种植 Heligmosomoides Polygyrus：免疫调节线虫寄生虫及其分泌产物

该程序的总体目标是收集和分析长寿的 helmuth 寄生虫分泌的分子，这些寄生虫下调宿主的免疫反应，从而允许寄生虫存活。这是通过首先在寄生虫的自然栖息地（小鼠的肠道）中培养寄生虫来实现的。第二步是在安乐死后从小鼠中分离出成熟的寄生虫。

接下来，将 helmuth 寄生虫在组织培养物中培养，中胚层爆发至三周，在此期间它们会释放大量的排泄物、分泌物或 ES 分子。最后一步是从培养上清液中回收并浓缩释放的分子，并将其浓缩成 ES 批次，用于生物和生化检测。最终，浓缩的上清液可以在体外直接在特定细胞类型上进行测试，以研究免疫细胞功能的变化，或施用给小鼠以测试它们抑制过敏和其他疾病的能力。

当我们注意到免疫抑制与活寄生虫感染有关时，我们第一次想到了这种方法，这表明活寄生虫主动和持续释放免疫抑制分子。虽然这种方法可以提供对寄生虫感染的见解，但我们发现抑制免疫的分子可能对治疗西方世界的关键疾病非常有效，例如过敏性自身免疫和炎症性肠病。这种方法的视觉演示至关重要，因为恢复和处理 helmuth 寄生虫的步骤非常专业，需要特别注意无菌培养技术。

8 周龄的 F1 小鼠将通过口服强饲法感染 H polyus 幼虫，以终生产生 H polyus。如随附方案中所述，以每毫升蒸馏水 2000 的浓度制备 H polyus L 三种幼虫。每次感染前给每只小鼠 400 L 3 次，每次 200 μL。

A 通过使用带有专用管饲针的 1 毫升注射器将其倒置 5 次来教育幼虫悬浮液，圆端吸出 200 微升幼虫悬浮液。要进行口服灌胃，请用脖子的脖子将鼠标固定在直立位置，然后轻轻地将钝性灌胃针穿过口腔和食道进入胃部。成虫和寄生虫卵将从小鼠身上回收。

感染后 14 天，感染后 14 天。使用如此处所示制备的改良 bayamon 装置从小鼠中收集成年 h 多叶蠕虫。要开始此过程，请用 70% 乙醇清洗安乐死动物的腹部。

切开腹部的皮肤并向后拉，露出前腹壁。做一个中线切口以进入腹膜腔。从十二指肠近端到远端直肠切除整个小肠和大肠。

将其放入干燥的培养皿中。沿切除含有结肠的粪便的整个长度拉直肠道，然后将其放入单独的培养皿中，以便稍后回收鸡蛋。接下来，确定包含成虫的小肠近端 20 厘米。

它的特点是十二指肠壁相对较厚，并且由于腔内蠕虫而经常呈红色。切除这部分小肠，并将其放入装有 5 毫升 Hank 溶液的石油培养皿中。使用圆头剪刀加热至 37 摄氏度。

纵向打开充满蠕虫的近端肠道部分，并用两张载玻片刮下肠道内壁的内侧。要去除蠕虫，请丢弃干净的肠壁。使用 Hank 的解决方案构建漏斗。

装订一个小平纹细布袋，然后将两个培养皿中的蠕虫倒入其中。将两个平纹细布袋放在每个玻璃漏斗上，并用回形针将袋子固定在漏斗边缘。将设备置于 37 摄氏度的培养箱中 1 到 2 小时。

孵育进行到一半时，轻轻摇动装置，以去除肠道制剂中可能堵塞平纹细布过滤器的碎屑。注意避免碎屑溢出到平纹细布袋外，因为这会在最终的 HES 制备过程中造成污染。在孵育结束时，使用塑料移液管小心地将收集试管从水槽上的连接橡胶软管上拆下，将蠕虫转移到 50 毫升的试管中，让蠕虫在重力作用下沉降。

用 stripette 去除介质。加入 40 毫升 Hank's 溶液，让蠕虫沉淀 重复 5 次，总共洗涤 6 次。避免混浊培养物的污染对于该方案的成功至关重要。

从那时起，蠕虫培养物必须保持无菌。移至 laina 流动通风橱，用无菌 Hank 溶液再洗涤蠕虫培养物 6 次，使用移液管补充抗生素，并收集两个 20 微升的样品，用于计算回收的成虫。预计大约 50% 的接种幼虫将在感染第 14 天收集卵，以用镊子从先前切除的结肠中刮出粪便。

接下来，将粪便与颗粒状木炭以至少一比一的比例混合。为了达到一致性，只需将 dam 浸湿到足以填充纸张即可。在培养皿中的一张湿滤纸的中心涂抹一层薄薄的一层，然后将其放入潮湿的避光盒中，使其保持黑暗 12 至 14 天。

从第 7 天开始，开始收集 L 3 幼虫 a 幼虫。在滤纸边缘形成一个环。将滤纸从培养皿中取出，使用移液管（每板 5 毫升无菌水）冲洗留在培养皿上的幼虫。

将幼虫转移到 50 毫升试管中。将滤纸放回培养皿中，并在黑暗中每周更换一次重复收集幼虫，最多持续一个月。然后按照方案文本中的说明清洗收集的幼虫，并在 4 摄氏度下储存在蒸馏水中。

要开始此过程，请将蠕虫浸泡在大约 10 毫升的悬浮溶液中，补充 10% 庆大霉素 20 分钟，让试管以一定角度放置，以确保 20 分钟后完全覆盖蠕虫。用 Hank 溶液洗涤蠕虫六次，补充抗生素，将 Eloqua 蠕虫放入通气的 T 25 培养瓶中。将培养瓶直立置于 37 摄氏度的培养箱中三周，这是蠕虫排泄分泌产物或 HES 的制备物。

含有培养物的 HES。从培养物中收集培养基，间隔每周不超过两次，每次用等体积的 h polyus 培养基代替。将每个收集物分开保存，并清楚地标明日期和批号，因为 LPS 和宿主蛋白污染的可能性更大。

培养 24 小时后的第一次采集应放在一边，单独处理或丢弃含有 400 倍 G 培养基的离心 HES 5 分钟。然后用 50 毫升注射器吸出培养基，并通过 0.2 微米低蛋白结合过滤器进入 50 毫升试管中。随后，在氮气压力下，将混合的 HES Supena 浓缩在超滤装置中的 3000 分子量截止过滤器上，首先设置过滤装置，在搅拌的同时在一升烧杯中清洗 3 公斤的道尔顿膜闪亮面。

按照制造商的说明组装超滤装置，将滤膜闪亮的一面朝上放在 4 摄氏度的橱柜中，并在开始浓缩倒入的 HES 之前加入 50 毫升蒸馏水。请非常小心，不要让过滤器干涸。根据需要将每管 HES 添加到过滤装置中，直到体积浓缩至 2 至 5 毫升，以去除组织培养基的氨基酸和其他成分。

从 HES 制剂中，向过滤装置中加入 50 毫升不含焦磷酸的 PBS，然后浓缩至约 2 毫升。重复此步骤两次。使用总共 150 毫升的 PBS，将 ES 转移到注射器中，并使用 0.2 微米过滤器进行过滤消毒。

测量蛋白质浓度后，等分试样标记批号和日期，并在零下 80 摄氏度下冷冻。400 L 三只幼虫的口服强饲法用于维持 F1 小鼠的 H poly gyus 生命周期。由此产生的成虫负担如下所示。

各批次的 HES 已被证明在功能测定和蛋白质组成方面具有可重复的功效。此外，当分析来自每个连续培养周的上清液时，发现蛋白质谱在总共 4 周内非常相似。当通过 Bradford 测定法测量 TS 浓度时，总蛋白通常约为 1 毫克/毫升。

显示了来自大约 500 毫升培养物上清液的 11 个不同批次的 HES 蛋白的产量。当通过角膜缘 AAMI CYTE 测定法测量 41 批 HES 中的 LPS 污染水平时，避免污染在收集 HES 时至关重要。发现大多数批次的 HES 明显低于推荐的污染阈值。

在执行此程序时，重要的是要记住在建立培养物时保持谨慎的无菌技术。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成 遵循此程序。可以进行其他方法，如蛋白质组学、蛋白质分离以及聚糖脂质和 microRNA 的分析，以充分了解这些寄生虫释放的分子产物的光谱。

看完这个视频，你应该对如何繁殖 poly limus 有了很好的了解。Moid 是多体的，从培养的成虫中收集 DS 产品，以测试它们对免疫系统的影响。虽然这种寄生虫对人类无效，但重要的是要遵循安全预防措施并遵守指定的方案，以确保 Hess 批次之间的可重复性。