Name: 基因转染向着文化微模式球体板细胞基因修饰的细胞移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习利用聚复合纳米胶束对微图案培养板上的3D细胞球体进行基因转染，实现可注射的基因修饰细胞移植。该方法可在宿主动物体内维持长期转基因表达并保持细胞固有功能。

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我们衷心感谢池谷武史博士和技术人员&#160;感谢日本东京东洋合成公司（Toyo Gosei）提供温敏型微图案化培养板及科学建议。我们还感谢小仓里美（Satomi Ogura）女士、铃木佐惠（Sae Suzuki）女士，&#160;Asuka Miyoshi 女士和 Katsue Morii 女士在动物实验方面的技术协助。本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金、日本科学技术振兴机构（JST）创新中心（COI）计划和 S-创新计划，以及 JSPS 核心-核心计划 A 类：先进研究网络的资助。

所有动物实验均经日本东京大学动物护理与使用委员会批准。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>对于原代肝细胞，按照改良的两步胶原酶消化法从大鼠分离肝细胞的方案进行操作13,14.
	<ol>
		<li>使用异氟烷吸入麻醉使 Sprague Dawley（SD）大鼠（雄性，5 周龄）麻醉。将大鼠置于连接麻醉机的麻醉舱内，以向舱内提供异氟烷。待大鼠入睡后取出，放置于操作台上，通过面罩通气。根据大鼠状态调节异氟烷流量，控制在约 0.4–0.7 L/min。&#160;通过门静脉灌注5周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠的肝脏，灌注液为特制溶液，其成分为8 g/L氯化钠（NaCl）、400 mg/L氯化钾（KCl）、78 mg/L磷酸二氢钠二水合物（NaH₂PO₄·2H₂O）2PO4·2H2O)，151 mg/L 磷酸氢二钠十二水合物（Na2HPO4·12H2O)、2.38 g/L 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）、190 mg/L 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、350 mg/L 碳酸氢钠（NaHCO₃）3，以及 900 mg/L 葡萄糖。</li>
		<li>通过肝脏循环胶原酶溶液。 &#160; 
		注意：该溶液由500 mg/L胶原酶、9.8 g/L Hank's平衡盐溶液、2.38 g/L HEPES、556 mg/L氯化钙水合物（CaCl₂）组成。2·H2O)，350 mg/L NaHCO₃3，以及50 mg/L胰蛋白酶抑制剂，pH值调节至7.2。</li>
		<li>小心取出肝脏，用手术刀片在培养皿中轻轻切碎，加入含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），将细胞悬液通过100 μm尼龙滤网过滤。为去除更多碎片，将细胞悬液在20 × g离心1分钟。此步骤中，肝细胞位于上清液中。</li>
		<li>重复离心步骤两次（共离心三次）。最后，以50 × g离心3分钟，使肝细胞形成沉淀并回收。</li>
		<li>将肝细胞重悬至浓度为 4 × 105 细胞/ml，置于由DMEM组成的特殊培养基中&#160;添加10%&#160;FBS，1% 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSQ），1% 二甲基亚砜（DMSO），0.1 µmol/L 地塞米松，0.5 µg/ml 胰岛素，10 mmol/L 烟酰胺，0.2 mmol/L 磷酸化抗坏血酸（Asc-2P），以及 10 ng/ml 人表皮生长因子（hEGF）15. 这种特殊培养基是维持肝功能所必需的 体外 条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过过量给予异氟烷处死雄性5周龄Sprague Dawley（SD）大鼠以获取大鼠间充质干细胞。切除股骨和胫骨，用22 G针头插入骨髓腔，以10 ml DMEM冲洗并收集骨髓。&#160;补充10%&#160;FBS。通过100 µm尼龙滤网过滤收集细胞。</li>
	<li>将细胞接种至10 cm培养皿中，使用含10% FBS和1%青霉素的DMEM培养基&#160;/&#160;链霉素。对于球体实验，使用传代次数不超过5次的MSCs。</li>
</ol>
3D 细胞球体的制备
<ol>
	<li>购买市售的微图形培养板，其上细胞黏附区域以二维方式规则排列，直径为 100 µm，周围由PEG基质包被的非黏附区域环绕。&#160; 
	注意：对于细胞移植，需额外包被温敏性聚合物PIPAAm，以便通过降低培养板温度实现细胞脱离（见步骤5.1）。温度波动可引起该聚合物化学性质的变化8-10。在37 °C时，PIPAAm略具疏水性，允许细胞在正常条件下培养；当温度降至32 °C以下时，聚合物迅速发生水合，导致细胞自发脱离。</li>
	<li>将肝细胞或间充质干细胞以4 × 105 个细胞/孔的密度接种于12孔微图形培养板中，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养。细胞将聚集在微图形黏附区域，并在2天内逐渐形成圆形类球体。&#160; 
	注意：为制备单层培养的对照细胞，使用普通的12孔板，以相同密度接种细胞，并遵循与上述类似的步骤进行操作。</li>
</ol>
3. 聚合物胶束的制备
<ol>
	<li>按照作者先前描述的方法11,16,17，合成嵌段共聚物PEG-PAsp(DET)（聚[N’-[N-(2-氨乙基)-2-氨乙基]天冬酰胺]）（PEG分子量Mw = 12,000，PAsp(DET)段的聚合度(DP) = 59）以及仅由阳离子段[PAsp(DET)]组成的均聚物（DP = 55）。</li>
	<li>在10 mM HEPES缓冲液（pH 7.3）中，将PEG-PAsp(DET)嵌段共聚物和PAsp(DET)均聚物按残余氨基的等摩尔比例配制成混合溶液，分别调节聚合物浓度至33.3 µg/ml&#160;和19.1 µg/ml。&#160; 
	注意：上述聚合物浓度是用于制备具有特定N/P比（即两种聚合物中总氨基残基与pDNA中磷酸基团的摩尔比）为10的纳米胶束的代表性数值。N/P比可根据细胞类型和实验目的进行调整（详见讨论部分）。联合使用这两种聚合物可同时实现有效的PEG屏蔽作用以及PAsp(DET)促进内涵体逃逸的功能（详见讨论部分）18。</li>
	<li>通过商业试剂盒按照制造商说明书，将编码Gaussia荧光素酶、GL4荧光素酶或促红细胞生成素的基因片段克隆至pCAG-GS质粒（http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html）&#160;中，构建可在CAG启动子/增强子驱动下表达的pDNA。在感受态大肠杆菌（Escherichia coli）菌株中扩增该pDNA，并使用无内毒素质粒DNA纯化系统进行纯化。通过测定260 nm处的吸光度确定pDNA浓度，将其配制成150 µg/ml&#160;的溶液，溶于10 mM HEPES缓冲液（pH 7.3）中。</li>
	<li>为制备聚复合物纳米胶束，将pDNA溶液（150 µg/ml&#160;，溶于10 mM HEPES缓冲液）与预先混合的两种聚合物溶液按体积比2:1充分混合。</li>
</ol>
4. 类球体的基因转染
<ol>
	<li>将细胞（肝细胞或间充质干细胞）接种至微图形化培养板后，孵育72小时，以促进成熟类球体的形成。进行基因转染时，加入100 µl&#160;将培养基更换为1 ml后，向每孔加入聚复合物纳米胶束溶液（含10 µg pDNA）&#160;新鲜培养基中继续与纳米胶束溶液共同孵育24小时。</li>
	<li>使用脂质体转染试剂作为对照时，将质粒DNA溶液与试剂按试剂/pDNA的重量比混合&#160;3. 调整pDNA的终浓度，使其在基于脂质的试剂和纳米胶束方法中相等。</li>
</ol>
5. 细胞球体的回收与移植
<ol>
	<li>用 200 µl 预冷的 PBS 更换培养基，并将培养板置于冰上。 &#160; 
	注意：通常情况下，类球体约15分钟后可脱落，并可回收为悬浮液形式用于移植。</li>
	<li>用23 G针头的注射器轻轻吸取200 µl悬浮液中的细胞&#160;或27 G针头用于 体内 注射</li>
</ol>
6. 转基因表达的评估
<ol>
	<li>对于 体外 评估培养基中分泌的Gaussia荧光素酶的表达，收集50 – 100 µl&#160;在更换新鲜培养基后精确24小时收集培养基。根据制造商说明书，使用商业化的海肾荧光素酶检测试剂盒和化学发光仪检测荧光素酶表达水平。 &#160; 
	注意：海肾荧光素酶在培养基中可保持稳定超过一周。因此，为评估转基因表达的实时效率，应在收集样本培养基前更换为新鲜培养基。更换培养基的时间可根据实验需要灵活调整。</li>
	<li>对于 体内 在细胞移植后评估宿主动物中外源基因的表达，使用异氟烷吸入麻醉对BALB/c裸鼠（雌性；7周龄）进行麻醉。
	<ol>
		<li>将小鼠放入与麻醉机相连的麻醉舱内，通过麻醉舱提供异氟烷。待小鼠失去意识后取出，置于操作台上，使用面罩供氧通风。将异氟烷流量控制在约0.2–0.5&#160;通过检查小鼠的状况，以 L/min 为单位。</li>
		<li>注射 200 µl&#160;将含有转染了表达GL4荧光素酶的质粒DNA（如4.1节所述）的细胞悬液注射至腹部皮下组织。</li>
		<li>注射D-荧光素（150 mg/kg；静脉注射途径）后立即按照制造商的说明书，使用IVIS成像系统检测荧光素酶表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为评估细胞移植的治疗效果，注射 200 µl&#160;将含有转染了编码促红细胞生成素的质粒DNA的细胞悬液注射到腹部皮下组织中。
	<ol>
		<li>通过下颌下采血法采集血液样本，以获得约 200 µl 血液&#160;血液19使用血样分析仪测定血红蛋白和红细胞压积。 &#160; 
		注意：移植的细胞数量由接种到培养板上的细胞数决定。然而，由于无法测量类球体内部的细胞数量，因此很难确定确切的细胞数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验结束后，将小鼠置于连接温度控制器的加热垫上，直至从麻醉状态苏醒。</li>
</ol>

<ol><li>Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroidal+aggregate+culture+of+rat+liver+cells%3A+histotypic+reorganization%2C+biomatrix+deposition%2C+and+maintenance+of+functional+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities.</a> J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).</li>
<li>Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+cell+aggregation+for+expression+of+liver+functions+and+regeneration+demonstrated+with+primary+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes.</a> J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在本实验方案中，基因导入和类球体回收步骤中维持类球体的三维结构至关重要。必须为细胞提供有利的微环境，以避免细胞死亡或细胞活性丧失。例如，白蛋白分泌作为肝细胞的一种典型固有功能，在肝细胞类球体中能够很好地保留；而在传统单层培养中的肝细胞，接种后数天内即迅速丧失其分泌能力12。对于间充质干细胞（MSCs），类球体显著提高了其向脂肪细胞或成骨细胞分化的效率，同时上调了参与脂肪生成和成骨生成的相关基因表达水平，并下调了维持MSC自我更新表型的基因4。
在基因导入方面，此前已测试了多种转染试剂，包括基于脂质的试剂（图3、4）和基于聚合物的试剂，例如聚乙烯亚胺。然而，所有这些试剂均未能在不破坏类球体结构的情况下实现成功的基因导入。特别是基于脂质的试剂，尽管在微图案化培养板上残留的细胞中也能实现高效的外源基因表达，但往往会导致类球体结构完全解体。这可能是因为基于脂质的试剂会引起显著的细胞膜不稳定，从而促进高水平的外源基因表达，但同时破坏了细胞间的相互作用，导致类球体结构瓦解。
<p class="jove_co...

细胞移植疗法因其在治疗多种难治性疾病方面的潜力而受到广泛关注。移植细胞所分泌的生物活性因子的活性及其半衰期，对于提高细胞移植系统的治疗效果至关重要。在移植前对细胞进行遗传修饰，是一种有效调控和操纵细胞功能（包括生物活性因子分泌）的技术。同时，维持有利于细胞存活的微环境，以避免细胞死亡或细胞活性丧失，也具有重要意义。三维（3D）球状体细胞培养能够良好地保持细胞间的相互作用，在此方面展现出良好前景，例如可增强原代肝细胞的白蛋白分泌，促进间充质干细胞（MSCs）的多向分化1-7。
本研究采用了一种新型的类球体培养与基因转染联合系统，作为基因修饰细胞移植的平台。为制备类球体细胞，使用了基于微图案化培养板的类球体培养系统。在这些培养板上，直径为100 µm的细胞黏附区域以二维方式规则排列，并由聚乙二醇（PEG）基质包被的非黏附区域包围3。通过接种适量的细胞，可形成与微图案化培养基底相对应、直径为100 µm的三维类球体阵列。
通过使用涂有温敏性聚合物聚异丙基丙烯酰胺（poly(iso-propylacrylamide), PIPAAm）的温敏细胞培养板，可在不破坏类球体三维结构的情况下将其回收8-10。微图案化结构构建于温敏板上（定制）。仅需降低培养板的温度，类球体即可从培养基质上脱离并分散于磷酸盐缓冲液（PBS）中。因此，可获得大量直径均一为100 µm的类球体，形成可注射的悬浮液。
<img alt="类球体培养方法示意图：细胞接种、纳米胶束转染、恢复、注射过程。" p="" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 微图案化培养板上类球体培养系统的示意图。基因修饰通过使用原始的非病毒基因载体——聚复合物纳米胶束进行基因转染实现。该纳米胶束由质粒DNA（pDNA）和聚乙二醇（PEG）-聚阳离子嵌段共聚物组成11。其具有典型的核-壳结构，外壳为PEG，内核为压缩的pDNA，可安全有效地将基因导入细胞，用于治疗目的11。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA通过静电相互作用与嵌段共聚物自组装形成聚复合物纳米胶束的示意图。" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 核酸与PEG-嵌段-聚阳离子嵌段共聚物复合物形成的聚复合物纳米胶束结构。本研究中，该技术的主要优势在于纳米胶束介导的基因转染过程中，类球体结构未受到破坏。在对大鼠原代肝细胞类球体进行纳米胶束介导的转染后，可实现超过一个月的持续外源基因表达，同时肝细胞持续分泌白蛋白，其水平与未转染的类球体相当12。类球体在从温敏培养板上回收后，仍能维持外源基因表达和白蛋白分泌。显然，纳米胶束可在不损害肝细胞固有功能的前提下安全地促进基因导入。因此，将温敏微图案化培养板上培养的类球体细胞与纳米胶束介导的基因导入技术相结合，是一种极具前景的基因修饰细胞移植平台。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（Pen-Strep-Glut）</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>地塞米松（Dexamethasone）</td><td>和光纯药工业（Wako Pure Chemical Industries）</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺（Nicotinamide）</td><td>和光纯药工业（Wako Pure Chemical Industries）</td><td>141-01202</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液与L-抗坏血酸-2-磷酸（Asc-2P）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（hEGF）</td><td>东洋纺（Toyobo）</td><td>PT10015</td><td></td></tr><tr><td>Cell-able 多孔板</td><td>东洋合成（Toyo Gosei）</td><td>PP-12</td><td></td></tr><tr><td>温敏型细胞培养板（Upcell&lt;sup&gt;)&lt;/sup&gt;</td><td>CellSeed 公司（CellSeed Inc）</td><td></td><td>微图案结构构建于温敏型培养板上（由东洋合成定制生产）</td></tr><tr><td>脂质体转染试剂（FuGENE HD）</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>海肾荧光素酶检测系统（Renilla Luciferase Assay System）</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 荧光素酶报告载体（pGL4 Luciferase Reporter Vector）</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>表达高丝氨酸荧光素酶的质粒DNA（pDNA expressing Gaussia luciferase）</td><td>新英格兰生物实验室（New England BioLabs）</td><td>N8082S</td><td></td></tr><tr><td>表达小鼠促红细胞生成素的载体（Mouse erhthropoietin-expressing vector）</td><td>Origene</td><td>MC208445</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GS</td><td></td><td></td><td>由理化研究所（RIKEN）发育生物学中心多能细胞研究实验室惠赠</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>宝生物工程（Takara）</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>无内毒素质粒DNA纯化系统（Endotoxin-free plasmid DNA purification system）</td><td>日水遗传（Nippon Genetics）</td><td>NucleoBond Xtra EF</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶（Collagenase）</td><td>和光纯药工业（Wako Pure Chemical Industries）</td><td>639-00951</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor）</td><td>GIBCO</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>发光仪（Luminometer）</td><td>Promega</td><td>GloMax&amp;trade; 96 微孔板发光仪（GloMax 96 Microplate Luminometer）</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 成像系统（IVIS Imaging System）</td><td>Xenogen Corp.</td><td>Xenogen IVIS Spectrum 活体成像系统（in vivo imaging system）</td><td></td></tr><tr><td>血液分析仪（Blood sample analyzer）</td><td>希森美康（Sysmex）</td><td>pocH-100i 自动血液分析仪（Automated Hematology Analyzer）</td><td></td></tr></tbody></table>

用于基因修饰细胞移植的微图案化培养板上类球体细胞的基因转染

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

为了提高细胞移植的治疗效果，开发了一种可注射的基因修饰球状体移植系统。该细胞球状体在涂有温敏性聚合物的微图案化培养板构成的培养系统中制备而成。在培养板上，对应于直径为100 µm的细胞黏附区域，以二维方式规则排列形成多个球状体，周围则被聚乙二醇（PEG）基质包被的非黏附区域所包围。通过降低培养板温度，可轻松将球状体以液体悬浮形式回收，并可通过足够大内径（大于27 G）的注射针头进行注射，且其结构保持良好。基因修饰通过使用原创的非病毒基因载体——聚复合物纳米胶束（polyplex nanomicelle）进行基因转染实现，该载体可在不破坏球状体结构的情况下将基因导入细胞。对于转染了表达荧光素酶基因的原代肝细胞球状体，在移植动物体内可持续获得荧光素酶表达，同时保留肝细胞功能，表现为白蛋白的表达。该系统可适用于多种细胞类型，包括间充质干细胞。

采用聚复合物纳米 micelle 或对照脂质转染试剂12，对由肝细胞或间充质干细胞（MSCs）形成的类球体进行表达海肾荧光素酶（Gaussia luciferase）的质粒DNA基因转染。在微图形化培养板上，与未转染的类球体相比，纳米micelle处理后的类球体结构几乎未发生改变；而使用对照试剂转染后一天，类球体结构则受到显著破坏（图3）。采用纳米micelle进行转染后，白蛋白的分泌以及外源基因（Gaussia 荧光素酶）的表达在近一个月内均保持稳定。然而，当使用对照试剂时，尽管外源基因的表达水平与纳米micelle组相似，但未检测到白蛋白的分泌（图4）12。
使用温敏型微图案化培养板进行类球体回收时，原代肝细胞和间充质干细胞在从冷却的培养板上回收后，其三维结构在悬浮状态下均得到了良好保持（图5）。当类球体通过足够大口径的注射针头（如23 G（400 µm）和27 G（220 µm）针头）时，其结构也得到了良好维持。
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本方案描述了一种使用基因修饰的可注射类器官进行细胞移植的技术。细胞类器官在微图案化培养板上培养，并通过聚plex纳米胶束导入基因后回收。该系统可在移植到宿主动物体内后，使细胞维持其固有功能的同时实现外源基因的长期表达。

为了提高细胞移植的治疗效果，开发了一种可注射的基因修饰球状体移植系统。

本实验的总体目标是利用基因修饰的可注射类固醇进行细胞移植。首先，使用大鼠肝细胞或间充质干细胞（MSCs）在微图案化培养板上制备三维细胞类器官（OIDs）；随后，将聚合物与质粒DNA溶液充分混合，以制备plex纳米修饰的细胞。然后通过将 plex nmy 细胞溶液加入培养基中，对 PHE 进行转染。最后，将培养板置于冰上并吸除脱落的类固醇，从而回收类固醇。最终，将悬浮状态的基因修饰类固醇用于细胞移植，以在宿主动物的移植细胞中实现外源基因的长期表达，同时维持细胞的固有功能。本实验操作由 Ms.Ula、Ms.Yha、Ms.Suzuki、Mr.Matsui 和 Dr.They 在本实验室完成。为了分离肝细胞，使用文本方案中所述的特殊溶液，从门静脉灌注 Sprague-Dawley 雄性大鼠的肝脏。灌注后，再循环胶原酶溶液通过肝脏。灌注完成后，小心取出肝脏，并使用手术刀片轻轻剪碎。然后加入培养基，并通过100微米的尼龙滤网过滤细胞悬液，以去除额外的碎片。将细胞悬液以低速（例如20 ×g）离心1分钟。随后，将含有肝细胞的上清液转移至新的离心管中，再次离心，并重复此步骤，共进行三次。以高速离心肝细胞，例如 50 G 离心 3 分钟，使细胞沉淀，然后使用文本方案中所述的特殊培养基将细胞重悬，浓度为每毫升 4 × 10⁵ 个细胞，以获得大鼠 MSCs。切除股骨和胫骨后，将连接有装有 10 毫升培养基的注射器的 22 号针头插入骨髓腔，冲洗并收集骨髓。将肝细胞或 MSCs 以每孔 4 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 12 孔微图案培养板中，并在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润气氛中孵育。细胞将在微图案黏附区域聚集，并在两天内逐渐形成圆形类固醇结构。在合成文本方案中所述的 peg PASP 支化嵌段共聚物和 PASP 支化均聚物后，通过将聚合物浓度分别调整为 33.3 微克/毫升和 19.1 微克/毫升，配制含有等摩尔比混合残余氨基的溶液，溶剂为 10 毫摩尔 HEPES 缓冲液。然后，按体积比 2:1 将上述预先混合的两种聚合物溶液加入 PDNA 溶液中，并充分混合。孵育细胞72小时，待其形成成熟的细胞球以进行基因转染后，将培养基更换为1毫升新鲜培养基，并向每孔加入100微升plex anom细胞溶液，继续孵育24小时。随后，为回收细胞球，将培养基替换为200微升预冷的PBS，将培养板置于冰上。使用带有23或27号针头的注射器轻柔地吸取细胞，用于体内注射。通过体外高斯荧光素酶转染实验确认球体中的转基因表达。收集50至100微升培养基后，利用商用肾荧光素酶检测系统和发光仪测定培养基中分泌的荧光素酶，以在细胞移植后对麻醉状态下的宿主动物进行转基因表达的体内评估。B-A-L-B-C。根据文本方案，将含有转染了表达荧光素酶的 GL 四质粒 DNA 的细胞悬液 200 微升，注射到裸

gene-transfection-toward-spheroid-cells-on-micropatterned-culture

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

基因转染向着文化微模式球体板细胞基因修饰的细胞移植

本视频介绍了共培养的胰腺癌细胞和成纤维细胞的三维磁性生物打印技术。在磁场作用下，利用生物相容性纳米颗粒组装体对胰腺癌细胞和活化的胰腺成纤维细胞进行共培养并磁化，从而生成球状体。...

磁驱动生物打印三维球体共培养：一种癌细胞与成纤维细胞共培养方法

本视频展示了将人类多能干细胞（hPSCs）转化为球形脑类器官的过程。通过使用特定的抑制剂，引导hPSCs向神经细胞谱系分化，形成神经外胚层样细胞集落。随后引入特殊的生长因子，促进这些细胞集落的自我组织与增殖，最终形成球形脑类器官。...

由人类多能干细胞生成球形体

我们介绍一种利用市售微孔板生成大量（数千至数十万个）尺寸和组分均一可控的肿瘤类球体的实验方案。...

使用微孔板大规模制备尺寸可控的肿瘤球体

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

本文介绍了一种在三维悬浮培养体系中系统培养表皮球体的实验方案。该方案可广泛应用于多种上皮组织类型，并可用于多种人类疾病和病理状态的建模研究。...

建立高通量表皮球体培养系统以模拟角质形成细胞干细胞可塑性

本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。...

组织类球体的生成 通过 一种3D打印的印章状装置

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功能性三维球状体细胞培养的半自动化表型分析

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。...

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

本文提出了一种利用光镊制造杂合类球体的实验方案。该方法能够精确控制类球体形成过程的早期阶段，这是其他方法所无法实现的。...

使用光镊技术生成杂合类球体

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利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

学习利用聚复合纳米胶束对微图案培养板上的3D细胞球体进行基因转染，实现可注射的基因修饰细胞移植。该方法可在宿主动物体内维持长期转基因表达并保持细胞固有功能。

用于基因修饰细胞移植的微图案化培养板上类球体细胞的基因转染

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