Name: CAR性T细胞过继治疗的护理标准胶质母细胞瘤的上下文生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 了解如何在胶质母细胞瘤标准治疗背景下生成EGFRvIII特异性CAR-T细胞并评估其疗效。该方法结合全脑放疗和替莫唑胺，为高级别胶质瘤的免疫治疗研究提供重要实验方案。

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作者谨此感谢 Laura Johnson 博士和 Richard Morgan 博士提供了 CAR 逆转录病毒载体。作者还感谢 Giao Ngyuen 在全脑照射剂量测定方面的协助。本研究得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助项目（1R01CA177476-01）的支持。

本方案基于一项实验设计，即每只小鼠接受 107 个 CAR T 细胞的治疗，共使用 10 只小鼠。这意味着总共需要 108 个 CAR T 细胞；为弥补细胞活力损失，产量应额外多准备 5 × 107 至 1 × 108 个细胞。以下方案的规模设定为生成约 200 × 106 个细胞。随后，将这些细胞通过静脉注射给予雌性 C57BL/6 小鼠，这些小鼠已建立为期 9 天的同系 EGFRvIII 阳性颅内肿瘤，肿瘤来源于现有的 KR158B 星形细胞瘤或 B16 黑色素瘤细胞系。在生成 CAR T 细胞的同时，对荷瘤小鼠给予临床上相关的淋巴清除剂量的替莫唑胺（TMZ，60 mg/kg）和全脑照射（WBI，16.5 Gy）。
小鼠在杜克大学医学中心（DUMC）的无病原体条件下饲养和繁殖。所有动物实验均依照杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。&#160;
1. 对荷瘤小鼠给予替莫唑胺
第0至第4天：
<ol>
	<li>计算需要注射的小鼠总数，并将该数量乘以 0.5，以确定所需 TMZ 溶液的体积（例如， 30只小鼠 × 0.5 ml = 15 ml TMZ，另加1.5 ml以补偿溢出量（共16.5 ml TMZ）。</li>
	<li>将总体积乘以 3 mg/ml，以确定所需冻干 TMZ 的质量（例如， 16.5 × 3 = 49.5 mg TMZ）。将此量称取至50 ml离心管中。 
	警告：替莫唑胺（TMZ）经吸入、摄入以及与眼睛、皮肤和黏膜接触后具有毒性。&#160;咨询所在机构的职业安全和/或环境卫生与健康部门，以获取降低暴露风险的建议。&#160;</li>
	<li>将总体积乘以0.15，以确定所需二甲基亚砜（DMSO）的体积（例如， 16.5 × 0.15 = 2.475 ml DMSO。&#160;通过0.2 µm滤器将此体积的DMSO（另加2 ml以补偿损耗）过滤除菌，收集至无菌离心管中。向TMZ粉末中加入2.475 mL无菌DMSO。</li>
	<li>将TMZ/DMSO溶液置于盛有水的烧杯中，放在65 °C的加热板上加热10–15分钟。待TMZ完全溶解后，溶液应呈淡黄色；若溶液变为粉红色，则表明TMZ已降解，需使用新批次的TMZ重新配制溶液。</li>
	<li>通过将0.85乘以总体积来计算所需无菌生理盐水的适当体积（0.85 × 16.5 ml = 14.025 ml 生理盐水）。加入15 ml无菌&#160;将生理盐水加入50 ml锥形管中。在TMZ溶解于DMSO的同时，将生理盐水加热至65 °C。</li>
	<li>涡旋TMZ/DMSO溶液以确保TMZ粉末完全溶解，然后缓慢加入预热的生理盐水至TMZ/DMSO溶液中。</li>
	<li>制备后立即用 TMZ 溶液完全填充15支1 ml结核菌素注射器，用于给予成瘤4天的小鼠。</li>
	<li>在第1至第4天重复此操作，共进行五次TMZ给药。</li>
</ol>
2. 荷瘤小鼠的全脑照射
第2至第4天：
<ol>
	<li>开启X射线辐照仪并使其预热至全电压。确保已安装适当的滤片，并输入正确的电压和电流设置（图2A）。 
	注意：应事先确定辐照仪的剂量测定参数，以确定合适的电压设置和网格布局（图2A,B）。</li>
	<li>计算实现5.5 Gy X射线辐照所需的时间。例如，若X射线以2 Gy/min的速率递送，则需2.75分钟以递送总计5.5 Gy的剂量。输入相应的时间持续时间。 
	注意：表2提供了小鼠全身辐照（WBI）剂量及其在人体中的临床等效剂量。在高级别胶质瘤的治疗背景下，临床上的标准治疗方案为分次给予60 Gy的全身辐照（每次2 Gy，每周5天，持续6周），而本实验中使用的小鼠等效剂量为16.5 Gy（5.5 Gy × 3）。</li>
	<li>通过将2 ml氯胺酮和1 ml赛拉嗪加入17 ml生理盐水中，配制新鲜的&#160;氯胺酮/赛拉嗪溶液用于全身麻醉，使终浓度为10 mg/ml氯胺酮和1 mg/ml赛拉嗪。&#160;</li>
	<li>称量小鼠体重，并按每克体重10 μl的剂量腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪溶液，使动物接受的氯胺酮剂量为100 mg/kg，赛拉嗪剂量为10 mg/kg。在注射氯胺酮/赛拉嗪后2分钟内，小鼠应完全镇静并可见呼吸。</li>
	<li>为维持镇静动物的眼部湿润，轻轻将少量人工泪液软膏涂抹于每只眼睛表面。</li>
	<li>将镇静后的小鼠放置于网格上，使其头部位于接收X射线强度最高的区域（图2B,C）。使用适当尺寸的铅管遮蔽颈部以下的身体部位，以阻断全身性X射线照射（图2D）。</li>
	<li>将定位好的小鼠置于X射线束下，使指示X射线束焦点的激光位于网格布局的坐标（0,0）处。开始X射线照射。</li>
	<li>完成X射线照射后，将动物从辐照仪中取出并放置于温热的加热垫上。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得将其与清醒动物同笼饲养。一旦动物能够维持胸卧位，即可将清醒动物放回相应的饲养笼中。</li>
	<li>在第3天和第4天重复此操作，共完成三次分次剂量的放射处理。</li>
</ol>
3. 转染
第 -1 天：
<ol>
	<li>在500 ml的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 ml胎牛血清（FBS），配制D10培养基。</li>
	<li>通过向500 ml RPMI-1640培养基中加入5.5 ml L-谷氨酰胺、5.5 ml丙酮酸钠、5.5 ml非必需氨基酸和5.5 ml青霉素/链霉素（pen/strep），配制T细胞培养基（TCM）。接着加入550 μl 2-巯基乙醇和550 μl庆大霉素。最后加入50 ml胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>收获 体外 培养 HEK293T 细胞，并调整浓度至 7.5 × 106 细胞/毫升，D10培养基</li>
	<li>在16个聚-D-赖氨酸（PDL）包被的10 cm培养皿中，每皿加入10 ml D10培养基和1 ml HEK293T细胞悬液。</li>
	<li>37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜2.</li>
</ol>
第0天：
<ol start="6">
	<li>转染细胞前至少30分钟，用10 ml新鲜D10培养基更换原有培养基。</li>
	<li>根据所需转染的培养板总数加1（16 + 1 = 17），计算所需的载体质粒、pCL-Eco载体和脂质体转染试剂的用量：每板需14.1 μg载体质粒（14.1 × 17 = 239.7 μg）、9.9 μg pCL-Eco载体（9.9 × 17 = 168.3 μg）和60 μl脂质体转染试剂（60 × 17 = 1,020 μl）。所有试剂在配制前应平衡至室温。</li>
	<li>标记两个离心管分别为A和B。在A管中加入239.7 μg载体质粒和168.3 μg pCL-Eco载体至(1.5 × 17) ml低血清改良Eagle培养基（RS-MEM）中；在B管中加入1020 μl脂质体转染试剂至(1.5 × 17) ml RS-MEM中。</li>
	<li>将A管和B管分别在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将A管和B管内容物轻柔混合（涡旋1–2秒或反复倒置数次），室温孵育20分钟，以形成脂质体/DNA复合物。</li>
	<li>将脂质体/DNA复合物逐滴加入10 cm培养皿中的HEK293T细胞中。</li>
	<li>在37 °C孵育6–8小时或过夜（不得超过24小时）。</li>
	<li>孵育6–8小时后，弃去原培养基，加入12 ml新鲜TCM以进行病毒生产。此培养基将在第2天用作T细胞转导的病毒上清液。</li>
</ol>
4. 脾切除与T细胞制备
第0天：
<ol>
	<li>将10 ml TCM倒入50 ml离心管中，置于冰上，用于脾脏采集。</li>
	<li>通过 CO 处死适当数量的动物2 窒息与二次断头：将动物置于通入CO的笼中2 以流速&#160;10-30% 笼体体积/分钟，依据美国兽医协会（American Veterinary Medical Association）指南（每次同时处死动物不得超过5只），持续至呼吸停止后再维持两分钟。将动物从CO₂环境中移出2 取出小室并断头处死。 
	注意：一只6-12周龄雌性C57BL/6小鼠的脾脏可获得约4.5-5 x 10⁷个细胞7 脾细胞。此处将收获4只脾脏，以获得约200 × 10⁶个细胞6 细胞</li>
	<li>将小鼠右侧朝上放置，用70%乙醇喷洒。用镊子夹住左侧肋骨下方的一小褶皮肤，用剪刀剪出一个小切口。将皮肤向后剥离，小心用镊子夹住腹膜的一小褶，剪开一个小口。</li>
	<li>脾脏是一个小而细长、呈深红色的器官，形似扁豆；用镊子轻轻夹住脾脏，剪除周围结缔组织将其分离。将分离的脾脏放入含有10 ml TCM并置于冰上的锥形管中。</li>
	<li>将脾脏置于70 μm细胞筛网上，用5 ml注射器内芯的钝端按压研磨，以制备单细胞悬液。每个细胞筛网最多处理两个脾脏。</li>
	<li>使用少量 TCM 轻柔冲洗解离后的滤网，以收集残留的脾细胞。将所有解离后的脾组织合并为单细胞悬液。用 TCM 补充至终体积 50 ml，进行一次洗涤，300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>通过将5 ml 10x裂解缓冲液加入45 ml无菌水中，配制1x裂解缓冲液溶液。为去除红细胞，每只脾脏用5 ml 1x裂解缓冲液重悬沉淀，置于50 ml锥形管中，通过轻轻吹打充分混匀。若脾脏数量超过5只，使用250 ml离心管。将锥形管或离心管置于37 °C水浴中5分钟。</li>
	<li>从水浴中取出裂解反应液，按1:1比例加入TCM以中和反应。在300 × g离心10分钟进行洗涤。</li>
	<li>吸弃上清液，用移液器上下吹打，将沉淀在TCM中充分重悬（每脾2 ml，4个脾共8 ml）。</li>
	<li>将10 μl细胞悬液加入190 μl台盼蓝溶液中（1:20稀释），进行细胞计数。将四个带网格方格中其中一个方格内计得的细胞数乘以20 × 104 x 总体积（8 ml）以获得总细胞数（例如， 125 个细胞 × 20 × 104 x 8 ml = 200 x 106 脾细胞</li>
	<li>将细胞稀释至浓度为 2 x 106 细胞/ml，加入2 μg/ml刀豆蛋白A（ConA）和50 IU/ml重组人白细胞介素-2（rhIL-2）。因此，对于200 × 106 脾细胞，向8 ml细胞中加入92 ml培养基、200 μg ConA和5,000 IU rhIL-2。</li>
	<li>向24孔组织培养处理板的每孔中加入2 mL细胞悬液，使细胞密度为4 x 10⁵个细胞/mL6 每个孔中的细胞数量（例如， 100 ml 细胞大约需要 4 块培养板。</li>
	<li>37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2.</li>
</ol>
5. 转导
第1天：
<ol>
	<li>根据收获的脾脏数量乘以2，计算转导所需的非组织培养处理的24孔板数量（4个脾脏需要8块板）。</li>
	<li>接着，通过（总孔数 + 3）× 0.5 ml 计算包被所需重组人纤连蛋白片段（RHFF）溶液的总体积（8块板 × 24孔 = 192 + 3 = 195）× 0.5 ml = 97.5 ml。</li>
	<li>通过将总体积乘以25 μg/ml，配制含25 μg/ml RHFF的97.5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）（97.5 × 25 = 2437.5 μg），将此量的RHFF加入97.5 ml PBS中。</li>
	<li>向每个孔中加入0.5 ml PBS/RHFF溶液，对非组织培养处理的24孔板进行包被。</li>
	<li>在4 °C下孵育过夜。</li>
</ol>
第2天：
<ol start="6">
	<li>从未经组织培养处理的24孔板中弃去PBS/RHFF溶液。</li>
	<li>每孔加入1 ml含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，室温孵育30分钟。</li>
	<li>将孔板倒置彻底倾去BSA溶液，然后每孔加入2 ml PBS进行洗涤。</li>
	<li>收集病毒上清液：将每个HEK293T PDL孔板中的培养基转移至250 ml离心管中，500 × g离心10分钟。</li>
	<li>小心地将病毒上清液转移至新的250 ml离心管中，注意不要扰动可能形成的细胞沉淀。</li>
	<li>向病毒上清液中加入新鲜TCM，使最终体积比RHFF包被孔所需体积多3 ml。例如，对于192个RHFF包被孔，将病毒上清液体积补至192 + 3 ml = 195 ml。</li>
	<li>从培养箱中取出培养的脾细胞，通过轻柔吹打每孔2–3次使其重悬，然后转移至250 ml锥形离心管中。若使用多通道移液器，可在转移前使用无菌储液槽以加快操作速度。按前述方法计数，并在300 × g下离心10分钟。</li>
	<li>向病毒上清液中加入重组人IL-2（rhIL-2），终浓度为50 IU/ml。例如，在195 ml病毒上清液中加入50 × 195 = 9,750 IU的rhIL-2。</li>
	<li>将脾细胞以1 × 106 个细胞/ml的密度重悬于病毒上清液中。</li>
	<li>每孔加入1 ml脾细胞悬液至RHFF包被的24孔板中。</li>
	<li>按照以下条件离心90分钟：770 × g，加速度 = 4，刹车/减速度 = 0，温度32 °C。</li>
	<li>配制含50 IU/ml rhIL-2的TCM溶液。例如，通过加入10,000 IU rhIL-2配制200 ml TCM溶液。离心后每孔加入1 ml rhIL-2/TCM混合液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。</li>
</ol>
6. CAR T 细胞培养与收获
第3天和第4天：
<ol>
	<li>若T细胞融合度达到&#62;80%，可进行细胞传代（通常发生在第3天或第4天）。传代时，轻轻吹打每孔细胞2-3次，将每孔中的1 ml细胞悬液转移至新的24孔组织培养板的新孔中。然后，向每孔加入1 ml含50 IU/ml IL-2的新鲜TCM，使每孔终体积为2 ml。</li>
	<li>若细胞未达到&#62;80%融合度，则进行半量换液：缓慢从每孔上层吸去1 ml培养基，注意避免扰动沉降至底部的细胞。随后向每孔加入1 ml含50 IU/ml rhIL-2的新鲜TCM。</li>
</ol>
第5天：
<ol start="3">
	<li>通过轻轻吹打每孔细胞上下3次，重悬CAR T细胞，并转移至250 ml离心管中。在300 × g下离心10分钟。</li>
	<li>彻底吸除上清液，避免扰动沉淀。用PBS洗涤一次，按前述方法计数细胞，再用PBS进行第二次洗涤。典型的CAR T细胞产量约为每孔1 × 106个细胞（8块板 × 24孔 = 192 × 106个CAR T细胞）。</li>
	<li>将细胞重悬于PBS中，浓度为5 × 107/ml，用于注射体积为200 μg时含1 × 107个细胞（例如，对于192 × 106个CAR T细胞，将洗涤后的沉淀重悬于3.84 ml PBS中）。</li>
</ol>
7. 向荷瘤小鼠给予CAR T细胞
第5天：
<ol>
	<li>将细胞置于冰上运输至动物实验设施，用于静脉注射。用27–31 G针头的胰岛素注射器吸取500–1,000 μl细胞悬液，确保排尽所有气泡。</li>
	<li>抓住小鼠尾根部，将其放入固定管中。</li>
	<li>拉直尾部，使静脉面朝上，将针头平行于尾静脉方向，轻轻滑入皮肤下方约1–2 mm进入静脉。缓慢向静脉内推注200 μl液体。若针头正确进入静脉，液体将顺畅流入；若感到阻力，则说明位置不当，需将针头退出尾部并重新正确插入。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

此处描述的治疗时间线旨在模拟临床标准治疗方案，并利用其效应来增强CAR过继性治疗的效果。CAR T细胞剂量、替莫唑胺（TMZ）给药方案以及放射治疗的实施均可进行调整，以增强in vivo T细胞活性、淋巴细胞清除和肿瘤杀伤作用。TMZ方案可加强以实现宿主骨髓消融，从而促进过继转移细胞的扩增30。此外，TMZ的淋巴清除效应可通过低剂量（4–6 Gy）单次全身照射（TBI）来模拟，从而规避标准治疗方案（SOC）中的肿瘤杀伤特性。本研究中采用的放疗方案模拟了生物学等效剂量60 Gy；然而，分次次数和每次剂量可进行调整，以模拟其他临床剂量（表2）。重要的是，我们的标准治疗（SOC）模型采用的是全脑照射（WBI）的生物学等效剂量，而非临床上常用于肿瘤及其边缘区域的局部外照射放疗，因此可能导致对肿瘤的照射剂量较低，同时增加对健康小鼠脑组织毒性的风险。尽管存在这些局限性，全脑照射（WBI）仍是一种在临床前环境中模拟临床放疗的公认技术。
可通过增加或减少CAR T细胞剂量，观察其对肿瘤杀伤效果和总体生存率的影响11...

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，且 invariably 致命。手术切除联合非特异性的标准护理化疗和放疗无法完全清除恶性细胞，导致该病患者的预后极差，中位生存期不足15个月1。相比之下，免疫治疗提供了一种精确靶向肿瘤细胞的方法，因此有望成为一种高效且对周围组织毒性风险较低的治疗平台2-4。通过体外（ex vivo）基因工程改造表达嵌合抗原受体（CARs）的T细胞，为肿瘤免疫治疗提供了一种多功能策略。CAR通过将抗体的胞外可变区与一个或多个胞内T细胞信号分子融合而成，从而替代全长的主要组织相容性复合体（MHC）限制性T细胞受体5。这种类似抗体的抗原识别模式使得反应性抗原特异性T细胞能够在无MHC参与的情况下识别并响应肿瘤抗原，并可针对几乎无限的抗原谱系进行适配。
针对多种肿瘤抗原改造的CAR T细胞已在临床前研究中显示出疗效，并在临床应用中展现出巨大前景6-9具体而言，在胶质母细胞瘤（GBM）背景下，一种CAR T细胞平台靶向表皮生长因子受体变异体III（EGFRvIII），该变异体为在细胞表面表达的肿瘤特异性突变10可延长荷瘤胶质瘤小鼠的生存期11然而，尽管CAR过继疗法具有多功能性，但其临床效益尚未完全实现，部分原因在于肿瘤相关的免疫抑制和免疫逃逸12-16 以及在建立和维持抗原特异性T细胞方面面临的挑战 体内将标准治疗方案（SOC）与免疫治疗相结合，有望克服上述多种局限性，从而在临床前和临床环境中提高疗效。
术后胶质母细胞瘤（GBM）的标准治疗方案（SOC）包括高剂量替莫唑胺（TMZ），一种DNA烷基化剂。17以及全脑照射（WBI）1这些治疗措施被认为可通过上调肿瘤MHC表达，与肿瘤疫苗产生协同作用18-20 以及死亡肿瘤细胞释放抗原17,19,21,22。事实上，添加TMZ20,23 或 WBI18,24 在临床前研究中，可增强基于免疫治疗的抗肿瘤疗效。此外，与许多非特异性细胞毒化疗药物类似，TMZ 已知可引起全身性淋巴细胞减少25,26，可被用作过继治疗平台的宿主条件化手段27-29. TMZ介导的淋巴细胞耗竭已被证明可提高抗原特异性T细胞的频率和功能，从而增强过继性治疗平台对抗颅内肿瘤的疗效30在CAR治疗背景下，淋巴细胞清除通过减少内源性抑制性T细胞的数量，起到宿主预处理的作用31，以及诱导稳态增殖32 通过降低对细胞因子的竞争33从而增强抗肿瘤活性11,34鉴于胶质母细胞瘤标准治疗（GBM SOC）与免疫治疗平台之间存在的协同作用，在标准治疗背景下评估新型过继性疗法和疫苗平台对于得出有关疗效的有意义结论至关重要。
在本实验方案中，我们概述了一种针对携带 EGFRvIII 阳性颅内肿瘤的小鼠，联合使用小鼠 EGFRvIII 特异性 CAR T 细胞、替莫唑胺（TMZ）和全脑照射（WBI）的制备及静脉给药方法（治疗时间线见图 1）。简言之，CAR T 细胞通过逆转录病毒转导在体外（ex vivo）制备。使用 DNA/脂质复合物（包含 CAR 载体和 pCL-Eco 质粒）转染人胚肾（HEK）293T 细胞以产生病毒，随后用该病毒转导已激活的小鼠脾细胞，这些脾细胞被平行地分离并培养。在 CAR 细胞制备期间，携带 EGFRvIII 阳性颅内肿瘤的小鼠接受分次全脑 X 射线照射以及全身性 TMZ 治疗，其剂量相当于临床标准治疗（SOC）。随后，将 CAR T 细胞通过静脉途径递送至淋巴细胞耗竭的宿主小鼠体内。
以下实验流程分为七个独立阶段：（1）对荷瘤小鼠给予替莫唑胺，（2）对荷瘤小鼠进行全脑照射，（3）转染，（4）脾切除与T细胞制备，（5）转导，（6）CAR T细胞培养与收获，以及（7）向荷瘤小鼠施用CAR T细胞。这些阶段包含多个步骤，持续6至7天，并行进行。

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco 逆转录病毒包装载体</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>用于生成CAR逆转录病毒的辅助载体</td></tr><tr><td>刀豆蛋白A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>非特异性有丝分裂原，用于诱导T细胞增殖和病毒转导</td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>促进T细胞的逆转录病毒转导</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，丙酮酸</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>HEK293细胞培养基</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>T细胞培养基</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 减血清培养基</td><td>Life technologies</td><td>11058-021</td><td>转染培养基</td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>T细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td>T细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>100X MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Life technologies</td><td>11140-050</td><td>T细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>55 mM 2-巯基乙醇</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td>清除自由基的还原剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>T细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>庆大霉素（50 mg/ml）</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td>T细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>GemCell 美国来源胎牛血清</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>为&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;细胞生长提供生长因子和营养物质</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分&amp;ndash;标准级</td><td>Gemini Bio Products</td><td>700-100P</td><td>阻断逆转录病毒在Retronectin包被板上的非特异性结合</td></tr><tr><td>Pharm Lyse（10倍浓缩液）</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>在脾细胞处理过程中裂解红细胞</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 无菌细胞筛</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>在脾细胞处理过程中过滤掉大块组织颗粒</td></tr><tr><td>100 mm 多聚-D-赖氨酸包被培养皿</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>促进HEK293细胞贴壁，以实现转染后最大增殖</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>替莫唑胺</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>在给药当天配制的冻干粉末</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D2650</td><td>完全溶解替莫唑胺所必需</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>替莫唑胺和氯胺酮/赛拉嗪的溶剂</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>氯胺酮溶液</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>赛拉嗪无菌溶液，100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的car t细胞的制备

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

过继性T细胞免疫治疗为特异性靶向并清除恶性胶质瘤提供了一种有前景的策略。T细胞可在体外（ex vivo）通过基因工程改造，表达针对胶质瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR T细胞）。标准治疗方案中的化疗和放疗具有淋巴清除和杀瘤效应，可增强过继转移的CAR T细胞的扩增与功能。本文描述了一种生成靶向EGFRvIII（一种胶质瘤特异性抗原）的CAR T细胞的方法，并评估其与小鼠胶质母细胞瘤标准治疗模型联用时的疗效。T细胞通过逆转录病毒载体转导，携带抗EGFRvIII的CAR基因进行工程化改造。荷瘤动物接受替莫唑胺治疗及全脑照射，其剂量方案设计用于模拟临床标准治疗，以进行宿主预处理。随后将CAR T细胞经静脉注射至预处理后的宿主。该方法可用于在标准治疗背景下评估CAR T细胞的抗肿瘤疗效。

CAR T 细胞通过 EGFRvIII CAR 逆转录病毒载体转导生成11。该载体 MSGV1 是由 SFGtcLuc_ITE4 载体发展而来35，后者包含小鼠干细胞病毒（MSCV）长末端重复序列、延长的 gag 区域和包膜剪接位点（剪接供体 sd 和剪接受体 sa），以及病毒包装信号（ψ）。携带人源抗 EGFRvIII 单链可变区片段（scFv）139 的 EGFRvIII CAR，与小鼠 CD8TM、CD28、4-1BB 和 CD3ζ 胞内区串联排列，被克隆至逆转录病毒载体 NcoI 位点的下游（图 3）。
转导后，可通过流式细胞术对CAR T细胞进行定量和表型分析。EGFRvIII CAR T细胞可使用双色抗体组合进行检测，该组合包括与藻红蛋白（SA/PE）偶联的生物素化EGFRvIII来源多聚体以及抗CD3 FITC抗体。采用本文所述的培养与转导方案，我们通常可在55%–70%的小鼠脾细胞中检测到CAR表达（图4A）11。此外，也可使用山羊抗...

化疗和放疗作为标准治疗手段，具有淋巴清除和免疫调节作用，可被用于增强T细胞免疫治疗的抗肿瘤疗效。本文概述了一种生成针对EGFRvIII特异性的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并介绍了在胶质母细胞瘤标准治疗背景下给予该细胞的实施方案。

在胶质母细胞瘤标准治疗背景下用于过继性治疗的CAR T细胞的制备

过继性T细胞免疫疗法为特异性靶向并清除恶性胶质瘤提供了一种有前景的策略。T细胞可在体外经过基因工程改造……

本实验的总体目标是生成经过基因修饰的小鼠嵌合抗原受体T细胞，并在标准护理治疗背景下评估其疗效。对于高级别胶质瘤，首先对小鼠实施标准护理治疗，包括全脑放射和替莫唑胺给药。接着，制备表达CAR载体的逆转录病毒，然后用该逆转录病毒转导小鼠T细胞。最后，将CAR T细胞递送至接受标准治疗的小鼠体内，最终实现CAR T细胞与全脑照射及替莫唑胺联合使用。该给药方案用于检测标准治疗对宿主的预处理是否能够增强过继性T细胞治疗平台的疗效。该方法有助于回答脑肿瘤免疫治疗领域中的关键问题，例如在高级别胶质瘤的标准治疗背景下，新型免疫疗法的抗肿瘤效果如何。尽管该方法可为基因修饰的 mi 和 T 细胞抗高级别胶质瘤的效果提供见解，但它也可应用于其他系统，例如评估 T 细胞疗法对抗黑色素瘤、肺癌及其他脑转移瘤模型的效果。通常情况下，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为该实验流程需要同时进行多个步骤。因此，规划和组织任务至关重要。本实验操作将由本实验室两位优秀的研究生 Catherine Uni 和 Carter s Deva 演示。将替莫唑胺（temozolomide）或 TMZ 用 DMSO 配制成 3 毫克/毫升的溶液后，置于盛水的烧杯中，在 65 摄氏度的加热板上加热 10 至 15 分钟。当TMZ完全溶解后，溶液应呈现淡黄色。用TMZ溶液完全装填15个1毫升注射器。TMZ应在配制后90分钟内给予，以确保无TMZ从溶液中析出。启动X射线辐照仪的全脑照射功能并预热，确保已安装适当的滤光片，并输入正确的电压和电流设置。按照文本方案，待小鼠麻醉后，将其放置在网格上，头部置于接收X射线强度最高的区域。使用铅管遮挡从小鼠颈部以下的身体部位，以阻断全身性X射线照射。X射线照射完成后，将小鼠放入X射线机内。将动物从辐照仪中取出。当动物恢复足够的意识并能够维持胸卧位时，将其放回相应的笼子中。根据文本方案配制 D 10 培养基并收获 HEC 2 93 T 细胞后，将 1 毫升浓度为 7.5 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液加入每个含有 10 毫升 D 10 培养基的 10 厘米聚-L-赖氨酸包被培养皿中，次日继续孵育过夜。按照文本方案中所述准备慢病毒质粒和转染试剂后，将脂质-DNA复合物逐滴加入HEK 293T细胞中，孵育六至八小时。然后将培养基更换为12毫升新鲜T细胞培养基（TCM）。接下来，将一只脾脏置于70微米孔径的细胞筛网上，使用5毫升注射器内芯的钝端研磨，以制备单细胞悬液。新鲜配制TCM混合液后，将分散的脾脏组织置于含有TCM的50毫升锥形管中，离心收集细胞沉淀。每只脾脏使用5毫升1×裂解缓冲液去除红细胞，通过轻轻吹打充分重悬细胞。将细胞悬液置于37摄氏度水浴中5分钟。从水浴中取出裂解反应液，按1:1比例加入TCM以中和反应，随后以300 ×g离心10分钟进行洗涤。吸去上清液后，每只脾脏使用2 mL TCM重悬细胞沉淀。取10 μL细胞悬液加入190 μL台盼蓝中，用于细胞计数。待计算出细胞总数后，使用添加了2 μg/mL刀豆蛋白A（conna A）和50 IU/mL重组人白细胞介素-2的TCM将细胞稀释至浓度为2×10⁶个细胞/mL。每孔加入2 mL（即4×10⁶个细胞）至24孔组织培养板中，于脾切除术后的第二天，在37°C、5% CO₂条件下培养过夜。配制含有每毫升25微克的PBS溶液。将重组人纤连蛋白片段（RHFF）加入未经组织培养处理的24孔板中，每孔加入0.5毫升该溶液，次日进行包被。移除孔内溶液，每孔加入1毫升含2% BSA的PBS溶液，在室温下孵育30分钟。然后，在加入 2 毫升 PBS 洗涤前，将培养板彻底倒置以去除 BSA。从 HEC 2 93 T 细胞收集病毒上清液后，加入新鲜 TCM，最终体积（毫升）等于包被的 RHFF 孔数再加额外 3 毫升。将培养的脾细胞从培养箱中取出，通过在每个孔中轻柔地吹打 2 至 3 次重新悬浮。将细胞悬液转移至50毫升锥形管中。接着，用病毒上清液重悬细胞，使其浓度为每毫升1×10⁶个细胞。然后，将每毫升完全悬液加入RHFF包被板的各孔中，每孔1毫升。现在将培养板在32摄氏度、770 ×g 条件下离心90分钟，加速度设为4，离心过程中刹车设定为0。在TCM中配制50国际单位/毫升的重组人IL-2。离心结束后，向每孔中加入1毫升培养基，过夜培养。若T细胞融合度超过80%，则通过轻柔吹打每个孔内的细胞上下混合2至3次，进行细胞传代。然后从每个孔中转移1毫升细胞悬液至新的24孔组织培养板的孔中。向每个孔中加入1毫升新鲜TCM培养基，并添加50国际单位/毫升的IL-2。若细胞融合度未超过80%，则更换一半培养基：缓慢从每个孔的上层吸出1毫升培养基，然后加入1毫升含50国际单位/毫升重组人IL-2的新鲜TCM。通过在每个孔中轻柔吹打上下混合3次重悬CAR-T细胞，随后转移至250毫升离心管中。在300 ×g条件下离心细胞10分钟。随后，彻底吸除上清液，注意不要扰动沉淀。使用PBS洗涤细胞，计数后再次进行第二次洗涤。典型的CAR T细胞产量约为每孔1 × 10⁶个细胞（使用PBS重悬）。将细胞悬浮于浓度为5 × 10⁷个/毫升的溶液中，用于注射；每只荷瘤小鼠注射1 × 10⁷个细胞，体积为200 µL。使用27至31号针头，将500至1000 µL液体装入胰岛素注射器中，并确保完全排出所有气泡。CAR T细胞通过用E GFR V3 CAR逆转录病毒载体转导生成，该载体包含鼠类干细胞病毒（MSCV）的长末端重复序列（LTR）。扩展的gag区域、包膜剪接位点以及病毒包装信号。将含有人源抗EGFRvIII单链可变区片段（scFv）139的EGFRvIII CAR，与小鼠CD8跨膜区、CD28胞外区、4-1BB共刺激区以及CD3ζ胞内区串联克隆至逆转录病毒载体中。转导后，可通过流式细胞术使用双色抗体组合对EGFRvIII CAR T细胞进行定量和表型分析，该抗体组合包括STRT生物素偶联的生物素化EGFRvIII多聚体以及抗CD3-FITC抗体。根据本视频所述方案，通常可在55%至70%的CD3阳性小鼠T细胞中检测到CAR的表达。通过向本示例中的双色CAR检测面板添加其他荧光标记抗体，可进一步对CAR T细胞进行表型分析。CD8和CD4染色结果显示，70%的转导CAR细胞为CD8阳性T细胞，而20%为CD4阳性T细胞。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一周时间内用12小时完成。按照本方案，还可开展其他方法，如ELISA、ELISpot和/或胞内细胞因子染色，以回答更多科学问题。例如，您的嵌合抗原受体转导T细胞在功能上是否能够响应抗原识别？其功能是否具有抗原特异性？请务必注意，操作逆转录病毒、替莫唑胺和X射线辐射可能具有极高危险性，必须采取相应的防护措施，例如在生物安全二级（BSL-2）条件下操作，穿戴个人防护装备，在指定区域进行实验，并接受动物操作的正规培训。进行这些操作时，应始终注意X射线设备的使用。

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CAR性T细胞过继治疗的护理标准胶质母细胞瘤的上下文生成

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