Name: 该卵内鸡胚尿囊膜（CAM）含量为肝癌的有效异种移植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 了解利用鸡胚尿囊膜（CAM）建立肝细胞癌异种移植模型的方法。该技术可在免疫缺陷环境中培养三维血管化肿瘤，胚胎存活率高达93%，为肿瘤血管生成研究和药物筛选提供经济高效的活体模型。

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A.S. 部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家牙科与颅面研究所（5R03DE021741-02）和国家癌症研究所（1K08CA154963-01A1）资助的支持。&#160;
霍华德·休斯医学研究所通过HHMI医学研究学者项目为M.L.提供了资金支持。

1. 卵的孵化
<ol>
	<li>获取8日龄的无特定病原体的鸡胚蛋。</li>
	<li>将鸡胚蛋放入旋转蛋盘中，有标记的一端朝上，并将旋转蛋盘放入孵卵器内。在36 °C和50%湿度条件下孵育48小时&#160;。</li>
</ol>
2. 放下 CAM 并打开鸡蛋
<ol>
	<li>从培养箱中收集鸡蛋。将鸡蛋放入蛋架中，有标记的一面朝上，并移至超净工作台。</li>
	<li>关闭房间和超净台的照明灯。</li>
	<li>轻轻将鸡蛋有标记的一端贴在照蛋仪上，以观察绒毛尿囊膜（CAM）的血管系统以及气室。 
	注意：照蛋仪是一种光源，用于观察发育中的胚胎及其相关的气室和血管系统。</li>
	<li>在两条主要血管之间用铅笔做一标记。</li>
	<li>打开灯光，使用无菌图钉在气室上方的蛋尖（有标记的一端）打一个孔，再在铅笔标记处打另一个孔。图钉不要完全穿透蛋壳；通常打约 3 mm 深的孔即可。</li>
	<li>关闭灯光。挤压安全吸球，将其开口端紧压在气室上方的孔上，施加负压，使空气被吸入铅笔标记处的孔中，从而使该处的绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳分离。</li>
	<li>使用照蛋仪检查气室是否已从蛋的标记端移动至铅笔标记的孔处。若未移动，可用图钉将两个孔稍加深，然后再次使用安全吸球施加负压。</li>
	<li>打开灯光。一手握住鸡蛋，启动装有 15/16 英寸切割片的电动磨削工具，在蛋壳上做两条横向切割，深度仅需切穿蛋壳，但不可深至触及下陷的绒毛尿囊膜（CAM）。每条切口长约 2 cm，相距约 1 cm。切口宽度应足以让直径为 1 cm 的硅胶环通过，但窄于标准透明胶带的宽度。</li>
	<li>接着，用切割片轻轻接触蛋壳，在两条横向切口之间及其末端处做一条纵向切口。</li>
	<li>将无菌镊子滑入蛋壳碎片下方，并与蛋壳表面平行。用镊子夹住蛋壳碎片，完整地将其取出。</li>
	<li>用透明胶带覆盖新开的窗口，注意将一端折回自身，以便后续易于移除。</li>
	<li>将鸡蛋放回培养箱中的蛋托内（**不可**放入旋转蛋架），直至接种时使用。</li>
</ol>
3. 接种
<ol>
	<li>将基底膜蛋白混合物（如Matrigel）置于冰上（防止聚合），并放入生物安全柜中。</li>
	<li>使用2 mM EDTA消化细胞（每T75培养瓶4–5 ml），并将培养瓶置于组织培养孵箱中5分钟。</li>
	<li>将脱落的细胞重悬于培养基中，用血细胞计数板和台盼蓝进行计数。根据细胞系的不同，每例鸡胚尿囊膜（CAM）移植使用500,000至2,000,000个细胞。应在预实验中优化合适的细胞数量。</li>
	<li>计算所需细胞数量对应的体积，于500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于40 µl PBS++和20 µl基底膜蛋白混合物中。 
	注意：此时可根据实验需要，将药物或其他待测试剂加入细胞与基底膜混合物的悬液中进行处理。或者，也可在移植后将试剂滴加到细胞与基底膜混合物的悬液上。</li>
	<li>从孵箱中取出装有鸡胚的蛋架，放入超净工作台中。</li>
	<li>撕去窗口上的封口胶带，用灭菌镊子从冻存管盖中取出一个1 mm硅胶环，并通过窗口投入鸡胚上。</li>
	<li>用移液器将60 µl含PBS++和基底膜混合物的细胞悬液直接滴加到位于尿囊膜上的硅胶环中央。</li>
	<li>重新封好窗口胶带，并将蛋架放回孵箱。此时移动鸡胚需格外小心，以免硅胶环或细胞悬液发生移位。</li>
	<li>让肿瘤生长5至7天。</li>
</ol>
4. 收集肿瘤组织
<ol>
	<li>将垫巾置于超净台内。根据组织学需要准备35 × 10 mm培养皿和多聚甲醛容器。在每个35 × 10 mm培养皿中加入1 mL PBS++。</li>
	<li>在超净台内放置生物危害废弃物袋。取无菌解剖剪，将尖端从靠近标记端的孔插入鸡蛋内。</li>
	<li>沿鸡蛋全长纵向剪开。 
	注意：绒毛尿囊膜（CAM）及带环的肿瘤应附着在带有窗口的上半部分蛋壳上。</li>
	<li>使用解剖剪和镊子将肿瘤从绒毛尿囊膜（CAM）上分离，并将肿瘤放入35 × 10 mm培养皿中。测量并称重肿瘤。将固定后的肿瘤置于多聚甲醛中，随后进行石蜡包埋，用于组织学和免疫组织化学实验。</li>
</ol>
5. （可选）：肿瘤细胞解离
<ol>
	<li>使用解剖剪在35 × 10 mm培养皿中将肿瘤组织剪碎。将剪碎的肿瘤倒入15 ml离心管中，并用移液器尽可能去除PBS++。</li>
	<li>加入2 ml胶原酶（1 mg/ml，溶于PBS++中），将离心管反复翻转数次，于37 °C孵育至少30分钟（可长达数小时）。</li>
	<li>向每根试管中加入 5 ml 培养基，通过上下吹打 20 - 40 次充分重悬细胞。充分吹打对于实现完全的细胞解离至关重要。</li>
	<li>让沉淀静置沉降，将上清液转移至新离心管中。以500 × g离心5分钟。弃去上清液，保留解离的细胞沉淀。 
	注意：此时，细胞沉淀可用于多种实验（流式细胞术、裂解后用于蛋白质印迹、RNA 提取） 等等）。总肿瘤细胞数也可通过血细胞计数板和台盼蓝染色获得。注意，较小的椭圆形细胞为来自CAM的鸡细胞，不应计为肿瘤细胞。若将肿瘤从CAM上仔细分离，应仅有极少数量的非肿瘤（CAM）细胞污染。</li>
</ol>

<ol><li>Sangiovanni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+of+cirrhotic+patients+with+a+hepatocellular+carcinoma+detected+during+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.</a> Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).</li>
<li>Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review%3A+evidence-based+management+of+hepatocellular+carcinoma--an+updated+analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials.</a> Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent.</a> J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Dumartin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+mediates+early+events+in+pancreatic+adenocarcinoma+progression%2C+acting+on+tumor+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells.</a> Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).</li>
<li>Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%28MAPK%29+activity+as+a+determinant+of+tumor+growth+and+dormancy%3B+regulation+by+p38%28SAPK%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK).</a> Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).</li>
<li>Baroni, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomic+and+short+hairpin+RNA+gene+silencing+methods+to+explore+functional+gene+programs+associated+with+tumor+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest.</a> Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).</li>
<li>Lopez-Rivera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+drives+mTOR+pathway+activation+and+proliferation+of+human+melanoma+by+reversible+nitrosylation+of+TSC2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2.</a> Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+in+vivo+model+for+giant+cell+tumor+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone.</a> BMC Cancer. 11, 241(2011).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Res Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J Vis Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+quantitative+study+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental model for quantitative study of metastasis.</a> Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).</li>
<li>Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+do+not+arise+from+tumor-initiating+cells+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma.</a> BMC Cancer. 13, 485(2013).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+novel+immunomodulating+agent%2C+FTY720%2C+on+tumor+growth+and+angiogenesis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+coordinates+interaction+of+pericytes+and+endothelial+cells+during+vasculogenesis+and+experimental+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis.</a> Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).</li>
</ol>

A.S.&#160;获得Advaxis制药公司的资助，用于支持一项研究者发起的临床试验。&#160;&#160;

本方案中有几个关键步骤最有可能解释胚胎存活率的提高以及肿瘤生长可靠性的增加。通过吸取气室使绒毛尿囊膜（CAM）脱离蛋壳的方法，相较于其他现有方法（如使用针头从蛋中移除蛋白、钝性分离等）更具微创性。使用无菌图钉创建本方法所需的两个小孔是该方案中最具挑战性的部分。施力过大可能导致图钉过度穿透，从而损伤CAM及其血管系统，甚至可能导致蛋壳开裂或蛋体破坏。通过在未受精的市售鸡蛋上实际练习使用图钉打孔，可显著减少首次操作CAM下拉时的失误。此外，使用乙醇或其他消毒溶液清洁蛋壳会降低胚胎活力，应避免使用。最后，在接种后使用无菌硅胶环将肿瘤细胞“圈定”于特定位置，有助于促进肿瘤生长，并有助于实现本方案中观察到的高肿瘤成瘤率。
在使用不同细胞系和/或药物时，该实验方案中关键步骤的某些部分很可能需要进行优化。建议接种细胞数量为50万至200万个，但某些细胞系可能需要更高或更低的接种密度，以形成良好且具有三维结构的肿瘤。接种细胞过少可能导致成瘤效果不佳；而接种过多则可能导致肿瘤过度生长，使肿瘤完全占据硅胶环，变得扁平，三维结构特征减弱，甚至可能突破环的边界。我们建议通过预实验确定特定细胞系的最佳接种密...

肝细胞癌（HCC）是第3位rd 全球癌症死亡的主要原因1目前，仅有30%的肝细胞癌患者符合潜在根治性手术治疗的条件2，且全身化疗无效3因此，迫切需要开发新型肝细胞癌（HCC）治疗方法，并建立适合高效筛选新药的模型系统。鸡胚尿囊膜（CAM）实验是一种可重复、成本低、速度快的中等通量检测潜在抗肿瘤药物的方法。 体内.
CAM 检测已被广泛用于研究血管生成4。该方法还已成功发展为多种癌症的肿瘤异种移植模型，包括胶质母细胞瘤5、胰腺癌6、黑色素瘤7-9和骨肉瘤10-11。in ovo12 和ex ovo13 技术均已在文献中得到应用，不同实验方案之间存在细节差异。CAM 异种移植模型面临的一个主要挑战是在对鸡蛋进行操作后，胚胎死亡率相对较高，已有报道的鸡胚死亡率范围为 25% 至 50%11-14。
在本文中，我们描述了一种新型方法的开发过程 在卵内 一种可稳定生成三维、血管化肿瘤的肝细胞癌异种移植模型，其组织学特征与未分化肝细胞癌相似。我们采用的方案最初由 Ossowski 报道 等.14 并实现了高达93%的鸡胚存活率，且肿瘤移植成功率极高。

<table><tbody><tr><td>优质孵化用鸡蛋</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>鸡蛋孵化箱</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>旋转式蛋托</td><td>GQF</td><td>1611 Automatic Egg Turner</td><td></td></tr><tr><td>验蛋灯</td><td>Lyon</td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>配备15/16切割轮的Dremel 100旋转工具</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子、图钉、解剖剪、透明胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>带外部螺纹和硅胶垫圈的冷冻管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌来源的胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo 鸡胚尿囊绒毛膜（cam）实验作为肝细胞癌高效异种移植模型

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）在受精后第7天开始发育，至第12天趋于成熟。CAM天然缺乏免疫功能且高度血管化，是进行肿瘤移植的理想体系。此外，CAM含有纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、整合素α(v)β3以及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）等细胞外基质蛋白，使其成为研究肿瘤侵袭与转移的有利模型。长期以来，科研人员利用CAM的生理特性，将其作为血管生成研究的模型。近年来，CAM实验已被改良并用于 体内 用于多种癌症的异种移植模型系统，弥合了基础研究与临床应用之间的鸿沟 体外 工作以及更复杂的动物癌症模型。CAM 检测可在生物学相关性强、兼具成本与时间效益的系统中研究肿瘤生长、抗肿瘤治疗及促肿瘤分子通路。本文中，我们描述了肝细胞癌（HCC）的 CAM 异种移植模型的建立，其胚胎存活率高达 93%，且肿瘤成瘤率可靠，可形成三维、带血管化的肿瘤。

本方案中关键步骤的代表性图片如下所示。图1A展示了使用照蛋灯观察发育中的胚胎、气室以及绒毛尿囊膜（CAM）血管系统的方法。图1B-1C显示了通过打两个孔并使用安全吸球施加负压使绒毛尿囊膜下陷的操作过程，图1D显示了一个成功下陷的绒毛尿囊膜，铅笔标记的孔下方出现一个较大的气泡。图1E和图1F展示了使用Dremel旋转工具在气泡上方的蛋壳上进行必要切割，以及打开蛋壳窗口后暴露出内部血管化的绒毛尿囊膜的情况。
利用人肝细胞癌细胞系 HUH7（图 2A-2B）和 PLC/PRF/5（图 2C-2D）成功培养出三维、具有血管化的肿瘤。由 HUH7 和 PLC/PRF/5 细胞生长形成的肿瘤在组织学上类似于未分化肝细胞癌（图 2E-2F），同时也类似于在小鼠异种移植模型中生长的 HUH7 和 PLC/PRF/5 肿瘤...

鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）缺乏免疫功能且高度血管化，使其成为肿瘤生长和血管生成的天然体内模型。在本方案中，我们描述了一种利用CAM实验培养三维、血管化肝细胞癌（HCC）肿瘤的可靠方法。

In Ovo 鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）实验作为肝细胞癌高效异种移植模型

鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）在受精后第7天开始发育，至第12天趋于成熟。CAM具有天然的免疫缺陷特性，并且……

本实验的总体目标是建立一种可靠的肝细胞癌鸡胚尿囊绒毛膜（cam）异种移植模型。首先将鸡蛋孵育以准备接种，作为第一步；第二步则是降下鸡胚的尿囊绒毛膜（cam），并在蛋壳上切开一个窗口。接下来，通过蛋壳窗口将人肝细胞癌细胞接种到鸡胚中，以建立肿瘤生长模型。结果显示，利用人肝细胞癌细胞系成功培养出了三维血管化肿瘤。采用该方案，鸡胚存活率最高可达93%。与小鼠肿瘤模型等其他体内技术相比，CAM 检测的主要优势在于实验周期短、整体实验成本低且易于操作。CAM 检测可用于研究血管生成、肿瘤、细胞侵袭和转移过程，也可用于确定小分子和药物对肿瘤生长和发育的影响。本实验操作的可视化演示非常重要，因为制备鸡胚的过程中包含多个关键步骤，例如透光检查、识别血管系统、在气室附近以及蛋壳顶部打小孔但不使内容物流出、切割窗口时避免蛋壳破裂，以及确保在整个操作过程中摄像装置保持完好，这些对于初次操作者而言可能具有挑战性。开始操作时，请放置。将8日龄的无特定病原体的本地鸡胚蛋放入可旋转的蛋盘中，确保 stamped 端朝上。将可旋转蛋盘置于36摄氏度、50%湿度的孵卵器内，孵育48小时。孵育结束后，将鸡蛋转移至蛋架中，保持 stamped 端朝上，并将其放入层流罩内。关闭房间和通风橱的灯光，将已标记的一端轻轻接触蛋透视仪，以观察鸡胚尿囊绒毛膜（简称 CAM）的血管系统以及气室。用铅笔在两条主要血管之间做一标记。接下来，在气室上方、已标记一端的蛋尖处打一个孔，再在铅笔标记处打第二个孔。使用无菌的图钉，孔的深度应约为三毫米。将安全吸球中的空气挤出，然后将吸球的开口端紧压在气囊上方的孔口处。缓慢释放吸球，以产生负压，使空气被吸入铅笔标记处的孔中，从而导致镜片从壳体上脱落。使用照蛋器确认气室已从蛋的 stamped 端移动至铅笔标记的孔洞处。若未移动，需将两个孔略微钻深，并用安全吸头重新施加吸力。接着，用手握住蛋，另一只手使用装有 1516 英寸切割轮附件的旋转工具操作。在不接触凸轮的情况下，通过蛋壳进行两次横向切割，切口长度为两厘米，间隔一厘米。然后在两条横向切口的末端，轻轻将切割轮接触蛋壳，进行纵向切割。用无菌镊子从下方与壳片平行插入以去除壳片。用镊子夹住壳片并将其干净地移除。将一段胶带的一端折向自身，然后将胶带贴在蛋的开口处。将鸡蛋放入蛋托中，并将蛋托置于孵化箱内，接种前不旋转放置，时间不超过两到三小时。为准备接种，将基底膜蛋白混合物（如Matrigel）置于冰上，以防止其发生聚合。接着，每瓶使用四到五毫升的2毫摩尔EDTA溶液来解离肿瘤细胞，并将培养瓶置于组织培养孵化箱中孵育五分钟。重悬脱离的细胞于培养基中，并计数细胞数量。根据细胞系的不同，取500,000至200万个细胞用于移植到鸡胚尿囊膜上。接着，将含有所需细胞数量的悬液转移至新离心管中，离心五分钟。在500 × g离心力下，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于40 µL含有钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS plus plus）以及20 µL基底膜基质混合物中。此时，可将药物或其他待测试剂加入细胞悬液中。接下来，将蛋盘放入超净工作台中。撕下蛋壳上的胶带，通过开口将一个无菌的1毫米硅胶环从冷冻管中落入气室。将60微升细胞、PBS++和基底膜混合液加入硅胶环中央，重新封好窗口，然后小心地将蛋盘移回培养箱中。让肿瘤生长五到七天，以收获肿瘤。在生物安全柜中放置吸水垫和生物危害袋。准备直径35毫米、高10毫米的培养皿，每皿中加入1毫升PBS加加液，并根据组织学需要准备好含对甲醛的容器。将无菌解剖剪的尖端插入标记端附近的小孔中，沿整个卵的长度剪开。CAM膜及带环的肿瘤应附着在壳的上半部分并随其开口而暴露。使用解剖剪和镊子从鸡胚尿囊膜上剥离肿瘤，并将肿瘤置于一个 35 毫米 × 10 毫米的培养皿中。测量并称重肿瘤。将肿瘤用多聚甲醛固定，经醛类处理后进行石蜡包埋，用于组织学和免疫组织化学实验。收获肿瘤后，用解剖剪在培养皿中将肿瘤组织剪碎。然后将剪碎的肿瘤倒入15毫升离心管中，用移液器吸除PBS++。加入2毫升含有1毫克/毫升胶原酶的PBS++溶液，通过反复倒置离心管数次进行混匀。将试管在37摄氏度下孵育至少30分钟，最长可达数小时。接着，向试管中加入5毫升培养基，通过移液20至40次充分混匀。此步骤对于完全解离细胞至关重要。待沉淀物沉降后，将上清液转移至新离心管中，在500 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，保留解离的细胞沉淀。当将HUH-7肿瘤细胞接种于鸡胚尿囊膜（CAM）时，可在环形区域内部观察到具有血管化的肿瘤。经过五天生长后，CAM实验中HUH-7肿瘤的组织学结果显示，该肿瘤细胞类似于未分化的肝细胞癌细胞。使用该方法时，必须注意针对不同细胞或不同药物可能需要进行特定优化。例如，某些细胞系可能需要更高或更低的密度才能形成三维肿瘤。

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科研

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Medicine

医学

该<em&gt;卵内</em&gt;鸡胚尿囊膜（CAM）含量为肝癌的有效异种移植模型

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神经周围侵袭是头颈部鳞状细胞癌及其他肿瘤的一种侵袭性表型。鸡胚尿囊绒毛膜模型已被用于研究血管生成、癌症侵袭及转移。本文展示了如何利用该模型在体内评估神经周围侵袭。...

鸡胚尿囊绒毛膜 体内 模型用于评估头颈部肿瘤中的神经周围浸润

转移性透明细胞肾细胞癌是一种尚无全面动物模型用于深入临床前研究的疾病。本方案介绍了该疾病的两种新型动物模型：原位移植小鼠模型和鸡绒毛尿囊膜模型，这两种模型均能表现出类似临床病例的肺转移。...

比较在小鼠肾脏和鸡绒毛尿囊膜上建立的转移性透明细胞肾细胞癌模型

我们提出鸡胚尿囊绒毛膜模型作为一种可移植的体内替代模型，用于移植妇科和泌尿系统癌细胞系及患者来源的肿瘤。...

利用鸡绒毛尿囊膜体内模型研究妇科和泌尿系统癌症

本方案描述了三种获取和使用5至8日龄鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为体内模型的方法 用于研究增强超声成像及微泡介导药物递送的模型。...

鸡胚尿囊外胚胎及绒毛尿囊膜血管的制备作为增强超声成像与微泡介导药物递送研究的活体模型

本文介绍了一种建立人卵巢组织鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）异种移植模型的实验方案，并验证了该技术的有效性、移植物血管重建的时间进程以及在6天移植期内组织的存活能力。...

利用鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型研究卵巢组织移植

了解利用鸡胚尿囊膜（CAM）建立肝细胞癌异种移植模型的方法。该技术可在免疫缺陷环境中培养三维血管化肿瘤，胚胎存活率高达93%，为肿瘤血管生成研究和药物筛选提供经济高效的活体模型。

In Ovo 鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）实验作为肝细胞癌高效异种移植模型

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