Name: 基于发育毒性测定化学品安全筛选和系统生物学数据生成人类多能干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 28 s
Description: 了解基于人类多能干细胞和转录组分析的体外发育毒性检测系统。该方法利用人胚胎干细胞培养、类胚体形成及神经外胚层祖细胞分化，结合化合物处理和RNA微阵列分析，为化学品安全筛选提供人类相关数据，有助于减少动物实验并预测发育毒性风险。

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感谢 M. Kapitza、Margit Henry、Tamara Rotshteyn、Susan Rohani 和 Cornelia Böttinger 提供出色的技术支持。本工作得到了德国研究基金会（RTG 1331）和德国联邦教研部（BMBF）资助项目的资助。

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<li>Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: 
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<li>Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: 
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<li>Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: 
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<li>ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: 
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作者无任何利益冲突需要披露。

传统的毒理学检测方法依赖于大量的动物实验，导致检测成本高昂且耗时。此外，由于物种间的差异，临床前动物安全性研究并不总能有效预测潜在药物对人体的毒性效应。尽管非人灵长类动物的预测性最强，但现代社会对开发灵敏且可靠的检测方法提出了日益强烈的伦理和社会经济要求 体外 测试 与人类安全相关的系统
人类胚胎干细胞（hESCs）具有分化为所有体细胞类型的独特能力，从而重现 体内 将人类发育过程与敏感的毒物基因组学方法相结合，已被提议作为传统药物安全性测试方法的替代方案6,21在“ESNATS”项目下，已开发出“UKK”测试系统，用于基于转录组学谱预测胚胎发育毒性。在该系统中，人胚胎干细胞（hESC）被诱导分化为类胚体，持续14天。获得的时间动力学转录组谱显示，在第14天，外胚层、内胚层和中胚层这三种胚层特异性分化标志物均呈现高表达，部分重现了早期人类胚胎发育过程。基于这些结果，已知的致畸药物在14天分化过程中被施加处理，并获得了差异表达基因谱。令人印象深刻的是，该测试系统能够预测人类中观察到的沙利度胺致畸效应相关的基因...

人类胚胎干细胞（hESC）能够分化为多种类型细胞的能力开启了一个新时代 体外 毒性测试1疾病建模与再生医学2干细胞具有自我复制、维持其多能状态以及分化为特化细胞的能力。3,4人类胚胎干细胞（hESC）具有分化为所有主要细胞类型的潜能，这一特性也存在于其他人类多能干细胞中，例如人类诱导多能干细胞（hiPSC）或通过核移植技术获得的细胞。5例如，许多不同的人胚胎干细胞系已被分化为神经元6，肾细胞7，神经嵴细胞8心肌细胞9-12或类似肝细胞的细胞13,14此外，人胚胎干细胞（hESC）可自发分化为三个胚层的各种细胞15-18 在类胚体（EBs）中19,20早期胚胎发育受到与不同胚层相关基因差异表达的调控，这种差异表达已通过微阵列技术的转录组学在mRNA水平上得到检测。15这些努力促成了基于人胚胎干细胞/人诱导多能干细胞及转录组学分析的器官特异性毒理学模型的建立（综述见 21,22）。这些模型相较于传统毒理学研究中使用的实验动物具有优势，因为利用实验动物进行的临床前研究并不总能准确预测药物对人体的安全性。在患者中观察到的药物诱导毒性通常与人类和实验动物之间不同的代谢或信号传导过程相关。物种差异导致难以可靠地早期检测出对人体的发育毒性，例如沙利度胺等药物23,24 和己烯雌酚25,26 由于致畸性而被撤出市场。沙利度胺在大鼠或小鼠中未表现出任何发育毒性。环境化学物质如甲基汞27 在多种物种中导致神经系统方面的产前发育毒性，但人类的相关表现难以在动物模型中复制。为解决物种特异性问题，来自ReProTect、ESNATS、DETECTIVE等不同干细胞相关项目的科研人员 等等。 正在利用疑似对人类产生影响的人源毒性物质，开发针对胚胎毒性、神经毒性、心脏毒性、肝毒性和肾毒性的不同模型。在欧洲联合项目“基于胚胎干细胞的新型替代测试策略（ESNATS）”中，已建立了五种测试系统。其中一种测试系统即所谓的 UKK（Universitätsk临床医学中心 Köln）测试系统部分模拟了人类早期胚胎发育过程。在该系统中，人类胚胎H9细胞被分化为三个胚层（外胚层、内胚层和中胚层）。15 并通过Affymetrix芯片平台的转录组学分析捕获了胚层特异性特征。多种发育毒性物质，如沙利度胺28，丙戊酸，甲基汞16,17或阿糖胞苷15 在此系统中已进行测试，并获得了特定毒物的基因表达特征。在第二种测试系统中，即所谓的 UKN1（U大学 Konstanz) 测试系统1中，H9细胞分化为神经外胚层前体细胞（NEP）持续6天。这由神经基因标志物的高表达所证实，例如 PAX6 和 OTX2 在为期6天的分化过程中，NEP细胞暴露于VPA、甲基汞等发育性神经毒物。通过Affymetrix微阵列平台，已获得由不同毒物特异性诱导的转录组学表达谱紊乱特征。16,29.
21世纪毒理学的新愿景st 世纪以来，人们设想测试系统不仅能够提供组织病理学等表型描述 体内，或长期毒物孵育结束时的转录组变化。相反，这表明检测方法能够提供机制性信息3，并且这些信息可以映射到所谓的不良结局通路（AOP），为有害效应提供科学依据30. 为了提供此类信息，所采用的检测系统必须经过严格的质量控制31，例如通过完善的标准化操作程序所记录的那样。此外，还需要以高分辨率绘制出随时间变化的动态过程。这要求测试系统具备同步变化的能力32文中所述的UKN1和UKK测试系统已针对这些要求进行了优化。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td>杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>无血清替代物</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>GlutaMAX 添加剂</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-0144</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液，不含钙，不含镁</td></tr><tr><td>mTeSR 培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>V 型底板</td><td>VWR</td><td>734-0483</td><td>微孔板，V 型底，96 孔，无菌，1 * 50 ST</td></tr><tr><td>V 型底板盖</td><td>VWR</td><td>634-0011</td><td>微孔板盖，带冷凝环，1 * 50 ST</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>青霉素-链霉素溶液，液体</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089.</td><td>无菌蒸馏水</td></tr><tr><td>人 FGF-2 (bFGF)</td><td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>碱性成纤维细胞生长因子，人重组型，无动物成分</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>Stericup-GP，0.22 &amp;mu;m，聚醚砜膜，250 ml，辐射灭菌</td></tr><tr><td>StemPro EZPassage&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 一次性工具</td><td>Invitrogen</td><td>23181010</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM，适用于 hESC 的基质</td><td>Stemcell Technologies</td><td>354277</td><td>5 ml 小瓶</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>RNA later 稳定溶液</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td>可稳定并保护未冷冻样品中的 RNA 完整性</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>带 70 &amp;mu;m 尼龙网的细胞筛</td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m 筛盖，5&amp;nbsp;ml 管</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛盖（35&amp;nbsp;&amp;mu;m）</td></tr><tr><td>50 ml 无菌聚丙烯管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50 ml 聚丙烯锥底管，无菌</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>CELLSTAR 带滤膜盖细胞培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>10296010</td><td></td></tr><tr><td>96 孔光学底板</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>分散酶（Dispase）</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS002104</td><td></td></tr><tr><td>背维素（Dorsomorphin）</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>明胶（Gelatine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R&amp;D Systems</td><td>719-NG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>孕酮（Progesteron）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>腐胺（Putrescine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>硒（Selenium）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂盒列表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 杂交、洗涤和染色试剂盒</td><td>Affymetrix</td><td>900721, 22, 23</td><td>该试剂盒提供微阵列杂交、洗涤和染色所需的所有试剂</td></tr><tr><td>无 RNase 的 DNase 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备列表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX71</td></tr><tr><td>Genechip 杂交炉 - 645</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genechip 流体工作站-450</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix Gene-Chip 扫描仪-3000-7 G</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M5</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;#160;&lt;br /&gt;&amp;#160;&lt;br /&gt;&amp;#160;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;软件列表&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Prism 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GCOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partek Genomic Suite 6.25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>功能注释在线工具&lt;br/&gt; DAVID&lt;br/&gt; Onto-tools 智能系统与生物信息学实验室</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

高效地将人类多能干细胞分化为各种组织的方案，结合组学技术，为 体外 潜在药物的毒性测试。为了为这类检测提供坚实的科学基础，通过系统生物学方法获取发育过程的时间动态及其潜在调控机制的定量信息至关重要。因此，本文针对这些需求优化了两种检测方法。在UKK测试系统中，人胚胎干细胞（hESC）（或其他多能干细胞）在类胚体中自发分化14天，以生成三个胚层来源的细胞。该系统可重现人类早期胚胎发育的关键阶段，若在分化过程中暴露于化学物质，则可预测人类特异性的早期胚胎毒性/致畸性。UKN1测试系统基于hESC向神经外胚层前体（NEP）细胞群体分化6天的过程，可模拟早期神经发育，并预测化学物质引发的早期发育神经毒性和表观遗传改变。这两种系统结合转录组微阵列研究，均适用于毒性生物标志物的鉴定。此外，它们可联合使用，为系统生物学分析提供输入数据。相较于依赖大量实验动物的传统毒理学研究，这些检测系统具有显著优势，有助于降低药物研发和化学品安全性评价的成本。两者的联合应用尤其有助于揭示可能特异性影响神经发育的化合物的作用机制。

UKK测试系统中甲基汞暴露
采用H9胚胎体（EBs）进行细胞毒性检测，以获得甲基汞毒性的IC10值（细胞活力降低10%）（图1）。我们还开展了基于微阵列（Affymetrix平台）的生物标志物研究。将H9胚胎体暴露于甲基汞（0.25 和 1 µM）中持续14天。在第14天，使用TRIzol收集样品并提取RNA。采用人类全基因组U133 Plus 2.0芯片进行转录谱分析。数据分析使用Partek Genomic SuiteTM 6.6软件完成。通过主成分分析（图2A）、维恩图生成（图2B）和热图构建（图2C）获得初步数据概览。主成分分析反映了基因表达的整体分布情况，清晰地显示了1 µM甲基汞组与溶剂对照组及0.25 µM甲基汞组之间的分离（PC # 25.2）（图2A）。经过统计学处理（单因素方差分析）并对数据进行筛选（变化倍数阈值为±2，经多重校正的Benjamini-...

本方案描述了两种 体外 基于人类胚胎干细胞和转录组研究的发育毒性测试系统（UKK 和 UKN1）。这些测试系统可预测人类发育毒性的危害，有助于减少动物实验、降低成本以及化学安全性测试所需的时间。

高效的人类多能干细胞向多种组织分化的实验方案，结合组学技术，为体外...

本实验的总体目标是描述两种基于人胚胎干细胞和转录组研究的体外发育毒性检测系统。首先，在小鼠胚胎成纤维细胞上培养人胚胎干细胞。第二步是使人胚胎干细胞形成拟胚体，从而生成三个胚层的所有细胞类型，或将其分化为神经外胚层前体细胞。接下来，在分化过程中，将类胚体或神经外胚层前体细胞用不同浓度的待测化合物进行处理。最后步骤是评估细胞的活力并分离RNA。最终通过转录组微阵列分析，比较经待测化合物处理的细胞与未处理对照细胞之间的RNA表达变化。基于人神经干细胞和DNA宏阵列，我们已建立一种体外方法，可用于监测与人类相关的发育毒性效应。该方法可由制药和化学工业用于潜在药物及环境毒物的安全性筛选。此方法有助于回答发育毒性领域中的关键问题，例如化学物质对早期神经发育的影响。首先，在室温下解冻干细胞培养基添加剂，并将100毫升该添加剂加入400毫升基础干细胞培养基中。接下来，将基底膜基质置于冰上解冻，然后按照制造商的建议，将补充体积的基质加入24毫升预冷的DMEM/F12基础培养基中，通过轻轻吹打混匀制成溶液，再将2毫升该混合液分别加入12个独立的6厘米培养皿中。在基质包被培养皿期间，于室温下孵育1小时。然后吸去培养基，并加入两毫升干细胞培养基。接着，从培养箱中取出四块已长满的人胚胎H九细胞培养板，这些细胞是在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的，饲养层的制备方法见文中配套的实验方案。在体视显微镜下，使用1毫升移液器吸头去除培养板上的分化克隆。未分化的克隆具有清晰的边界，细胞紧凑；而分化的细胞则开始从边界向外扩散，且细胞体积较大。吸除培养基，用四毫升 PBS 洗涤细胞。然后加入两毫升干细胞培养基，并使用体视显微镜的八倍镜。用26号针头将菌落切成六至九块，并用1毫升移液器枪头刮取菌团。将切碎的菌落轻柔收集至50毫升离心管中，在200 ×g下离心5分钟以沉淀细胞。随后，吸除上清液，并将细胞重悬于12毫升干细胞培养基中。取20微升细胞悬液置于玻片上，在显微镜下计数团块数量。将悬液浓度调整至每毫升150个团块，然后向每个6厘米培养皿中加入2毫升悬液。前后左右轻轻晃动培养皿以均匀分布细胞，随后将培养皿置于细胞培养箱中，每隔一天进行一次培养。小心更换培养基。去除分化集落之后，向 Vbo 96 孔板的每孔中加入 40 微升无菌的 5% 嵌段共聚物溶液，在室温下孵育 45 分钟。从培养箱中取出长满集落的融合培养板，在体视显微镜下用 1 毫升移液器吸头挑除任何已分化的集落。然后吸去培养板中的培养基，并用 4 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞。接下来，向每块培养板中加入两毫升随机分化培养基。使用传代工具将 H nine 细胞集落切割成大小均匀的团块。用细胞刮刀轻轻刮取这些团块，并将其小心收集至一个 50 毫升离心管中。在200 ×g条件下离心5分钟使细胞团沉淀，弃去上清液，将细胞重悬于随机分化培养基中，调整浓度为每毫升含1000个细胞团。接着，用多通道移液器将100 µL细胞悬液加入已去除嵌段共聚物的V型底96孔板的各孔中，通过在4°C、400 ×g条件下离心4分钟，使细胞团聚集于V型孔底部。然后将培养板置于培养箱中培养4天，使用孔径较大的200 µL吸头进行操作。将类胚体从96孔板中取出，转移至无菌的122毫米方形培养皿中。接下来，使用一支10毫升无菌刻度吸管将方盘中的胚胎团块转移至15毫升离心管中。静置2分钟使胚胎团块沉降，然后吸除上清液，并用5毫升PBS洗涤胚胎团块。再次静置2分钟使胚胎团块沉降，随后吸除上清液。将胚胎体重新悬浮于5毫升随机分化培养基中。随后，将胚胎体转移至10厘米的细菌培养皿中，并额外加入10毫升随机分化培养基。将培养皿置于37摄氏度、5% CO2条件下，在水平摇床上孵育。在50 RPM的转速下，分别显示第5天、第9天和第14天的代表性类胚体。每隔一天小心更换培养基，将全部15毫升替换为新鲜的随机分化培养基。如随附文字方案所述，为评估药物对分化的影响，从第5天开始在培养基中加入药物，持续10天。使用无菌移液管将10厘米培养皿中的胚胎体收集到15毫升离心管中。静置2分钟使其沉降，然后吸除上清液。用5毫升PBS洗涤，并转移至无核酸酶的1.5毫升离心管中。静置后吸取上清液。将胚胎体悬浮于1毫升三醇试剂中，并使用1毫升注射器通过24号针头反复吹打约15次，以充分裂解细胞。随后，向每个样品中加入200微升氯仿。短暂涡旋混匀内容物，然后在4°C条件下以12,000 G离心15分钟，收集上清液至1.5毫升离心管中，注意不要扰动其他任何层。随后向上清液中加入等体积预冷的70%乙醇，通过轻轻振荡温和混匀。将700微升混合液转移至微型离心柱中，并按照制造商说明书操作，完成RNA的纯化及最终洗脱步骤。向离心柱中加入22微升无核酸酶水，在12,000 G离心1分钟。然后移除收集管，将RNA置于冰上。每25 cm²长满H九细胞的培养瓶中加入1毫升预热的消化液，于37摄氏度孵育9分钟。然后向已处理的细胞中加入2 mL预热的洗涤培养基，用5 mL移液管轻轻吹打5次。将细胞悬液转移至Falcon管中。接着，用9毫升洗涤液洗涤培养瓶，并将洗涤液加入含有细胞的离心管中。在500 ×g条件下离心3.5分钟收集细胞。然后弃去上清液，将细胞重悬于10毫升洗涤液中。再次在500 ×g条件下离心3.5分钟，弃去上清液后将细胞重悬于4毫升人胚胎干细胞培养基中。取0.5毫升细胞悬液与4.5毫升新鲜培养基混合，加入至一个预先用PBS洗涤过的、含有经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞的T25培养瓶中。每天更换烧瓶中的培养基。用含0.1%明胶的PBS溶液包被一个10厘米的培养皿，在37摄氏度下孵育30分钟。随后，通过移除培养基收获人胚胎干细胞，并在细胞脱落时向T25烧瓶中加入1毫升Acuta。向330微升冷冻基底膜基质中加入6.6毫升冷培养基。将溶液通过40微米细胞筛过滤，并用1毫升过滤后的溶液覆盖六孔板的每个孔。在人胚胎细胞与Accutase孵育30分钟后，将细胞接种至包被好的培养板中，并通过加入1.5毫升Hess培养基终止反应。用移液管从培养瓶中刮下细胞，然后加入额外的 8 毫升 Hess 培养基。使用 10 毫升移液管轻轻吹打，制成单细胞悬液，经 40 微米细胞滤网过滤后，在 500 ×g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 10 毫升培养基中，再次在 500 ×g 条件下离心 3 分钟。然后弃去上清液，重新将细胞悬于 10 毫升含有 ROCK 抑制剂 Y-27632（终浓度为 10 微摩尔/升）的 Hess S 培养基中。接下来，从包被明胶的培养皿中移除上清液，将细胞悬液接种到包被明胶的培养皿上，并在37摄氏度下准确孵育一小时。在此步骤期间，滋养层细胞将沉降到明胶包被的培养皿底部，而人胚胎干细胞则保持悬浮状态。孵育时间至关重要：孵育时间过长会导致干细胞聚集成团，而孵育时间过短则仅能去除少量这些成纤维细胞，尤其是在成纤维细胞已贴壁的情况下。用培养板中的培养基轻轻冲洗，将未贴壁的干细胞从培养板上洗脱。再用 10 毫升 Hess 培养基洗涤培养板一次，收集细胞并合并，以 500 ×g 离心 3 分钟，弃去上清液 S，将细胞重悬于约 4 毫升含 10 微摩尔 ROCK 抑制剂 Y-27632 和 10 纳克/毫升成纤维细胞生长因子 2 的条件培养基中。接着，将细胞与台盼蓝混合，在血细胞计数板中进行计数。基底膜前，每平方厘米接种18,000个细胞。使用包被基底膜的培养板，每孔加入1.5毫升培养基覆盖细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。24小时后更换新鲜培养基；再过24小时后，更换为仅添加10纳克/毫升成纤维细胞生长因子2的新鲜条件培养基，继续培养72小时。接种细胞后，将培养基更换为无血清替代培养基。此时间点称为分化的第0天。在接下来的三天中，每天用新鲜培养基更换一次。在第四天和第五天更换培养基时，加入由25% N2添加物补充的培养基和75% knockout血清替代物组成的混合液。第六天更换培养基后，收获细胞进行分析。胚状体可用于多种不同的研究。以下是一项细胞毒性研究的示例，展示了不同浓度的甲基汞对细胞活力的影响。根据该图可知，24 微摩尔浓度导致 10% 的细胞死亡，而 1.61 微摩尔浓度在暴露 14 天后导致 50% 的细胞死亡。从三个甲基汞处理组的胚胎体中分离出的 RNA 被用于微阵列分析，以检测多种生物标志物。暴露于0.25微摩尔汞的样本以红色显示。暴露于1微摩尔甲基汞的样本以蓝色显示，对照RNA以绿色显示。该主成分分析图显示，各处理组之间的遗传特征存在显著差异；在暴露于1微摩尔浓度的甲基汞时，超过276个基因的表达水平发生了两倍以上的改变。在25微摩尔浓度组中，这30个基因也发生了修饰。在此热图中可以看出，在1微摩尔处理组中发生修饰的基因中，有233个基因的表达被下调，仅有43个基因被上调。请注意，操作三唑类化合物或发育中的蚂蚁可能具有极高危险性，因此在进行本实验时，必须采取防护措施，例如佩戴防溅护目镜、耐化学腐蚀的手套，并在通风橱内完成所有与三唑相关的操作。按照此步骤操作后，还可进行其他方法，如染色、铁沉积形成等，这些方法可能会与您的管腔形成实验混合，可用于回答其他问题，例如表型锚定。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

基于发育毒性测定化学品安全筛选和系统生物学数据生成人类多能干细胞

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

所述方案可使实验室利用可编程液体处理机器人和96孔板，以较低的劳动力、经验及设备投入成本，实现可扩展的、贴壁培养的干细胞高通量培养。在此系统中传代超过20次的诱导多能干细胞（iPSCs）仍维持了多能性、正常的核型，并可分化为心肌细胞。...

基于96孔板的可扩展iPSC培养与生产及机器人液体处理系统应用

本研究旨在利用基于阻抗的实时细胞分析仪与基于高内涵筛选（HCS）的平台相结合的方法，评估15种香烟烟雾成分的生物学影响 体外本研究提供了有关受试化合物的有效剂量、毒性和作用机制的信息。...

高内涵筛选分析用于评估有害及潜在有害成分（HPHC）的毒理学效应

人诱导多能干细胞（hiPSCs）被认为是药物和化学物质筛选以及新药开发的有力工具 体外...

人诱导性多能干细胞向神经元与胶质细胞混合培养物分化的实验方案用于神经毒性检测

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。...

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

我们提出了一种高效、大规模且快速的化学重编程方法，可将传统的已启动谱系的人类多能干细胞（hPSC）逆转为表观基因组稳定的、类似于着床前上胚层的 naive 多能状态。该方法可显著降低谱系启动相关基因的表达，并在多种传统 hPSC...

化学重编程常规人类多能干细胞至类似原始态并增强多向分化潜能

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外...

人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

分析人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞收缩功能和细胞完整性的变化，对于非临床药物开发具有重要意义。一种混合式96孔细胞分析系统能够以实时且符合生理条件的方式同时检测这两个参数，从而获得可靠且与人体相关的结果，为安全进入临床阶段提供必要支持。...

用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。...

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本研究中，我们介绍了一种用于鉴定致畸化学物的体外细胞检测方法。通过在人诱导性多能干细胞（iPS）报告细胞中检测成纤维细胞生长因子（FGF）/血清反应因子（SRF）信号通路的动态变化，并定量分析化学物对该信号通路的干扰程度，从而评估其致畸风险。<br...

基于实时监测人诱导多能干细胞中成纤维细胞生长因子信号干扰的发育毒性检测方法

了解基于人类多能干细胞和转录组分析的体外发育毒性检测系统。该方法利用人胚胎干细胞培养、类胚体形成及神经外胚层祖细胞分化，结合化合物处理和RNA微阵列分析，为化学品安全筛选提供人类相关数据，有助于减少动物实验并预测发育毒性风险。

基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

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