一个人类神经干细胞系的三维文化，微小RNA的分析和推测的靶基因分化
April 12th, 2015
为了表征分化的人神经干细胞 （hNSC） 上 miRNA 的变化，我们描述了三维系统上的 hNSC 分化，通过 miRNA PCR 阵列评估 microRNA 表达的变化，以及 miRNA 靶标预测的计算分析，并通过双荧光素酶测定进行验证。
以下实验的总体目标是评估人类神经干细胞系的分化 micro RNA、分析和靶标 Mr.NA 验证。这是通过首先在 3D 培养系统上培养人神经干细胞以诱导细胞分化来实现的。第二步是通过测量轴突过程生长来量化分化。
接下来，通过micro R-N-A-P-C-R阵列评估micro RNA表达的变化。然后对选定的差异表达 microRNA 进行计算分析，以鉴定一组推定的靶标 mRNA。最终，通过报告质粒、转染和双荧光素酶测定来验证靶标 mRNA。
因此，这里介绍的方法可以帮助回答神经干细胞领域的关键问题，例如表达的 microRNA 的表征，并且它们在人类神经干细胞分化时靶向信使 RNA。尽管这种方法可以提供对神经干细胞生物学的见解。它也可以应用于其他干细胞系统，如间充质干细胞、诱导多能干细胞或其他需要诱导分化和分子表征的系统。
该方法的视觉演示分解了人类神经干细胞系分化的关键步骤，以及 microRNA 分析和目标 mRNA 验证的研究，演示该程序的一部分将是我实验室的科学家 Lavania。整个过程应在生物安全柜中使用无菌技术进行。通过添加到 AL VX 12 的每个孔中来再水化支架。
将 2 毫升 70% 乙醇用水制备用于灌溉。通过将 70% 乙醇分配到每个支架的壁上，避免接触支架。小心吸出 70% 乙醇，并立即用每孔 2 毫升的 D-M-E-M-F 12 清洗支架 1 分钟。
重复洗涤程序两次，最后一次洗涤后小心吸出 D-M-E-M-F 12。通过向每个支架中加入 2 毫升 D-M-E-M-F 12 中的层粘连蛋白来包被支架。将板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳加湿培养箱中孵育至少两小时。
接下来，用温热的 D-M-E-M-F 12 种子洗涤板，每个支架含有大约 500， 000 个人神经干细胞或 H nscs，体积为 150 微升含有生长因子的 RMM 培养基。将板孵育 3 小时，让细胞在 3 小时后沉降到支架中。向每个孔中加入 3.5 毫升 RMM，注意不要将细胞从支架中移出。
将板孵育 7 或 21 天。第一次补料 1 天后更换 RMM 培养基，并在第一次补料后 2 至 3 天再次更换培养基。H nscs 的 3D 培养后 7 天和 21 天。
去除 RMM 培养基，用 4% 多聚甲醛固定分化的细胞。然后使用用荧光染料偶联物检测的 β 3 微管蛋白一抗对固定的细胞进行染色。二抗细胞核用钩状物复染。
捕获 β 3 微管蛋白染色细胞的代表性图像。使用荧光显微镜，以 TIFF 或 JPEG 格式保存图像。轴突生长的测量是使用 image PRO plus seven 软件测量工具完成的。
要开始打开图像，请在工具栏中选择测量选项，然后选择 trace feature（跟踪功能）。要开始追踪，请沿轴突生长的整个长度右键单击鼠标按钮轨迹以完成每条轨迹，从而选择轴突生长的起点。以这种方式测量视野内的所有轴突生长，将测量值表示为像素或微米。
将长度测量值导出到电子表格程序中，用于样品比较和统计分析，以评估三维培养的 HSC 的 micro RNA 表达的变化。首先，按照随附方案中的说明进行 micro RNA 提取和 micro RNA CD NA 制备。获得 micro RNA CD NA 后的文本。
在 15 mL 试管中制备用于实时 PCR 的 PCR 组分混合物。加入 1375 μL 双 X-S-Y-B-R 绿色预混液。100 微升微量 RNA CD NA、275 微升通用引物和 1000 微升 RNA，游离水转移。
PCR 组分混合到 PCR 上样储液槽中。小心地从密封袋中取出 96 孔板 PCR 阵列。使用多通道移液器，添加 25 μL PCR 组分。
混合至 PCR 阵列的每个孔中。在每个移液步骤后更换移液器吸头，以避免孔密封之间的交叉污染。将带有光学胶膜的 96 孔板在室温下以 1000 GS 离心 1 分钟以去除气泡，目视检查板以确保孔中不存在气泡。
realtime PCR仪程序中的 96 孔板 PCR 芯片。相应的实时循环器。随后，将所有孔的 CT 值导出到空白的 Excel 电子表格中用于 PCR 阵列数据分析，一种在线可用的 PIC ktar 算法用于识别预测的 micro RNA 靶标。
单击，单击此处获取脊椎动物的 pic ktar 预测，在 PIC KTAR Web 界面中打开一个新页面。在下拉菜单中选择物种，并在 micro RNA ID 框中插入目标的 micro RNA。单击搜索 micro RNA 的靶标。
将显示按 PIC KTAR 评分排序的靶 mRNA 列表。然后，将获得的排名用于编制 microRNA 的比较表。使用双荧光素酶报告基因质粒作为验证靶 mRNA 的工具，在转染 Hela 细胞后 24 小时测量萤火虫和肾荧光素酶活性。
通过加入 50 微升底物制备工作溶液 1，将 1 加入 10 毫升溶液 1 中，并充分混合，从 24 孔板的每个孔中去除细胞生长培养基，并向每个孔中加入 300 微升工作溶液 1。井转移每个孔中 100 微升的内容物。将 24 孔板到 96 孔板的 3 个孔等待 10 分钟，然后在用于发光采集的光度计中测量萤火虫荧光素酶活性。
通过加入 50 μL 底物、2 至 10 mLs 溶液 2 并充分混合来制备工作溶液 2。将 100 微升工作溶液 2 加入已经含有 100 微升工作溶液的 96 孔板的每个孔中。等待 10 分钟，然后测量肾脏荧光素酶活性。
随后，计算萤火虫荧光素酶与肾荧光素酶的发光比。在对 β 三微管蛋白进行免疫化学染色后，获得 H NSCS 在 3D 支架上的代表性显微照片，以绿色显示，带有钩状的细胞核复染以蓝色显示，在图像分析软件的帮助下测量轴突过程。用 3D 支架生长的 H nscs 与传统平面或 2D 培养物之间的轴突生长的比较表明，在一周或三周时，3D 分化的 HSCs 表现出更大的轴突生长。
靶标预测的计算分析得出了此处提供的信息：microRNA 列表、预测靶基因和精确率分数以及聚合值。SOX 5 和 NR 4 A 3 被鉴定为推定的靶基因。使用双荧光素酶报告基因测定来验证 microRNA 的靶标，如下所示。
在指示的 microRNA 存在下，SOX 5 和 NR 4 A 3 基因的人 3 个引物 UTR 报告基因的相对荧光素酶活性被显着敲低。看完这个视频，你应该对如何在神经干细胞中区分他，以及研究微 RNA 表达和靶标 Messenger.RNA 的验证有一个很好的了解。
概览
本研究通过使用三维培养系统来研究人类神经干细胞（hNSCs）的分化。它评估了microRNA表达的变化，并通过计算分析和双荧光素酶测定法来鉴定目标mRNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- MicroRNA研究
背景
- 人类神经干细胞（hNSCs）可以分化为各种神经细胞类型。
- MicroRNA在干细胞分化过程中的基因表达调控中起着至关重要的作用。
- 三维培养系统为研究细胞行为提供了一个更生理相关的环境。
- 了解microRNA谱可以增进对神经干细胞生物学的认识。
研究目的
- 表征hNSC分化过程中的microRNA变化。
- 验证与差异表达的microRNA相关的目标mRNA。
- 为其他干细胞系统提供适用的见解。
所用方法
- 在三维系统中培养hNSCs以诱导分化。
- 测量轴突过程外生以量化分化。
- 使用PCR芯片评估microRNA表达。
- 进行计算分析和双荧光素酶测定法以进行目标验证。
主要结果
- 在3D培养系统中观察到hNSCs的成功分化。
- 确定了microRNA表达的显著变化。
- 预测并验证了假定的目标mRNA。
- 该方法可以适用于其他干细胞类型。
结论
- 本研究为研究microRNA在干细胞分化中的作用提供了一个框架。
- 研究结果有助于理解神经干细胞生物学。
- 该方法可以在各种干细胞研究背景下使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neural stem cell therapies by linking microRNA expression changes to functional differentiation outcomes. It supports target validation and biomarker discovery in early discovery stages, improving predictive confidence for neuro-regenerative programs. The approach enhances translational continuity from in vitro modeling to preclinical assessment of stem cell potency and differentiation fidelity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by connecting miRNA dysregulation to putative target genes like SOX5 and NR4A3.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for functional target validation using dual luciferase assays in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports lead identification by identifying miRNA-mRNA regulatory networks that modulate stem cell differentiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative miRNA expression profiles via PCR arrays to enable screening-ready biomarker panels.
- Operational Value: Establishes reproducible axon process outgrowth as a functional readout for differentiation potency in 3D cultures.
- Scalability: Supports assay standardization across stem cell types through defined scaffold coating and seeding protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Identifies SOX5 and NR4A3 as putative targets of downregulated miRNAs, supporting biomarker qualification in neural differentiation.
- Preclinical Model Relevance: Uses a clinically relevant hNSC line (in trials for stroke disability) to enhance predictive confidence for CNS indications.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on miRNA target validation and differentiation fidelity in 3D microenvironments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical modeling by providing mechanistic insights into stem cell differentiation regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking miRNA expression changes to axon outgrowth and target gene modulation.
- Screening: Delivers assay-ready quantitative outputs (miRNA PCR arrays, axon morphometrics) for compound or condition screening.
- Analytics: Enables comparative statistical analysis of miRNA and phenotypic data to de-risk mechanistic assumptions.
- Translational Research: Connects in vitro differentiation to preclinical validity using a clinically tracked hNSC line and pathway-relevant targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for differentiation and molecular characterization across mesenchymal, iPSC, and other stem cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stem cell differentiation by validating miRNA-target interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized 3D culture, fixation, staining, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional readouts of differentiation potency and target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell candidates based on molecular and phenotypic validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, molecular biology, and luciferase-based reporter assays.
- Dependent on access to 3D scaffolds, laminin coating, fluorescence microscopy, and real-time PCR infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for miRNA extraction, PCR array handling, and dual luciferase normalization.
- Adaptation across model systems requires validation of differentiation markers and miRNA target conservation.
- Practical limitations include dependency on scaffold quality and transfection efficiency in reporter assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:00
Three Dimensional Culture of Human Neural Stem Cells Using 12-well Plates
5:04
Evaluation of Changes in miRNA Expression by miRNA PCR Array
6:51
Computational Analysis for miRNA Target Prediction
9:01
Results: Genes Targeted by miRNA are Identical from 3D Cultures of hNSCs
10:23
Conclusion
