Name: 实验诱发青光眼通过磁性微球注射眼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 了解通过向大鼠眼前房注射磁性微球诱导高眼压的实验方法。该技术可建立稳定的青光眼模型，用于研究视网膜神经节细胞死亡及视神经退行性病变。

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我们感谢 Peter Munro 博士在视神经切片方面提供的帮助。本研究由医学研究理事会（G0901303）资助，并部分得到多萝西·霍奇金研究生奖/医学研究理事会、海伦·汉姆林信托基金、Fight for Sight 以及 Moorfields 特别信托基金的支持。

伦理声明所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行，并依据英国政府内政部指南获得批准（<a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a>，最后访问于10th 2014年6月）以及眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明（<a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a>，最后访问于10th 2014年6月
1. 诱导眼压升高
<ol>
	<li>通过向布朗挪威大鼠前房单侧注射顺磁性微球以升高眼内压（IOP），诱导实验性青光眼，该方法基于Samsel的实验方案 等3&#160;其他有色大鼠品系可能也适用，但需由使用者首先进行验证。</li>
	<li>将250–300 g的雌性退役Brown Norway大鼠饲养于恒定低光照环境（40–60 lux）中，以尽量减少眼内压（IOP）的昼夜波动7，可自由获取食物和水 随意.</li>
	<li>在清醒动物中测量基线眼内压8 在麻醉和微珠注射之前，使用经校准用于大鼠眼睛的回弹式眼压计9眼压（IOP）取五次测量读数的平均值。</li>
	<li>以37.5 mg/kg氯胺酮和0.25 mg/kg盐酸美托咪啶腹腔注射麻醉大鼠。在应用聚维碘酮（见步骤1.5）和微珠注射（见步骤1.8）前，通过检测动物后肢足底反射确认麻醉深度。给予0.5%盐酸丙帕卡因进行镇痛。 
	注意：任何步骤中均不得散大瞳孔。这有助于微珠更好地沉降到虹膜角膜角，并防止其与晶状体粘连。对未手术的对侧眼使用眼膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>用5%聚维酮碘冲洗手术眼&#160;水10 注射前5分钟。</li>
	<li>5分钟后，使用无菌纱布吸除聚维酮碘，并用0.9%无菌生理盐水冲洗眼睛。麻醉期间需定期滴加无菌生理盐水以保持眼部湿润。</li>
	<li>将环形磁铁放置在眼睛周围。</li>
	<li>使用33 G斜面针头，向眼前房注入25 μl含有30 mg/ml经γ射线辐照灭菌的8 μm磁性微球的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）。
	<ol>
		<li>为制备磁珠，用1 ml HBSS重悬后，在10,000 × g离心5分钟，重复洗涤3次，最后配制成30 mg/ml的溶液。全程保持无菌条件。</li>
		<li>注射时需小心避免将针头刺入虹膜，以尽量降低虹膜损伤的风险。可通过将针头沿角膜表面切线方向进针，尽可能与虹膜平行，以防止上述情况发生。此操作也有助于减少注射部位微珠的流失。 
		注意：注射微珠时应快速进行，以确保其在虹膜角膜角周围均匀分布，这对于升高眼内压（IOP）至关重要。此外，应将微珠、针头和磁环分别存放，以防止微珠聚集形成团块，导致难以装入注射器和注射，同时避免针头被磁化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射后将针头留置1分钟，以确保微珠沉降至虹膜角膜角，阻塞小梁网的房水引流。待微珠初步沉积后，轻微倾斜针头，使少量房水渗出，以尽量减少眼内压的短暂升高。手术结束时，依次用磷酸盐缓冲液（PBS）、70%乙醇和蒸馏水冲洗针头，以确保其可在后续不同操作中继续使用。&#160;或者，如果具备合适规格的针头和注射器组合，也可使用一次性针头。可选：&#160;可使用修针器对针头进行磨锐以延长其使用寿命。</li>
	<li>在此阶段，如有必要，可移除磁铁，并用其将磁珠引导至覆盖不完全的区域。</li>
	<li>注射后将磁铁保留在眼部周围10分钟，以确保微珠充分沉降至虹膜角膜角。</li>
	<li>使用0.25 mg/kg盐酸阿替美唑进行麻醉逆转。</li>
	<li>局部使用氯霉素或其他抗生素软膏（如庆大霉素或土霉素）以预防感染，并使用0.5%盐酸丙帕卡因进行镇痛。将动物置于加热垫上恢复，直至其恢复活动能力，随后转移至保温箱，并提供额外营养，例如食物补充剂或湿润的常规饲料，直至完全恢复。术后24小时若动物表现出疼痛迹象，应给予全身性或局部镇痛治疗。若症状经治疗后仍持续存在，应实施人道终点处死。</li>
	<li>使用对侧眼作为未手术对照。</li>
	<li>在注射微球后每2-3天测量一次眼压，此后继续每2-3天测量一次，使用经校准适用于大鼠眼睛的回弹式眼压计进行测量9.</li>
	<li>纳入研究的眼睛需符合以下标准：1）眼内压（IOP）较对侧对照眼升高5 mmHg以上；2）眼内压不超过60 mmHg。</li>
	<li>眼压已恢复至基线水平的眼（通常在注射后1周内恢复）不应纳入研究。然而，若需要，可对未出现高眼压的眼再次注射微珠。</li>
	<li>以 CO₂ 处死动物2 实验结束时实施窒息处死。</li>
	<li>解剖眼球和视神经，并在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，以进行后续组织学分析。</li>
</ol>
2. 使用TUNEL染色评估视网膜神经元损伤
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）检测法对整体视网膜中的凋亡细胞进行定量。</li>
	<li>从眼球杯中分离视网膜，用含0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（T-PBS）清洗3次，每次5分钟。</li>
	<li>在3% T-PBS中对组织进行透化处理，持续2小时。</li>
	<li>将视网膜在平衡缓冲液中预平衡10分钟，随后在TUNEL反应液中37 °C孵育1小时。</li>
	<li>用0.3% T-PBS清洗组织3次，每次5分钟，再用含5 µM DAPI的0.3% T-PBS冲洗，最后封片于封片介质中。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜对整个神经节细胞层进行成像，以20倍放大倍数采集厚度为10 µm的z轴堆栈图像。在每片整体视网膜的4个瓣状区域中，分别在靠近视神经、中周部以及远周部的位置各采集3幅图像，共获得12幅图像，覆盖约7,000个细胞。根据形态学标准区分非神经元细胞（内皮细胞和胶质细胞）与神经元细胞。</li>
	<li>仅使用DAPI通道选择成像区域，并对研究者设盲处理分组信息。</li>
</ol>
3. 使用甲苯胺蓝染色评估视神经损伤
<ol>
	<li>将视神经在4 °C下用Karnovsky’s溶液固定过夜。</li>
	<li>用1% (w/v) 四氧化锇处理样本2小时，然后在100%乙醇中脱水。</li>
	<li>将视神经在环氧丙烷中孵育30分钟，随后置于环氧丙烷:阿拉尔迪特（50:50）混合液中过夜。</li>
	<li>更换为100%阿拉尔迪特，并在60 °C下孵育过夜。</li>
	<li>切取半薄切片（厚度0.75 mm），用含1%甲苯胺蓝/硼砂（TB）的50%乙醇溶液染色，然后进行光学显微镜观察。</li>
</ol>
4. 统计分析
<ol>
	<li>使用适当的统计学软件包进行统计分析。可采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Newman-Keul's事后检验，以计算眼内压（IOP）随时间变化的统计学显著性。</li>
	<li>以p值小于0.05为具有统计学意义。</li>
</ol>

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li>
<li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li>
<li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%3A+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li>
<li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li>
<li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li>
<li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li>
<li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li>
<li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+application+of+povidone-iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li>
<li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li>
<li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li>
</ol>

David T. Shima 是瑞士霍夫曼-罗氏公司的一名员工。其余作者声明他们不存在竞争性经济利益。

本文展示了一种通过将磁性微球注入大鼠眼前房以诱导眼内压（IOP）升高的方法。该方法操作简便，几乎无需复杂的外科技术，也无需长时间的练习与优化。此外，该方法效果显著，通常仅需一次微球注射即可引起明显且稳定的升压反应（重复注射率约为10%）。与现有的可诱导方法相比，该方法可能具有优势，例如相较于技术难度较高的巩膜上静脉硬化11模型或激光光凝术方案6，后者往往需要多次操作以维持眼内压升高。
然而，为了确保该方法的成功，有一些关键的细微步骤需要注意。首先，使用环形磁铁将微珠吸引至虹膜角膜角是有帮助的。此步骤是对原始方案的改进，原始方案中微珠被注入前房后，需手动在眼球周围移动3。使用环形磁铁可使微珠在房角周围均匀沉降，从而减少手动重新分布的需要。其次，注射速度应较快——若注射过慢，微珠将主要积聚在房角的一侧，导致覆盖不全，可能无法引起眼压升高。尽管如此，该方法总体较为简便，使用者可轻松对方案进行修改，例如调整微珠颗粒的大小或体积，以尝试改变眼内压升高的程度。
然而，该方法的一个潜在缺点是，对高血压程度的控制较为有限，我们观察到约有5-10%的病例眼内压升高超过60 mmHg。眼内压过度升高可能对视网膜组织造成严重破坏，并使细胞死亡机制与生物学研究变得困难。然而，该方法可在视网膜和视神经中产生稳定的神经病理变化，且可通过药物进行干预12。这使得该模型在开发治疗青光眼的新疗法方面具有吸引力。此外，由于微珠被注入至虹膜角膜角，因此视轴保持通畅，便于对视网膜或视盘进行活体成像。我们预计该模型将被改进并应用于其他物种的后续研究中，包括小鼠。

原发性青光眼是一种严重的致盲性眼病，全球约有6050万人受其影响1，可导致显著的视力损害甚至失明2。对青光眼发病机制的研究以及新型治疗方法的开发，依赖于能够重现该疾病部分病理特征的优良疾病模型。
本文介绍一种基于 Samsel 等3 方法建立的大鼠青光眼模型。该技术的总体目标是通过将磁性微球注射至前房，并利用磁环将其引导至虹膜角膜角，从而升高眼内压（IOP）。此过程阻碍房水外流，导致眼内压升高，进而引起神经元损伤和细胞丢失。本方案旨在尝试提供一种更为简便、可诱导的青光眼模型。
该方案相较于现有技术可能具有一些优势。目前已有的遗传性小鼠模型（如DBA/2J）无需人为干预即可自发产生疾病，但其疾病进展的起始时间可能难以预测4。相比之下，可诱导模型的优势在于研究人员可自主控制疾病诱导的时机；这类模型大多依赖于通过手术方式升高啮齿类动物的眼内压（IOP）。然而，这些方法本身也可能存在某些局限性，例如技术操作难度较高5，且可能需要多次手术操作以维持眼内压的升高状态6。
相比之下，本文详细介绍的可诱导方法是一种简单、有效且可重复的技术，能够产生稳定而显著的压力升高，且几乎无需重复注射。此外，该方法不需要昂贵的设备，仅需基本的外科手术技能即可操作。本实验方案可能适用于希望在实验室中建立一种技术要求较低的可诱导性青光眼模型的读者。

<table><tbody><tr><td>250 - 300 g 的雌性Brown Norway退役繁殖大鼠</td><td>Harlan 英国</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Tonolab回弹式眼压计</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketaset）</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>BN1000118</td><td>37.5 mg/kg</td></tr><tr><td>右美托咪定盐酸盐（Domitor）</td><td>Orion Pharma</td><td>140-999</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>明氏生理盐水溶液</td><td>博士伦</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>环形磁体</td><td>超强磁铁</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>磁性微球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G 斜面针头</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>定制针头</td></tr><tr><td>鲁尔接头注射器</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan（盐酸阿替美唑）</td><td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>氯霉素软膏</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>TUNEL染色试剂盒</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

通过眼内注射磁性微球诱导实验性青光眼

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

深入了解青光眼的病理生理机制并开发新型治疗方法，依赖于良好的动物疾病模型。本文介绍一种通过向大鼠眼前房注射磁性微球来升高眼内压（IOP）的实验方案。利用磁性颗粒可使操作者将微球引导至虹膜角膜角，从而有效阻塞小梁网的房水流出通路。该方法可导致持久的眼内压升高，并最终引起神经节细胞层（GCL）的神经元死亡以及视神经病变，这与青光眼患者的临床表现一致。该技术操作简便，无需特殊设备、专业外科技能或长时间训练即可掌握。此外，眼压升高效果稳定，通常无需像其他使用塑料微球的模型那样重复注射。同时，我们认为该方法也适用于小鼠眼球的建模。

将磁珠注射至虹膜角膜角可稳定诱导眼压持续且显著升高（图1），在注射后第3天的首个时间点即可明显观察到。此外，眼压升高在整个实验期间持续维持；尽管本实验的时间进程止于注射后18天，但已有文献报道眼压升高可长期持续3。在整个实验过程中，对照组（未注射磁珠）眼的平均眼压为19.7 ± 0.3 mmHg，而注射磁珠眼的平均眼压为40.5 ± 2.8 mmHg（P &lt;0.001）。此外，峰值眼压从22.8 ± 0.3 mmHg升高至49.9 ± 2.3 mmHg。
为了确定眼压（IOP）升高是否导致视网膜神经节细胞死亡，我们对视网膜进行了TUNEL染色，并对横断面视神经切片进行了组织学分析（图2）。在视网膜中，我们观察到注射微珠并出现眼压升高的眼睛中TUNEL染色信号增加（图2A）。凋亡细胞核的数量大约增加了15倍，从对侧对照眼中1.6 ± 0.5个细胞增至高血压视网膜中的24.5 ± 0.5个细胞（图2B；P &lt;0.05）。此外，在注射了磁性微珠但眼压未升高的眼睛中（可能是由于虹膜角膜角未完全阻塞），TUNEL阳性细胞数量与未注射对照组相比无显著差异（P &gt;0.05）。这表明细胞死亡与眼压升高相关，而非磁性微球的直接毒性所致。最后，我们研究了青光眼模型中的视神经病理变化，观察到许多轴突中甲苯胺蓝的积聚，提示这些细胞突起发生了变性（图2C）。
<img alt="眼内压研究；注射眼与对照眼在注射后18天内的线图比较。" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 使用磁性微球升高眼内压。 将磁性微球注入前房后，与对侧未注射的对照眼相比，眼内压（IOP）显著且明显升高。Y轴单位 = 毫米汞柱（mmHg）。数据 = 均值 ± 标准误（SEM）。* = P &lt;0.001；N = 12。该图改编自 Foxton et al.，Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390。
<img alt="DAPI/TUNEL 染色、视网膜细胞凋亡检测、青光眼数据图表、显微镜分析。" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过将磁性微球注射至虹膜角膜角以升高眼内压（IOP），诱导视网膜神经节细胞层（GCL）中的神经元死亡。（A） 对照眼（左）和青光眼（右）视网膜的代表性图像，采用 TUNEL 法染色凋亡细胞核（绿色；白色箭头）以及 DAPI 复染（蓝色），显示随着 IOP 升高，凋亡细胞核数量增加。（B） GCL 中 TUNEL 阳性细胞的定量分析，表明与对照组（左）相比，IOP 升高的眼睛（中）具有显著更多的凋亡细胞。相反，在注射微球但眼压未升高的眼睛（右）中，未观察到 TUNEL 染色的显著增加。数据 = 均值 ± 标准误（SEM）。* = P &lt;0.05；N = 7 - 8。 （C） 视神经染色的代表性图像，显示青光眼组（右）受损轴突中亚甲基蓝（甲苯胺蓝）沉积增加（黑色箭头），而对照组眼睛（左）无此现象。比例尺 = 50 μm。本图经 Foxton et al., Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390 修改。

我们介绍一种通过将磁性微球注入大鼠眼内以诱导眼内压（IOP）升高的方法，用于模拟青光眼。该方法可引起显著的眼压升高，并导致广泛的神经元死亡。本方案操作简便，无需重复注射，且可产生稳定、持久的眼压升高。

深入了解青光眼的病理生理机制并开发新型治疗方法，依赖于良好的动物疾病模型。我们介绍……

本实验的目的是通过将磁性微球注入大鼠眼球前房，诱导眼内压升高。首先，将一个磁环放置在麻醉动物的眼球周围，洗涤磁性微球，将其重悬于溶液中，然后装入注射器。接着，将磁性微球注入眼球的前房。回收过程中移除磁环。通过组织学分析（如TUNEL染色或视神经染色）获得的过程数据可测量因眼内压升高导致的视网膜神经节细胞死亡。将灭菌的八微米磁性微球珠用一毫升Hank's平衡盐溶液重悬，并在10,000 × g条件下离心五分钟，重复洗涤三次。然后重新悬浮于0.5毫升HBSS中，制成30毫克/毫升的溶液。现在使用针对大鼠眼睛校准的回弹式眼压计，在清醒动物中采集五次基线眼压（IOP）测量值。麻醉后，将眼用软膏涂抹于未测眼的对侧眼，以保持其湿润。麻醉期间，将0.5%盐酸丙烷作为局部麻醉剂应用于手术眼。随后，用5%聚维酮碘水溶液冲洗该眼。五分钟后，擦去聚维酮碘，并用0.9%无菌生理盐水冲洗眼睛。麻醉期间需定期滴加无菌生理盐水以保持眼球湿润。现在将一个环形磁铁置于眼球周围，以尽量降低虹膜损伤的风险并减少微珠脱落。将针头与角膜表面呈切线方向，尽可能与虹膜平行。将25微升浓度为30毫克/毫升的γ射线辐照磁性微球注入前房。注射后保持针头原位1分钟，以确保微球沉降至虹膜角膜角（IOC角）处，从而阻塞小梁网的房水引流。在微球初步沉积后数秒，轻微调整针头角度，使少量房水渗出，以尽量减少眼内压的短暂升高。为确保针头在不同操作中可继续使用，需用 PBS 冲洗针头，随后用 70% 乙醇冲洗，最后在此阶段用蒸馏水冲洗。如有必要，移除磁铁并利用其将磁珠吸引至覆盖不完全的区域。注射后将磁铁继续放置在眼部周围10分钟，以确保微珠充分沉降到虹膜角膜角。使用0.25毫克/千克的ESOL盐酸盐逆转麻醉。给予0.5丙烷盐酸盐以镇痛，并局部使用氯霉素眼膏预防感染。将动物置于加热垫上直至恢复活动能力，然后转移至保温箱中。使用对侧眼作为未处理的对照。在注射微珠后每两到三天重复测量一次眼内压（IOP），之后也每两到三天测量一次。确定纳入研究的眼部标准，包括眼内压比对侧对照眼的压力升高超过5毫米汞柱，且眼内压不超过60毫米汞柱；若注射后一周内压力恢复至基线水平，则不应将该眼纳入研究。然而，若需要，可对未能产生高眼内压的眼再次注射微珠。将解剖得到的眼球和视神经用4%多聚甲醛固定，通过TUNEL染色评估视网膜神经元损伤，并通过甲苯蓝染色评估视神经损伤。本实验中，向虹膜角膜角注射磁珠可稳定诱导眼压持续显著升高，且在整个实验期间眼压升高状态得以维持。对照组未注射微珠眼在整个实验过程中的平均眼内压为19.7 ± 0.3 mmHg，注射微珠眼的平均眼内压为40.5 ± 2.8 mmHg。此外，眼内压峰值从22.8 ± 0.3 mmHg升高至49.9 ± 2.3 mmHg，以确定眼内压升高是否导致视网膜神经节细胞死亡。对视网膜进行TUNEL染色，并对视神经横切面进行组织学分析。我们观察到，在注射微珠并伴有眼压升高的眼睛中，TUNEL染色的隧道样结构增加。与对侧对照高血压视网膜相比，凋亡细胞核的数量大约增加了15倍；而在未施加压力情况下注射磁性微珠的眼睛中，TUNEL阳性细胞数量与未注射对照组相比无显著差异。对青光眼模型视神经病理的进一步研究表明，许多轴突中出现了甲苯胺蓝的积聚，提示这些细胞突起发生了退行性变。

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实验诱发青光眼通过磁性微球注射眼

本视频演示了通过向麻醉大鼠的巩膜上静脉注射高渗盐水以诱导青光眼的过程。盐水进入小梁网 通过...

一种通过高渗盐水注射诱导大鼠青光眼的技术

在本视频中，一只麻醉的大鼠接受眼部手术，通过在磁场作用下将磁性微珠注入前房，以阻塞虹膜角膜角。这种阻塞会妨碍小梁网，阻止房水排出，导致眼内压升高，进而损伤视网膜神经节细胞和视神经，从而形成类似青光眼的病理状态。...

通过小鼠模型虹膜角膜角阻塞诱导实验性青光眼

来源： Bosco, A., et al. 神经退行性疾病中视网膜小胶质细胞活化的体内动态：小鼠青光眼中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量. J. Vis. Exp. (2015)...

在青光眼小鼠模型中对视网膜小胶质细胞的活体成像

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。...

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本视频展示了一种利用临床3 T磁共振扫描仪对 naïve 小鼠视觉投射通路进行增强磁共振成像的方法，并可用于对急性视神经 crush 损伤及敲除小鼠（p50KO）中慢性视神经退行性变开展重复性和纵向的 in vivo...

体内小鼠视神经纤维完整性的对比增强MRI成像

本文介绍一种在小鼠眼球中诱导眼压升高的实验方案，该过程可导致视网膜神经节细胞丢失，类似于青光眼中所观察到的现象。将磁性微珠注射至前房，并利用磁铁将其吸引至虹膜角膜角，以阻塞房水的流出通道。...

一种利用磁性微珠阻塞模型诱导小鼠眼压依赖性青光眼的方法

青光眼的特征是视网膜神经节细胞受损。在动物模型中诱导青光眼可为研究该疾病提供重要线索。本文概述了一种在动物模型中诱导视网膜神经节细胞（RGCs）丢失的实验方法 体内 大鼠模型及用于分析的全层视网膜制备方法...

诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

通过在大鼠和小鼠中应用角膜缘环扎缝线诱导慢性眼压升高，导致视网膜神经节细胞出现与青光眼一致的功能性和结构性损伤。...

一种通过巩膜周缝合诱导大鼠和小鼠青光眼的模型

本文介绍了一种通过向小鼠眼内前房注射硅油以诱导眼压升高及青光眼性神经变性的实验方案，以及从前房中清除硅油从而使升高的眼内压恢复至正常水平的操作步骤。...

一种可逆的硅油诱导小鼠眼压升高模型

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。...

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

了解通过向大鼠眼前房注射磁性微球诱导高眼压的实验方法。该技术可建立稳定的青光眼模型，用于研究视网膜神经节细胞死亡及视神经退行性病变。

通过眼内注射磁性微球诱导实验性青光眼

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