三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

以下实验的总体目标是评估人神经干细胞系的分化微小RNA、表达谱分析及靶标mRNA验证。首先，通过在三维培养系统中培养人神经干细胞以诱导细胞分化；第二步，通过测量轴突突起的生长来定量分析分化程度。

接下来，通过微小RNA-PCR阵列评估微小RNA表达的变化。随后对筛选出的差异表达微小RNA进行计算分析，以鉴定一组潜在的靶mRNA。最终，通过报告质粒、转染及双荧光素酶检测对靶mRNA进行验证。

因此，本文所介绍的方法有助于解决神经干细胞领域中的一些关键问题，例如在人类神经干细胞发生分化时，对其表达的微小RNA（microRNA）及其靶向信使RNA（messenger RNA）进行表征。尽管该方法可为神经干细胞生物学研究提供深入见解，也可应用于其他干细胞体系，如间充质干细胞、诱导多能干细胞，或其他需要诱导分化并进行分子表征的体系。

该方法的可视化演示将分解人神经干细胞系分化过程中的关键步骤，并介绍 microRNA 表达谱的分析及靶 mRNA 验证。演示本实验部分步骤的将是来自我实验室的科学家 lavania。整个操作过程应在生物安全柜中采用无菌技术进行。通过向 AL VX 12 的每孔中加入液体，使支架材料重新水化。

使用灌溉用水配制的70%乙醇，每孔加入2毫升。加样时沿每孔壁加入70%乙醇，避免接触支架。小心吸除70%乙醇后，立即用D-M-E-M-F 12培养基每孔2毫升洗涤支架1分钟。

重复洗涤步骤两次，最后一次洗涤后小心吸除 D-M-E-M-F 12。通过向每个孔中加入两毫升溶于 D-M-E-M-F 12 的层粘连蛋白（laminin）来包被支架。将培养板置于 37°C、含 5% CO₂ 的湿化培养箱中孵育，时间不少于两小时。

接着，用温热的D-M-E-M-F12培养基洗涤孔板，每个支架中加入约500,000个人类神经干细胞（hNSCs），悬浮于150微升含生长因子的RMM培养基中。将孔板孵育3小时，使细胞沉降到支架内。3小时后，向每孔中加入3.5毫升RMM培养基，注意避免将细胞从支架上冲起。

将培养板孵育 7 天或 21 天。在第一天进行首次换液（即首次喂养），并在首次喂养后 2 至 3 天再次更换培养基。在 H nscs 三维培养后的第 7 天和第 21 天进行上述操作。

移除 RMM 培养基，并用 4% 多聚甲醛固定已分化的细胞。随后使用 βIII 微管蛋白一抗进行染色，该一抗通过荧光染料标记的二抗进行检测，细胞核则用 Hoechst 复染。

拍摄βIII微管蛋白染色细胞的代表性图像。使用荧光显微镜，将图像保存为TIFF或JPEG格式。使用Image Pro Plus 7软件的测量工具进行轴突突起生长的测量。

首先打开图像，选择工具栏中的测量选项，并选择轨迹功能。开始轨迹测量时，通过单击鼠标按钮在轴突生长末端选择起点，然后沿轴突生长的整个长度进行轨迹绘制，最后单击右键结束每条轨迹。以此方式，测量视野内所有轴突生长末端的长度，并将测量结果以像素或微米表示。

将长度测量数据导出至电子表格程序，用于样本间的比较和统计分析，以评估三维培养的造血干细胞（HSCs）中微小RNA（micro RNA）表达的变化。首先按照随附实验方案所述进行微小RNA提取及微小RNA cDNA制备。在获得微小RNA cDNA后立即进行后续实验。

在15毫升离心管中配制实时PCR的PCR组分混合液。加入1375微升的2× S-Y-B-R绿色预混液、100微升微小RNA（micro RNA）cDNA、275微升通用引物和1000微升无RNA酶的水。

将PCR组分加入PCR加样储液槽中。小心地从密封袋中取出96孔板PCR阵列。使用多通道移液器，加入25 µL的PCR组分。

向PCR阵列的每个孔中加入混合物。每次移液后更换移液器吸头，以避免孔间交叉污染。使用光学粘性封膜密封96孔板，并在室温下以1000 ×g离心1分钟，以去除气泡。目视检查孔板，确保各孔中无气泡存在。

实时荧光定量PCR仪中的96孔板PCR阵列程序。根据实时荧光定量PCR仪的结果，随后将所有孔的CT值导出至空白Excel电子表格，用于PCR阵列数据分析，采用在线可获取的算法PIC ktar来鉴定预测的microRNA靶标。

单击此处可查看脊椎动物 PIC KTAR 预测结果，将在新页面中打开 PIC KTAR 网络界面。在下拉菜单中选择物种，并在 micro RNA ID 输入框中插入感兴趣的 micro RNA。单击以搜索该 micro RNA 的靶基因。

将展示按 PIC KTAR 评分排序的靶标 mRNA 列表。所获得的排序结果将用于编制 microRNA 的比较表格。使用双荧光素酶报告质粒作为工具来验证靶标 mRNA，在转染 HeLa 细胞 24 小时后测定萤火虫和肾荧光素酶的活性。

将50微升底物一加入10毫升溶液一中，充分混合，配制成工作液一；从24孔板的每孔中移除细胞培养基，每孔加入300微升工作液一；将24孔板各孔中的100微升内容物转移至96孔板的三个孔中；孵育10分钟后，在设定为检测发光信号的光度计中测定荧光素酶活性。

通过加入50微升底物至2到10毫升溶液二中，充分混匀，配制工作液二。取100微升工作液二加入至已含有100微升工作液的96孔板各孔中。室温避光孵育10分钟，然后检测肾素荧光素酶活性。

随后，计算萤火虫荧光素酶与肾荧光素酶的发光强度比值。对3D支架上的hNSCs进行免疫化学染色后，获得具有代表性的显微照片：βIII微管蛋白（绿色）染色显示神经元结构，细胞核经鬼笔环肽复染呈蓝色。轴突突起的测量借助图像分析软件完成。比较在3D支架上与传统平面（2D）培养条件下生长的hNSCs的轴突突起生长情况表明，在培养1周或3周时，3D培养分化的hNSCs均表现出更显著的轴突突起生长。

靶基因预测的计算分析得出了此处列出的信息，包括预测的microRNA靶基因及其精确度评分和综合值。SOX5和NR4A3被鉴定为潜在的靶基因。如图所示，采用双荧光素酶报告基因检测法对microRNA的靶基因进行了验证。

在存在指定的 microRNA 时，SOX5 和 NR4A3 基因的人源 3' 非翻译区报告基因的相对荧光素酶活性显著降低。观看本视频后，您应能够充分理解如何对人神经干细胞进行分化，并研究 microRNA 的表达及其对靶标信使 RNA 的验证。