Name: 外科手术切除为鼠标肋骨：模型进行大规模的长骨修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习小鼠肋骨外科手术切除技术，建立大规模长骨修复模型。该方法通过切开、暴露、切除肋骨及闭合切口，帮助研究人员观察骨骼愈合过程中的细胞和分子事件。

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感谢Mariani实验室成员对手稿的审阅。我们的资助来源包括：Baxter医学学者研究奖学金（授予M.K.S.）、南加州大学本科生奖学金、教务长、Joan M. Schaeffer和Rose Hills奖学金（授予M.K.S.）。我们还感谢通过帕萨迪纳城市学院获得的加州再生医学研究所（CIRM）BRIDGES奖学金（授予T.T.T.），以及James H. Zumberge研究与创新基金、南加州大学再生医学计划和美国国立关节炎与肌肉骨骼皮肤病研究所（NIAMS）美国国立卫生研究院（NIH）资助号R21AR064462（授予F.V.M.）。

注意：所有操作均符合南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案。
1. 手术准备
<ol>
	<li>准备好必要的手术器械和耗材（已灭菌，参见材料列表中的项目 1 - 18），并在通风橱或下吸式工作台上放置解剖显微镜和光纤透射照明器。</li>
	<li>将一只性成熟的成年小鼠（20 - 30 g，1 - 3 月龄）放入诱导室，使用 4% 异氟烷诱导麻醉。</li>
	<li>通过脚掌和/或尾部夹捏试验确认麻醉效果。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹眼膏，以防止手术过程中眼睛干燥。</li>
	<li>将小鼠转移至显微镜载物台上，将其鼻部接入维持用鼻罩，并使小鼠侧卧放置。在动物旁边放置保温袋以维持体温。 
	注：小鼠的放置方向可根据个人习惯或术者惯用手选择，左侧或右侧均可。</li>
	<li>将异氟烷浓度调整至 2 - 3% 以维持麻醉，并密切观察呼吸频率。</li>
	<li>使用 25 G 针头在腿部外侧 flank 区域皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），用于术后镇痛。注射时腿部可能出现抽动，此为正常反应。</li>
</ol>
2. 开始切口
<ol>
	<li>通过触诊确定目标肋骨，并用剃刀清除该区域的毛发。 
	注意：建议选择第8至10肋，因为第1至7肋靠近肺部，而第11至13肋明显较短。计数肋骨时应从最靠前的肋骨开始，将其记为第1肋。</li>
	<li>使用聚维酮碘和异丙醇（70%）交替擦拭进行区域消毒（动物使用方案通常建议重复3次）。</li>
	<li>用中号显微外科剪刀在目标肋骨正上方并与其平行处，切开2 cm长的皮肤切口。继续切开下方的肌肉和脂肪层。</li>
	<li>将皮肤、肌肉和脂肪三层组织全部置于拉钩中，以充分暴露手术区域，同时尽量缩小切口大小。</li>
</ol>
3. 切取肋骨
<ol>
	<li>用5.0 mm手术刀切开覆盖在目标肋骨区域的肋间肌。切口位置应位于肋软骨关节近端约5 mm处，因为此处肋骨弯曲程度较小。用精细尖头镊子小心地将肌肉从骨面分离。</li>
	<li>为在保留骨膜的前提下进行骨段切除，使用5.0 mm手术刀沿肋骨长轴切开骨膜。用精细尖头镊子小心地从外侧将骨膜与下方骨组织分离。操作时需格外谨慎，因骨膜极为脆弱，质地呈凝胶状。</li>
	<li>接着用精细显微剪在骨的一端横向剪断。必要时可通过显微镜中的测微尺或刻度尺测量切除长度。然后小心将骨块从骨膜中抬起，并剪断另一端。 
	注意：操作需格外小心。此步骤最为精细，若在未完全切除下方肋骨的情况下强行上提，会撕裂胸膜，导致气胸。一旦胸膜破裂，胸腔内部将清晰可见，易于识别。</li>
	<li>若因骨切割出现出血，应用棉签在切口处施加压力4–5秒以止血。 
	注意：极少数情况下若出血持续，可能需要终止实验并对动物实施安乐死，因为大量失血将影响其恢复（在不进行液体补充的情况下，可安全丢失的最大血量为总血量的10%，即7.7–8 µl/g。对于一只25 g的小鼠，相当于约180–200 µl9）。</li>
	<li>立即将取出的肋骨放入4%多聚甲醛（PFA）中，以备后续分析。 
	注意：若需同时切除骨组织和骨膜，则跳过骨膜切开与分离步骤（步骤3.2）。由于骨膜与胸膜紧密相连，操作时应谨慎使用镊子轻轻分离肋骨与胸膜，避免撕裂。</li>
</ol>
4. 关闭切口
<ol>
	<li>使用9-0缝线将肋间肌缝合覆盖在残留的骨膜套上方（通常使用2针即可）。将缝线置于肋骨切断端的正上方，以作为手术位置的标记。</li>
	<li>移除牵开器。使用9-0缝线缝合表层肌肉和脂肪组织（通常使用3至4针即可）。对于肌肉和/或脂肪层特别厚的小鼠，应分别缝合各层（e.g.，肌肉层使用一层缝线，脂肪层另使用一层缝线）。</li>
	<li>使用7-0缝线关闭皮肤（通常使用4至5针即可）。</li>
	<li>使用缝合胶固定切口，并用大号镊子夹合切口边缘使其贴合。</li>
	<li>逐步减少异氟烷的供给，先将浓度调至1%维持数分钟，随后关闭麻醉气体。</li>
	<li>将小鼠置于加热灯下，直至其恢复意识（约5至10分钟）。意识恢复后，在整个恢复期间，小鼠应能正常活动和行走，且无任何痛苦迹象。</li>
</ol>
5. 回收与分析
<ol>
	<li>提供术后疼痛管理，包括以口服明胶形式给予0.5 mg/kg剂量的丁丙诺啡，每12小时一次，持续48小时。口服给药无需固定动物，可避免对胸部区域造成疼痛。</li>
	<li>在恢复期间，将小鼠饲养于笼中，自由获取食物和水。伤口干燥后，雌性动物可同笼饲养，而雄性必须单独饲养，以防止争斗。</li>
	<li>恢复期结束后，按照批准的程序实施安乐死。取出肋骨进行固定和分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突可披露

初次学习该方案时，确定初始切口的位置可能具有挑战性。然而，通过对已安乐死的小鼠进行练习，外科医生可以掌握初始切口的定位，并暴露需要切除的肋骨。在尸体上操作还有助于提高精细运动技能，以便在保留或不保留骨膜的情况下切除肋骨部分。此外，刚接触该操作的人员可能会发现操作精细器械和细缝线较为困难。在打结过程中，过度牵拉缝线可能导致组织撕裂。因此，在尸体上进行一些缝合练习可能会有所帮助。最后，如果外科医生初次进行啮齿类动物手术，建议在最初几次手术中由另一人协助监测和调整麻醉状态。
本方案最关键的步骤是在不诱发气胸（胸膜腔内异常积气）的情况下切除骨骼，而在小鼠中治疗气胸非常困难，因为其胸膜过薄，无法通过手术闭合。肋骨下方的肌肉层和壁层胸膜非常薄且脆弱，因此需要精确的操作，以防止穿刺到切除区域下方的胸膜。该问题最常发生在步骤 3.1 和 3.3 中。在步骤 3.1（将骨骼与周围肋间肌分离）中，若手术刀或镊子的尖端未保持在浅层，锋利的器械极易刺穿胸膜层。在步骤 3.3（使用精细的显微剪刀切除骨骼）中，将剪刀插入骨骼下方时可能超过胸膜的抗张强度，或者折断骨骼的操作可能导致骨碎片末端穿破胸膜。我们发现，...

严重的骨骼损伤、慢性骨关节炎以及与重建手术相关的严重问题，影响着经济生产力、家庭福祉和生活质量。尽管较小的骨折和病损通常能够较好地愈合，但人类自身无法修复较大的骨缺损，因此必须依赖重建手术&#160;来恢复结构与功能。重建方法可能包括同种异体移植、异种移植、碎骨移植、植入支架或牵张成骨术。然而，这些治疗手段不仅常伴随持续的并发症风险，且修复后的骨骼通常难以恢复原有的强度。因此，亟需开发新的临床治疗策略。
开发治疗节段性缺损创新方法的一种途径是研究大规模组织修复自然发生的状况。两栖动物以其能够再生骨骼结构而闻名，而哺乳动物则被认为在这一能力上受限。然而，自20世纪早期以来th 近一个世纪以来，已有少数关于人类肋骨再生的报道发表，提示人类的再生能力可能并非如此有限1-4 目前，这一现象在整形外科医生中最为人所知，他们常使用肋骨材料进行下颌、面部和耳部的重建，但其更广泛的意义尚未得到充分认识5为了更深入地研究这一修复过程，我们建立了一种使用小鼠的手术模型。通过该方案，研究人员能够鉴定出参与其中的固有因素，并利用这些信息促进其他部位的骨骼愈合。
使用肋骨作为研究骨骼修复的模型具有诸多优势。首先，周围的肋骨提供了天然的固定结构（相比之下，股骨切除则需要额外固定装置6,7），这降低了使用内外固定装置所带来的并发症风险，并简化了手术操作。其次，胸壁的肌肉层较薄，便于手术入路并提供良好的视野，使该模型在操作便利性上可与颅顶骨切除模型相媲美8。第三，与通过膜内成骨方式形成的颅顶骨不同，肋骨通过软骨内成骨方式形成，并通过位于骨干两端的生长板延伸而增加长度。因此，肋骨的修复过程可能更接近附肢骨骼中长骨的修复过程。此外，我们发现与股骨相比，肋骨的骨膜更厚，更易于操作。因此，对于希望研究骨膜功能，或评估细胞治疗、药物制剂和/或组织支架在骨修复中作用的研究人员而言，该手术模型可能尤为适用。总之，这一肋骨切除模型为研究哺乳动物体内自然发生的较大规模骨修复提供了独特的实验体系，而目前尚无被广泛采用的类似模型。

<table><tbody><tr><td>中号显微解剖剪刀（Vannas-T&amp;uuml;bingen 弹簧剪，5 mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>精细显微解剖剪刀（Vannas 弹簧剪，2 mm 刃口）</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td>弯曲尖端更佳</td></tr><tr><td>显微手术刀 5.0 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10315-12</td><td>可使用其他精细手术刀替代</td></tr><tr><td>Dumont 55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>牵开器&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>17004-05</td><td>可调节设计更方便</td></tr><tr><td>显微持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>9.0 尼龙缝线（Ethilon），锥形针尖最佳</td><td>Ethicon</td><td>2819G 或类似型号</td><td>锥形针尖最佳，反向切割针尖也可使用</td></tr><tr><td>7.0 Prolene 缝线（Prolene）</td><td>Ethicon</td><td>8700H 或类似型号</td><td>也可使用 6-0 规格，针尖类型可不同</td></tr><tr><td>大型镊子（Adson 镊子）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td>其他品牌亦可</td></tr><tr><td>润滑性眼膏（Akwa Tears）</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>缝合胶（GLUture 外用组织粘合剂）</td><td>Abbot</td><td>32046-01</td><td>具有优异的操作时间</td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Wahl</td><td>9918-6171 或类似型号</td><td></td></tr><tr><td>夹灯</td><td>Zoo Med</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>红外灯泡，75 W</td><td>Zoo Med</td><td>RS-75</td><td></td></tr><tr><td>RC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 小型啮齿类动物麻醉系统</td><td>VetEquip&amp;nbsp;</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo（异氟烷）</td><td>Abbot</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡（Buprenex）</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）</td><td>Purdue Frederick</td><td>67618015017</td><td></td></tr><tr><td>果味明胶，覆盆子味</td><td>Jell-O</td><td>B000E1FYL0</td><td>配制成较硬质地，类似“颤动果冻”（jigglers）的稠度</td></tr></tbody></table>

小鼠肋骨切除手术操作：一种大规模长骨修复模型

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

本方案向研究人员介绍了一种利用小鼠肋骨进行大范围骨修复的新模型。该手术程序包括以下步骤：术前动物准备、打开胸壁、从周围肋间肌中暴露目标肋骨、在不引发气胸的情况下切除目标肋骨节段，以及关闭切口。与附肢骨骼的其他骨相比，肋骨具有更高的可及性。此外，由于相邻肋骨可提供天然固定，因此无需使用内固定或外固定装置。该手术采用 commercially available supplies（商业化供应品），易于学习，且动物耐受性良好。该操作可根据需要选择保留或去除周围骨膜，从而评估骨膜在骨修复过程中的作用。研究结果表明，若保留骨膜，可在1至2个月内实现有效的骨修复。我们预期，本方案的应用将推动肋骨修复领域的研究，并有助于开发促进身体其他部位骨修复的新方法。

动物通常在此操作后能迅速恢复，切口愈合良好，且动物表现出正常行为。该操作使用市售试剂，经过练习后可在1小时以内完成。在使用此方法生成实验数据之前，重要的是在第0天时间点分析切除情况，以确定切除区域内是否可能残留较大的骨碎片。评估操作是否得当的一种方法是通过术后X射线或显微CT成像检查动物，尽管这通常需要特殊的辐射安全审批。另一种简单的评估方法则是进行骨骼染色制备，如图1A所示。该方法包括收集肋骨骨架，用乙醇（EtOH）固定，并采用标准方案11用茜素红进行染色。可选择省略氢氧化钾（用于消化软组织），以便后续如有需要仍可用于组织学分析。由于覆盖的体壁肌肉层较薄，样本仍可通过80%甘油透明化后直接观察，无需氢氧化钾处理步骤。或者，也可在固定/染色前手动去除这些肌肉，如本图所示（图1A）。
切除的骨组织部分也可进行分析。如果实验目的是在动物体内保留骨膜，则通过光学显微镜和组织学分析可见，骨组织表面应较为光滑（图1B，B’）。若骨组织连同骨膜一并切除，则其表面应明显粗糙...

本实验的总体目标是从小鼠肋骨上成功切除一段骨组织。该手术程序被开发用于研究大段长骨修复的模型。

本方案向研究人员介绍了一种利用小鼠肋骨进行大尺度骨修复的新模型。该操作流程详细说明了以下步骤：准备……

该操作的目的是在肋骨的骨性部分制造一个大范围的切除，作为骨骼修复的模型。首先在动物体侧皮肤上做一切口并切开，以完成第一步。第二步是暴露需要被切除的肋骨。接下来，可连同周围结缔组织鞘或骨膜一起，或保留骨膜，切除部分肋骨。最后一步是闭合切口，并让动物恢复。最终，该骨修复模型可用于展示大规模骨骼修复过程中发生的细胞和分子事件。在哺乳动物中，该方法的可视化演示至关重要，因为操作手术器械需要精确性，而成功的手术则依赖于了解不同组织的位置。本次操作演示将由本实验室的两名研究生 Marissa Roar 和 Nikita Tripper 进行。在准备妥当手术区域以及所需的无菌器械和用品后，将一只小鼠放入含有 4% 异氟烷的诱导室中以诱导麻醉。小鼠麻醉后，将眼药膏涂抹于小鼠眼睛，并确认麻醉深度。通过夹捏脚趾进行检测，小鼠应无任何反应。将小鼠置于体视显微镜载物台上的加热垫上或其附近，并将麻醉维持管的鼻罩罩住小鼠鼻部。确保小鼠处于侧卧位。将异氟烷维持浓度调整为2%至3%，并观察其呼吸频率。随后使用25号针头进行皮下注射布托啡诺。对于术后预先镇痛，腿部可能会出现抽动，这是一种正常反应。首先，通过触诊从最靠前的肋骨开始确定目标肋骨，该肋骨计为第一根肋骨。在本视频中，将切除第10根肋骨的一部分。剃除肋骨区域的毛发，然后用聚维酮碘清洁，再用异丙醇擦拭三次。在拟切除的肋骨上方的皮肤、肌肉和脂肪层做一切口，长度为2厘米，将这三层组织均置于拉钩中，以暴露手术区域，同时尽量缩小切口尺寸。随后，使用5毫米的手术刀在距肋软骨关节近端5毫米处切开肋间肌，该位置肋骨弯曲程度较小。然后用尖头镊子仔细将肌肉与骨骼分离。接下来，在动物体内保留骨膜的同时创建切除区域，需沿肋骨长度方向切开骨膜。然后使用尖头镊子非常小心地将纤细的骨膜从下方骨组织向侧方分离。必要时，可在显微镜下使用刻度测微尺或标尺量规测量切除范围。然后使用精细的微型剪刀对骨骼进行横切。在一端小心地将骨骼从骨膜中抬起，并立即剪断另一端。将取出的肋骨放入4%多聚甲醛中，以备后续分析。如果因切割骨骼导致出血，可用带棉头的棉签在切口末端施加压力4到5秒，以止血。关闭切口时，用3到4个9-0间断缝线将肋间肌缝合在残留的骨膜套上方。将缝线直接置于肋骨切端上方，作为手术位置的标记。移除牵开器，然后使用9-0间断缝线缝合浅层的肌肉和脂肪组织。对于肌肉或脂肪层特别厚的小鼠，需逐层分别缝合。使用4到5根7-0缝线缝合皮肤，然后用组织粘合剂固定切口。使用大号镊子将切口边缘夹合。通过将异氟烷浓度调至1%数分钟，逐渐使小鼠脱离异氟烷麻醉，随后关闭异氟烷。将小鼠置于加热灯下，直至其恢复意识。在意识恢复后及整个愈合期间，小鼠应能正常活动和行走，且无任何痛苦迹象。待切口干燥后，将小鼠饲养于清洁的笼具中，并自由获取食物和水。雌性小鼠可同笼饲养，但雄性小鼠必须单独饲养，以防止争斗。术后需进行疼痛管理，包括以口服凝胶形式给予每12小时0.5毫克/千克的丁丙诺啡，持续48小时。口服给药无需固定动物，从而避免对胸腔区域造成疼痛。该图像显示的是术后立即采集的4.5毫米肋骨切除段。未残留骨碎片。样品用藏红染色，并在80%甘油中透明。箭头指示切割末端的位置。这是前一张图像中去除肋骨骨膜后的肋骨切除部分。此处显示的经苏木精和伊红染色的组织切片表明，左侧黄色箭头所示部位仅有极少的骨膜附着于骨组织，而右侧则无骨膜。黄色星号表示骨髓腔。该图像显示一段已被切除的肋骨，其骨膜仍保持附着状态；此组织切片显示骨表面覆盖着完整的骨膜，如黄色方括号所示。黄色星号再次指示骨髓腔。此图像显示了小鼠体内保留完整骨膜进行切除术后两个月愈合的骨骼标本，可见该区域已完全修复。刚刚展示的骨骼标本的组织学切片显示骨板壁和骨髓腔均已恢复。此图像显示了愈合三个月后的骨骼标本。在切除部分肋骨及周围骨膜后，仅在图中左侧的切割端观察到轻微修复。黄色箭头指向chocos关节。此组织学切片显示了先前所示骨骼标本的制备结果，可见肉芽组织、脂肪组织和肌肉细胞填充了切除部位。一旦掌握该技术，若严格按照本操作流程进行，可在一小时之内完成。其他方法，例如在肋骨的软骨部分制造切除区域，也可用于回答更多科学问题，比如：大规模软骨修复是如何发生的？观看本视频后，您应充分了解如何在肋骨的骨性部分创建切除区域，以研究骨骼修复过程。I.

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医学

外科手术切除为鼠标肋骨：模型进行大规模的长骨修复

骨修复领域临床前研究的一个限制因素是对愈合骨病灶局部力学环境缺乏实验性控制。本文报道了一种可用于骨修复的外固定装置的设计与应用，该装置具有调节固定器刚度的能力 体内.

可调节刚度的外固定架用于大鼠股骨截骨术及节段性骨缺损模型

在生物医学研究中，动物模型常被用于模拟严重的骨损伤。由于小鼠体型较小，大多数研究团队难以在其体内建立稳定的骨缺损模型。本文中，我们描述了一种在小鼠中建立和分析实验性股骨缺损的简便方法。...

一种简单的小鼠股骨临界尺寸缺损模型

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。...

建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

在软骨内骨愈合过程中，评估骨折愈合组织中组织发育情况对于监测愈合进程至关重要。本文报道了一种适用于小鼠股骨的磁共振成像（MRI）兼容外固定装置，可在小鼠骨再生过程中实现MRI扫描。...

体内评估小鼠股骨骨折愈合过程中骨痂发育：采用一种适用于小鼠股骨的磁共振成像兼容骨固定装置

本方案描述了一种用于研究术后神经炎症和行为变化机制的骨科手术小鼠模型，当与连体共生技术结合时，还可用于研究衰老过程中的组织再生。...

一种用于研究术后认知功能障碍与组织再生的骨科手术小鼠模型

本方案描述了一种使用髓内螺钉进行股骨骨折标准化固定的微创接骨技术，可用于分析小鼠的软骨内成骨愈合过程。...

一种在标准化生物力学条件下分析小鼠软骨内骨折愈合的微创模型

我们介绍了一种使用定制牵张器建立的小鼠胫骨牵张成骨模型。以小鼠作为分析对象有利于推动相关研究的进展。...

小鼠牵张成骨模型

小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合及加速骨再生新型治疗策略的有力平台。本手术方案的目标是通过使用髓内钢针固定股骨，在小鼠体内建立单侧闭合性股骨骨折。...

小鼠闭合性股骨骨折的建立：一种用于研究骨愈合的模型

本方案描述了一种对成年小鼠进行骨折处理并监测其愈合过程的方法。...

小鼠股骨横断骨折固定针模型

本方案描述了一种在小鼠股骨上建立骨干骨折并用髓内钢针固定的外科手术方法，用于骨折愈合研究。...

建立小鼠股骨骨干骨折模型

本方案介绍了一种全面且高效的下颌骨修复分析方法。我们描述了一种在小鼠模型中建立非稳定型下颌骨骨折的可重复技术，可在组织损伤和骨量丢失最小化的情况下，用于分析软骨内成骨修复过程。...

小鼠模型中非固定性下颌骨骨折的微创技术

学习小鼠肋骨外科手术切除技术，建立大规模长骨修复模型。该方法通过切开、暴露、切除肋骨及闭合切口，帮助研究人员观察骨骼愈合过程中的细胞和分子事件。

小鼠肋骨切除手术操作：一种大规模长骨修复模型

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