措施，例如佩戴护目镜、耐化学腐蚀手套以及在通风橱中执行所有与三醇相关的工作。

遵循此过程。可以执行其他方法，如染色、feros 形成，这可能会混合您的管形成，以回答其他问题，例如表型锚定。